4.3. Peptidkötés, polipeptidek, fehérjék

4.3.1. A polipeptidlánc alaptulajdonságai

Amint arról már szó esett, a fehérjék egymással összekapcsolt aminosavak lineáris polimerjei. A fehérjékben az aminosav csoportokat peptidkötések kötik össze. Az elnevezés Emil Fischer nevéhez fűződik. Emil Fischer mutatta ki azt, hogy megfelelő kémiai módszerrel aminosavakból lineáris polimerek, polipeptidek jöhetnek létre, amelyek fehérjeszerű tulajdonságokat mutatnak. Egy rendkívül ötletes kísérletében azt is bebizonyította, hogy ezek a mesterségesen létrehozott polipeptidek fehérjebontó enzimekkel kezelve ugyanúgy aminosavakra bonthatók, mint maguk a természetes fehérjék. Az enzimek nagyfokú szelektivitására alapozva ebből az eredményből arra következtetett, hogy a fehérjékben is ugyanolyan kémiai kötések vannak az aminosav csoportok között, mint az általa létrehozott polipeptidekben.

Ha pusztán a végtermékeket tekintjük, akkor a polipeptidek aminosavakból való létrejötte illetve aminosavakra történő bomlása az alábbi kémiai egyenletekkel írható le (lásd 4.15. ábra).

4.15. ábra: A peptidkötés bomlása hidrolízissel, illetve kialakulása kondenzációval

4.15. ábra: A peptidkötés bomlása hidrolízissel, illetve kialakulása kondenzációval

A polipeptid felbomlása hidrolízissel megy végbe, vagyis peptidkötésenként egy vízmolekula „lép be” a hasadó molekulába. Ez a folyamat exergonikus, tehát negatív szabadentalpia változással jár, és ennek köszönhetően spontán végbemegy. A folyamat ugyanakkor rendkívül lassú (katalizátor nélkül a felezési idő több év!). Ennek az az oka, hogy a reakció egy magas szabadentalpiájú köztes állapoton keresztül zajlik, vagyis a reakciónak magas az aktivációs szabadentalpiája. A kémiai átalakulások sebességének termodinamikai leírásával a 9. fejezet foglalkozik.

A spontán végbemenő hidrolízis folyamatához képest fordított folyamat, a vízkilépéssel történő kondenzáció, a polipeptidlánc szintézise természetesen nem mehet végbe spontán. Ez a folyamat pozitív szabadentalpia változással járna, vagyis endergonikus. Amint azt később részletesen látni fogjuk a transzláció fejezetben, az élő szervezetben a fehérjék egy ATP-igényes folyamatban, kapcsolt reakciókon keresztül keletkeznek. A kapcsolt reakciókban az aminosavak aktivált, nagy szabadentalpia szintű vegyületek részeiként jelennek meg. A folyamatot kísérő ATP-AMP átalakulás miatt a kapcsolt reakciók együttesen már exergonikusak.

A fehérjék kémiai értelemben aminosavakból felépülő lineáris (el nem ágazó) polimerek (lásd 4.16. ábra).

4.16. ábra: A polipeptidnek irányultsága van, a főlánc monoton szerkezetű, a változatosságot az oldalláncok sorrendje jelenti

4.16. ábra: A polipeptidnek irányultsága van, a főlánc monoton szerkezetű, a változatosságot az oldalláncok sorrendje jelenti

Mivel az aminosavak nem szimmetrikus molekulák, ezért a belőlük létrejövő polipeptidláncnak irányultsága van. A láncnak van egy aminocsoportot tartalmazó vége (amino-láncvég, N-terminális) és egy karboxil csoportot tartalmazó vége (karboxil-láncvég, C-terminális).

A polipeptidláncban szereplő egységeket aminosav maradékoknak hívjuk, hiszen nem a teljes aminosavak, hanem a vízkilépés utáni „maradékok” (residue) épülnek össze a láncban. Az aminosav maradékokat peptidkötések kötik össze. A peptidkötés szerkezetével a következő alfejezet foglalkozik.

A polipeptidláncban az eredeti aminosavak oldalláncai változatlan formában jelen vannak, ezek lesznek a polipeptid oldalláncai. Az oldalláncokon kívüli részt főláncnak (vagy peptidgerincnek) hívjuk.

A polipeptid váza, vagyis a főlánca tehát (a prolin csoportokat leszámítva) egy azonos, ismétlődő egységekből felépülő, homogén struktúra. Az aminosav egységenkénti változatosságot a láncban egymást követő oldalláncok sorrendje jelenti. Az egyes peptidek savas, ill. bázikus jellegét, oldhatóságát, kémiai reakciókban való viselkedését döntően a bennük lévő oldalláncok kémiai jellege határozza meg. A 4.17. ábra egy tetrapeptid, azaz négy aminosavból álló peptid szerkezetét mutatjuk be.

4.17. ábra: A peptidek kémiai karakterét az oldalláncok dominálják

4.17. ábra: A peptidek kémiai karakterét az oldalláncok dominálják

4.3.2. Fehérjeszerkezeti szintek: primer (elsődleges) szerkezet

A polipeptidek bevezetésekor magától értetődően megjelenik az aminosavsorrend fogalma. Emiatt célszerű már most megemlíteni a biokémia által definiált fehérjeszerkezeti szinteket. Négy szerkezeti szintet különítünk el.

Az elsődleges (primer) szerkezet nem más, mint a fehérje aminosavsorrendje, más néven szekvenciája.

Mint már láttuk, a polipeptidláncnak van egy főlánc része. A peptidgerincen lévő peptidkötések N-H és C=O csoportjai hidrogénhíd kötés kialakítására képes funkciós csoportok. Ismert néhány olyan szabályos főlánc-konformáció, amelyben az említett csoportok egymással hidrogénhidakat alakítanak ki. Ezek a szabályos konformációk képviselik a fehérjék másodlagos (szekunder) szerkezeti szintjét.

A harmadik fehérjeszerkezeti szint, tehát a harmadlagos (tercier) szerkezet nem más, mint a polipeptidlánc térbeli, háromdimenziós szerkezete (konformáció). A háromdimenziós szerkezetet akkor tekinthetjük ismertnek, ha egy háromdimenziós koordinátarendszerben elhelyezve meg tudjuk adni egy polipeptidlánc összes atomjának mindhárom térkoordinátáját.

A negyedleges (kvaterner) szerkezet a több alegységből álló fehérjék miatt került bevezetésre. A negyedleges szerkezet ismerete feltételezi az összes alegység harmadlagos szerkezetének ismeretét. Ennél a szerkezeti szintnél azt jellemezzük, hogy az egyes alegységek a többi alegységhez képest miként helyezkednek el a térben.

4.3.3. A fehérjék mérettartománya

A legtöbb fehérje kb. 50 – 2000 aminosav-maradékból áll. Egy aminosav maradék átlagosan 110 Da, a fehérjék zöme tehát 5.500-200.000 Da (5,5-200 kDa) közötti molekulatömegű. Egy átlagos méretű fehérje 300-400 aminosavból áll (~40 kDa). A 4.2. táblázatban szereplő táblázat néhány tipikus példát mutat be arra, hogy a fehérjék méret és összetétel szempontjából milyen változatosságot mutatnak. A táblázat egyre növekvő méret szerinti felsorolásban mutatja be a tipikus példákat.

4.2. táblázat: Néhány fehérje molekulatömege és alegység-összetétele

4.2. táblázat: Néhány fehérje molekulatömege és alegység-összetétele

Ennek a táblázatnak a tanulságai részleteiben csak a későbbi fejezetek ismereteinek fényében lesznek majd világosak. Néhány tanulságot azonban az érdekesség kedvéért előre megemlítünk.

A citokróm-c, a ribonukleáz-A vagy a lizozim mind kisméretű enzimek. Ezek egy olyan mérettartományban vannak, amelynél lényegesen kisebb méretben valószínűleg nem jöhet létre hatékony enzim. Kisebb méretű fehérjék tehát ismertek, de enzimfehérjék nem. Az enzimek mind gömbszerű, globuláris fehérjék, amelyeknek rendelkezniük kell egy vagy több szubsztrátkötő hellyel, és valamilyen, a kémiai katalízisben főszereppel bíró központi résszel, aktív centrummal. A mai ismeretek szerint az enzimkatalízis szempontjából elengedhetetlen, hogy a katalizáló enzim stabil térszerkezettel rendelkezzen. A jelek szerint a megfelelő stabilitású, és egyben a szükséges funkcionális részeket is tartalmazó struktúra létrehozásához valamivel több, mint 100 aminosav egység szükséges.

A kimotripszinogén és a kimotripszin összehasonlítása is tanulságos. A kimotripszin egy fehérjebontó enzim, amit a hasnyálmirigy termel. A mirigyben inaktív formában (zimogén) termelődik, amelynek a neve kimotripszinogén. Ez egyetlen polipeptidláncból áll. A kimotripszinogénben a szubsztrát megkötéséért felelős részlet nincs megfelelő térszerkezetben. A bélbe ürülő kimotripszinogént a szintén a hasnyálmirigy által termelt tripszin nevű fehérjebontó enzim aktiválja úgy, hogy a kimotripszinogénben egyes meghatározott peptidkötéseket elhidrolizál. Ennek eredményeképpen egy négy aminosav csoporttal kisebb, immár három, diszulfidhidakkal összekötött polipeptidláncból álló, aktív szubsztrátkötő apparátussal rendelkező forma, a kimotripszin alakul ki.

A hemoglobin is több polipeptidláncból áll, de ennek hátterében egészen más jelenség áll. A hemoglobin egy valódi több alegységes fehérje. Kétféle polipeptidláncból (alegységből) épül fel, mindkét típusból kettőt találunk a működő fehérjében. A hemoglobinnál mintegy másfélszer nagyobb szérumalbumin egyetlen polipeptidláncból áll, amely egyetlen gömbszerű (globuláris), önálló feltekeredésre képes részből, más szóval doménből áll. A táblázat alján a szérumalbuminnál jóval nagyobb méretű fehérjéket találunk. Ezek hatalmas mérete azonban nem azt jelenti, hogy ezek szerkezete szintén egyetlen, de egyre nagyobb, gömbszerű doménen alapulna. A domének mérete viszonylag szűk tartományon belül van, a hidrofób hatás miatt kialakuló apoláros mag mérete ugyanis nem lehet akármekkora.

A nagy méretek mögött rendszerint két fő ok áll. A fehérje állhat például nagyjából átlagos méretű alegységekből, de ezek száma akár igen nagy is lehet, lásd a hexokináz, RNS-polimeráz, glutamin-szintetáz „sorozatot”. Egy másik lehetséges ok az, hogy ugyan a fehérje egyetlen polipeptidláncból (egyetlen alegységből) áll, de nagyon nagyszámú, önálló feltekeredésre képes, globuláris szerkezeti egység, tehát domén építi fel. Erre példa a hatalmas méretű, egyetlen láncból álló titin fehérje, ami a harántcsíkolt izom passzív rugalmasságát biztosítja. A titin fehérjében 244 domén van, amelyeket szerkezetnélküli szakaszok kötnek össze. A harántcsíkolt izom működési egységén, a szarkoméren belül egy-egy titin fehérje átíveli a szarkomer egység hosszának felét. A fehérje egyik vége a Z-vonalhoz (szarkomer széléhez), míg a másik vége az M-vonalhoz (szarkomer közepéhez) kötődik. Az izom nyúlásakor a szarkomer hossza növekszik. Ennek során a titin molekula úgy tud nyúlni, hogy a benne lévő domének sorra letekerednek. Az izom összehúzódásakor a szarkomerek rövidülnek, ekkor az említett domének újra feltekerednek.

4.3.4. Egyszerű és összetett fehérjék

A fehérjék zöme pusztán a már megismert 20-féle aminosavból épül fel. Ezeket egyszerű fehérjéknek is nevezik. Vannak azonban összetett fehérjék is, amelyek a polipeptidlánc(ok) mellett egyéb, nem fehérje természetű csoportokat is tartalmaznak (lásd 4.3. táblázat).

Amennyiben az utóbbiak kovalens módon kötődnek a fehérjéhez, fehérje-konjugátumról beszélünk. Az összetett fehérjék közé tartoznak a glikoproteinek és lipoproteinek is, amelyekben cukor illetve lipid természetű csoportokat kapcsolódnak kovalensen az oldalláncokhoz. A nem fehérje természetű komponenst

kofaktornak hívjuk. A kofaktorok rendkívül sokfélék lehetnek (szerves molekulák, ionok, esetenként fématomok) és szerepük is nagyon sokféle lehet. Az enzimek katalitikus folyamataiban résztvevő vagy azt segítő kofaktorok neve koenzim, illetve erős (kovalens) kötődés esetén prosztetikus csoport. Az utóbbiak zöme vitamin természetű (például a B1-vitamin származéka, a tiamin-pirofoszfát, amely többek között a piruvát-dehidrogenáz enzimkomplex egyik koenzime).

4.3. táblázat: Az összetett fehérjék típusai

4.3. táblázat: Az összetett fehérjék típusai

4.3.5. A peptidkötés szerkezete és tulajdonságai

Térjünk vissza a peptidkötésre, ugyanis amint azt látni fogjuk, ennek szerkezeti tulajdonságai döntő mértékben befolyásolják a fehérjék másodlagos, és ezen keresztül harmadlagos szerkezetét.

Kristályosított peptidek röntgenszórási adatait elemezve Linus Pauling és Robert Corey az 1930-as években arra jutott, hogy a peptidkötésben szereplő szénatom és nitrogénatom távolsága 1,32 Angström. Ez a távolság kisebb, mint egy tipikus egyszeres C-N kötés távolsága (1,49 Angström), de nagyobb, mint egy tipikus C=N kettőskötés távolsága (1,27 Angström). Ez arra utalt, hogy valami módon a C-N kötés „részlegesen kettőskötés természetű”.

Pauling és Corey azt is megállapították, hogy a peptidkötés planáris szerkezetű: a benne szereplő OCNH atomok, valamint a N- és C-atomhoz kapcsolódó 1-1 Cα-atom, tehát mindösszesen 6 atom egy síkban van.

Világossá vált, hogy a peptidkötés elektronszerkezete nem írható fel valósághűen úgy, hogy a kötésben lévő atomok között kizárólag egyszeres és kettőskötéseket feltételezünk. A valós elektronszerkezet egyfajta köztes állapotot jelent két határszerkezet között, ahogyan azt a 4.18. ábra mutatja. Az egyik határszerkezetben (4.18. ábra baloldalán) a szénatom és az oxigénatom között kettőskötés van, míg a szénatom és a nitrogénatom között egyszeres kötés van, és egyik atom sem hordoz nettó töltést.

4.18. ábra: A peptidkötés delokalizált elektronszerkezete és a két határszerkezet

4.18. ábra: A peptidkötés delokalizált elektronszerkezete és a két határszerkezet

A másik határszerkezetben (4.18. ábra jobboldalán) a szénatom és az oxigénatom között egyszeres, az szénatom és a nitrogénatom között kettőskötés van, az oxigénatom ekkor egyszeresen negatívan, míg a nitrogénatom egyszeresen pozitívan töltött.

A valós szerkezet (4.18. ábra közepén) a két hipotetikus határszerkezet kombinációja, melyben a szénatom és az oxigénatom, valamint a szénatom és a nitrogénatom között részleges kettőskötés van, az oxigénatom részleges negatív töltés, a nitrogénatom pedig részleges pozitív töltés hordoz.

A két határszerkezet a valóságban tehát nem létezik, a valós szerkezet nem oszcillál a két határszerkezet között. A valós szerkezet egyetlen stabil szerkezetet jelent, amelyben ötvöződnek a két hipotetikus határszerkezet egyes tulajdonságai. A delokalizált elektronszerkezet két π-pálya formájában jön létre (lásd 4.19. ábra).

4.19. ábra: A peptidkötés delokalizált elektronszerkezete

4.19. ábra: A peptidkötés delokalizált elektronszerkezete

Mivel ezek miatt a szénatom és a nitrogénatom között nem egyszeres kovalens kötés van, ezért a szén és a nitrogénatomot összekötő vonal, mint tengely körül nem tud szabadon elfordulni egymáshoz képest a molekula két része. Pauling és Corey következtetésének mindenben megfelelő módon a peptidkötésben résztvevő, illetve azt szegélyező összesen 6 atom egy síkban van.

A 4.20. ábra peptidkötés transz konfigurációban van, a C=O és az N-H csoportok a C-N kötés által meghatározott egyenes két átellenes oldalán vannak, ahogyan azt a 4.20. ábra részletesebben is szemlélteti, bemutatva az egy síkba kerülő hat atom tekintetében a kötéshosszakat és a kötésszögeket is.

4.20. ábra: A delokalizált szerkezetű peptidkötésre jellemző kötésszöge és kötéshosszak

4.20. ábra: A delokalizált szerkezetű peptidkötésre jellemző kötésszöge és kötéshosszak

Az említett 6 atom úgy is egy síkban lehet, ha a peptidkötés cisz konfigurációjú. Ezt a 4.21. ábra illusztrálja.

A cisz konfigurációban a peptidkötés két oldalán lévő Cα atomokhoz kapcsolódó oldalláncok azonban olyan közelségbe kerülnek, hogy a közöttük fellépő rövidtávú taszítás miatt ez a konfigurációs állapot energetikailag rendkívül kedvezőtlen, a transz konfigurációhoz képest magasabb szabadentalpia szintet jelent. Emiatt az ismert fehérjeszerkezetekben – hacsak nem X-Pro peptidkötésről van szó-, a cisz konfiguráció csak pár ezrelékben fordul elő. Emlékezzünk vissza: a termodinamikai alapismeretekben leírtak szerint az egymással egyensúlyban lévő állapotok előfordulási arányait a köztük lévő szabadentalpia különbség határozza meg.

Az X-Pro peptidkötések esetében azonban, ahogyan azt a 4.21. ábra alsó része illusztrálja, mind a transz, mind a cisz konfiguráció esetében túl közel kerülnek egymáshoz bizonyos molekularészletek. Emiatt a két állapot közötti szabadentalpia szint különbsége kisebb. A transz/cisz megoszlás az X-Pro kötések esetében ~ 95% / 5% megoszlást eredményez.

4.21. ábra: A peptidkötés cisz és transz konfigurációjú állapota általános esetben, illetve a prolin esetében

4.21. ábra: A peptidkötés cisz és transz konfigurációjú állapota általános esetben, illetve a prolin esetében

4.3.6. A fehérje főlánc (peptidgerinc) konformációjának geometriai jellemzése

A fehérje peptidgerincén rendre N-Cα-C-N kötések követik egymást. A főlánc konformációja egyértelműen megadható az említett kötések mentén létrejövő szög-elfordulásokkal azaz torziós szögekkel. Ahogyan azt az imént elemeztük, a C-N kötés körüli elfordulással a peptidkötés planaritása miatt valójában nem kell foglalkoznunk. A főlánc konformációjának megadásához tehát elegendő az N-Cα kötések körüli, Φ, illetve a Cα-C kötések körüliΨ torziós szögek ismerete, ahogyan azt a 4.22. ábra is mutatja.

4.22. ábra: A főlánc konformációja egyértelműen megadható az N-Cαkötések körüliΦ, illetve a Cα-C kötések körüliΨtorziós szögekkel

4.22. ábra: A főlánc konformációja egyértelműen megadható az N-Cα kötések körüli Φ, illetve a Cα-C kötések körüli Ψ torziós szögekkel

Annak érdekében, hogy egyértelmű legyen a Φ, Ψ szögek jelentése, a 4.23. ábra segítségével részletesen is bemutatjuk a torziós szögek definícióját.

A torziós szöget négy, egymást a molekulán belül sorban követő, atom vonatkozásában definiáljuk. A 2. és 3. atom közötti kötés körüli elfordulás mértékét adjuk meg. A torziós szög az mutatja meg, hogy a 2., 3. és 4. atom által definiált sík hány fokkal van elfordulva az 1., 2. és 3. atom által definiált síkhoz képest. Ha ez az elfordulás az óramutató járásával megegyező, akkor a szöget pozitív előjelűnek, ha az óramutató járásával ellentétes, akkor negatív előjelűnek tekintjük, így az összesen 360 fokot egy 0 és plusz 180 fok, valamint egy 0 és mínusz 180 fok tartományra bontjuk. A 0 fok esetén az 1. és a 4. atom átfedő pozícióban van. A + 180 és a – 180 fok azonos állapotot jelent, amikor az 1. és a 4. atom éppen ellentétes irányban állnak.

Visszatérve a fehérje főlánc esetére: az N-terminálistól a C-terminális felé haladva a Φ szöget rendre a C-N-Cα-C vonatkozásában, míg a Ψ szöget az N-Cα-C-N vonatkozásában definiáljuk. Látható, hogy az N-terminálison lévő első aminosav csoport esetében Φ szöget nem lehet értelmezni, míg a C-terminális csoport esetében Ψ szöget nem lehet értelmezni, hiszen az utolsó C-atomot nem követi N-atom.

4.23. ábra: A torziós szögek bevezetésének elve, és az elv alkalmazása a polipeptidláncra

4.23. ábra: A torziós szögek bevezetésének elve, és az elv alkalmazása a polipeptidláncra

Egy „N” tagszámú peptid főláncának konformációja tehát 2N-2, azaz 2(N-1) torziós szöggel jellemezhető. Fontos kiemelni, hogy ez a leírás az oldalláncok konformációjával nem foglalkozik!

A fentiek figyelembevételével tehát a peptidgerinc lokális konformációja minden láncközi aminosav csoport esetében megadható egyetlen Φ / Ψ szögpárral.

Ennek rendkívül szemléletes grafikus bemutatására szolgál az 1963-ban bevezetett Ramachandran-diagram, amit a 4.24. ábra illusztrál.

A Ramachandran diagram vízszintes tengelyén a Φ, függőleges tengelyén pedig a Ψ szöget ábrázoljuk, mindkét esetben a már ismertetett -180 és 180 fokok közötti tartományban. Ezáltal egy négyzetet kapunk, amelyben minden egyes ponthoz egyetlen Φ / Ψ szögpár tartozik.

A 4.24. ábra azt mutatja be, hogy amennyiben a polipeptidláncban alaninok követik egymást, mely szögpárok valósulhatnak meg. A sötétzöld tartományt olyan szögpárok alkotják, amelyek esetén nincs funkciós csoportok közötti ütközés. Ezek a termodinamikailag legkedvezőbb főlánc konformációkat reprezentálják. Az egyre halványabb zöld színek a termodinamikailag egyre kevésbé kedvező, de még megvalósuló konformációs állapotokat mutatják. A szürke területre olyan szögpárok esnek, amelyek esetében egyes funkciós csoportok átfedése olyan nagymértékű lenne, hogy a rövidtávú taszítás miatt az adott állapot nem jöhet létre. Vegyük észre, hogy az elméletben rendelkezésre álló szögpároknak a valóságban csak egy kis hányada valósulhat meg.

Ha a polipeptidben alanin helyett a legkisebb oldalláncú glicin szerepel, úgy a megengedett tartomány nagyobb, ha az alaninnál nagyobb oldalláncú aminosavak szerepelnek, akkor pedig kisebb.

4.24. ábra: TorziósΦ/Ψszögpárok ábrázolása a Ramachandran diagramon

4.24. ábra: Torziós Φ / Ψ szögpárok ábrázolása a Ramachandran diagramon

A 4.25. ábrán példaként vizsgáljuk meg, hogy a diagram közepét reprezentáló 0/0 szögpár a valóságban miért nem valósulhat meg. Az ábra világosan mutatja, hogy a Φ = 0 / Ψ szögpár azért nem valósulhat meg, mert az adott aminosav csoport előtti aminosav egység karbonil oxigénje ütközne az adott aminosav csoportot követő aminosav egység N-H csoportjával.

4.25. ábra: A 0/0Φ/Ψszögpárhoz tartozó konformáció sztérikus ütközés miatt nem valósulhat meg

4.25. ábra: A 0/0 Φ / Ψ szögpárhoz tartozó konformáció sztérikus ütközés miatt nem valósulhat meg