4.4. Fehérjeszerkezeti szintek: másodlagos szerkezet

A Ramachandram diagram egy-egy megengedett Φ / Ψ szögpárával jellemzett konformációjának aminosav-egységenkénti ismétlésével szabályos, repetitív, szerkezetek jöhetnek létre. Ezek a potenciális szabályos szerkezetek azonban csak akkor jönnek valójában létre, ha azokat valami stabilizálja.

A létező repetitív szerkezetekben a megfelelő Φ/Ψ szögpárok ismétlődése a peptidgerincen belüli funkciós csoportokat olyan orientációba hozza, hogy azok között szerkezetstabilizáló hidrogénhídak jönnek létre. Az így kialakuló szabályosas ismétlődő főlánc Φ/Ψ szögpárok jelentik a fehérjék másodlagos szerkezetét.

A legelterjedtebb másodlagos szerkezet típusok az α-hélix, a β-redő, a különböző hajtűkanyarok, valamint a kollagén hélix (lásd 4.5.3. fejezet; ez utóbbit konformációja nagyon hasonlít a jegyzetben nem tárgyalt poliprolin-II hélixhez).

A 4.26. ábra mutatja, hogy melyik az a két szögpár, amelynek ismétlődésével a két leggyakoribb stabil másodlagos szerkezeti elem, az α-hélix, a β-redő jön létre.

4.26. ábra: A két energetikailag legkedvezőbbΦ/Ψpár ismétlődésével jön létre azα-hélix és aβ-redő

4.26. ábra: A két energetikailag legkedvezőbb Φ / Ψ pár ismétlődésével jön létre az α-hélix és a β-redő

Mielőtt részletesebben megismerkednénk ezekkel a szerkezeti típusokkal, vizsgáljuk meg, miként írhatók le általánosságban, és hogyan jellemezhetők a szabályos szerkezetek. Ezt a 4.27. ábra mutatja be.

4.27. ábra: Az elméleti szabályos szerkezetek néhány alapadattal megadhatók

4.27. ábra: Az elméleti szabályos szerkezetek néhány alapadattal megadhatók

A Φ / Ψ szögpárok ismétlésével a peptidgerinc térben spirális formába rendeződik. A monomer egységekből álló lánc alkotta spirált alapvetően három adattal lehet jellemezni: milyen irányba tekeredik a spirál, egy teljes fordulatra hány monomer egység jut (jelölése n), és egy monomer egységre mekkora menetemelkedés jut (jelölése h, mértékegysége nm vagy Å). A két utóbbi szorzatából származtatott nh = p megmutatja, hogy egy teljes körfordulat megtétele mekkora emelkedéssel jár. Az „n” nem kell, hogy egész szám legyen. Közmegegyezésre jobbmenetes spirál esetében az „n” pozitív, balmenetesnél „n” negatív.

Ahogyan azt a 4.27. ábra is illusztrálja, amennyiben nincs menetemelkedés (p = 0), akkor a lánc gyűrűbe zárul. Amennyiben p > 0, úgy egy spirált, a biokémia nyelvén hélixet kapunk.

Nézzük meg mikor jobbmenetes, és mikor balmenetes a hélix. Pozícionáljuk a hélixet úgy, hogy a tengelye éppen felénk nézzen. Ezek után a hélix felénk eső végéről elindulva nézzük meg, hogy miközben a hélixen haladva távolodunk, milyen irányban kerüljük meg a hélix tengelyét. Ha óramutató járásával egyezően, akkor a hélix jobbmenetes, ha óramutató járásával ellentétesen, akkor balmenetes.

Ezek után nézzük meg, melyek a leggyakoribb olyan valós szabályos másodlagos szerkezetek, amelyeket főláncon belüli stabilizáló kölcsönhatások stabilizálnak.

4.4.1. A másodlagos szerkezetek kísérletes igazolása

Amint azt a peptidkötés szerkezetének ismertetésekor már említettünk, az 1930-as években már sikerrel alkalmazták a röntgendiffrakciót kisméretű, kristályosítható szerves molekulák térszerkezetének vizsgálatára. A röntgendiffrakcióról részletesebben a globuláris fehérjék térszerkezetét tárgyaló 5.1. fejezetben írunk. A molekulák kristályszerkezetben mutatott szabályos elrendeződése elengedhetetlen feltétele volt a szabályos röntgenszóródási mintázat létrejöttének.

A fehérjék kristályosítása valójában már az 1800-as évek közepén elkezdődött. Az első fehérjekristályt Friedrich Hünefeld, a hemoglobin felfedezője írta le. Mivel a kémia területén a kristályosítás a homogén formában történő izolálás egyik fontos eljárása volt, a fehérjéket is elsősorban ilyen okok miatt kezdték el kristályosítani. Az első enzimkristályt James Sumner állította elő 1926-ban, amikor még nem volt nyilvánvaló, hogy az enzimek fehérjék. A kristályosítással ezt sikerült bizonyítani.

Fehérjekristályok tehát már rendelkezésre álltak, de az ilyen kristályok röntgenszórási képe túl komplexnek bizonyult az értelmezésükhöz. A kristályosított fehérjék mind globuláris fehérjék voltak, amelyek térszerkezete meglehetősen komplex. Ugyanakkor ebben az időszakban már elkezdődött a biológiai eredetű rostok röntgendiffrakciós vizsgálata is. Az ilyen rostokat a globuláris fehérjéknél egyszerűbb felépítésű molekulák alkották, és bár ezek elrendeződése a rostban nem olyan szabályos, mint egy valódi kristályban, de elegendően szabályosnak bizonyult ahhoz, hogy jellegzetes röntgenszórási mintázatokat eredményezzen.

Tipikus példák voltak ebben az időszakban a textilipar által ösztönzött kutatások, amelyek során például a pamutból (lásd a poliszacharid, cellulóz), a selyemből (lásd a fibroin fehérje) vagy a gyapjúból (lásd a keratin fehérje) származó rostok szerkezetét igyekeztek feltárni.

A selyem vizsgálatának első eredményeit japán kutatók, Nishikawa és Ono szolgáltatták 1913-ban, akik megállapították, hogy a selyemszál rendezett szerkezetet mutat. Az első szisztematikus fehérjeszerkezeti vizsgálat William Astbury nevéhez fűződik, aki az 1930-as években, a gyapjúban és az emberi hajban is megtalálható keratin fehérje szerkezetét, illetve a fő kötőszöveti fehérje, a kollagén szerkezetét vizsgálta.

Ezek után ismerkedjünk meg három tipikus másodlagos szerkezeti típussal.

4.4.2. A jobbmenetes α-hélix szerkezet

A jobbmenetes α-hélix az elsőként felismert másodlagos szerkezeti elem, amelyet Linus Pauling és Robert Corey írt le 1951-ben. Ez egyben a leggyakoribb másodlagos szerkezeti elem. Jellemző adatai a következők: n=3,6; h=1,5 Å tehát p = hn = 5,4 Å. Egy fordulatra tehát átlagosan 3,6 aminosav csoport jut, csoportonként a hélix emelkedése csoportonként 1,5 Å, míg teljes fordulatonként 5,4 Å. Az ehhez a szerkezethez tartozó ideális torziós szögpár: Φ=-57º, Ψ=-47º.

Az α-hélix szerkezetben H-hidak jönnek létre a hélixben szereplő aminosav csoportok karbonil-oxigénje (mint akceptor) és a szekvenciában 4 csoporttal távolabb eső aminosav maradék N-H csoportja (mint donor) között, tehát egy n(C=O) / n+4(N-H) mintázat szerint. Ezt a 4.28. ábra illusztrálja.

Jól látható, hogy a szerkezet egyetlen rövid, folytonos láncszakaszon belül alakul ki. A kölcsönhatásban első megközelítésben az oldalláncok nem vesznek rész, hiszen ezek a hélix tengelyére nagyjából merőlegesen kifelé mutatnak. Ez jól látszik a 4.28. ábra golyó-pálcika modelljén is, amelynél a hélix tengelye felénk mutat. Az ilyen ábrázolás azonban annyiban félrevezető, hogy a valóságban a hélix belsejében nincs üreg, a térkitöltés tökéletes. Ezt a térkitöltéses modell jól illusztrálja.º

4.28. ábra: Az α-hélix szerkezete többféle ábrázolásban, és a szerkezetet stabilizáló hidrogénhidak

4.28. ábra: Az α-hélix szerkezete többféle ábrázolásban, és a szerkezetet stabilizáló hidrogénhidak

A H-hidat képző atomok közötti a szekvenciában egymást követő atomok száma: 13, ezért az α-hélix egy másik egyezményes elnevezése: (3,613-hélix). Ezt mutatja a 4.29. ábra).

4.29. ábra: Az α-hélixben H-hidak jönnek létre az aminosav csoportok karbonil-oxigénje és a szekvenciában 4 csoporttal távolabb eső aminosav maradék N-H csoportja között

4.29. ábra: Az α-hélixben H-hidak jönnek létre az aminosav csoportok karbonil-oxigénje és a szekvenciában 4 csoporttal távolabb eső aminosav maradék N-H csoportja között

Az ismert fehérje térszerkezetek alapján az α-hélixek átlagos hossza ~12 aminosavnyi (18 Å).

A peptidkötés saját dipólus momentuma miatt az azonos irányban álló peptidkötések a hélixnek eredő dipólus momentumot kölcsönöznek (lásd 4.30. ábra).

Az amino-terminális végnél savas, a karboxil-terminális végen bázikus aminosavak stabilizálhatják a dipólust. A H-hidak elrendeződésének logikája miatt az α-hélixben lévő első 4 aminosav egység peptidil N-H csoportja, illetve az utolsó 4 aminosav egység C=O csoportja számára nincs gerinc eredetű hidrogénhíd partner. Ezt kompenzálandó, az eddig megismert fehérjeszerkezetekben gyakran találhatók a α-hélixek két végét szegélyező olyan szekvenciák, amelyek oldalláncai képesek hidrogénhíd kötéseket létesíteni az említett peptidilcsoportokkal. Erre a szerkezeti megoldásra a hélix sapka (capping) elnevezés terjedt el.

4.30. ábra: peptidkötések saját dipólus momentum a hélixnek eredő dipólus momentumot kölcsönöz

4.30. ábra: peptidkötések saját dipólus momentum a hélixnek eredő dipólus momentumot kölcsönöz

4.4.3. A β-lemez szerkezet

A β-lemez szerkezetet β-láncok hozzák létre a láncok közötti hidrogénhíd kötések révén. A β-láncban a főlánc teljesen nyújtott szerkezetű.

A szerkezetre jellemző alapadatok a következők: n = 2; h = 3,4 Å. Ebben az esetben tehát két aminosav csoport jut egy teljes kör megtételére, ami miatt a „spirál” valójában egy teljesen nyújtott, lapos szalag.

Vegyük észre, hogy itt az egy egységre jutó menetemelkedés több mint kétszeresen meghaladja az α-hélixre jellemző értéket. A β-láncok egymáshoz képest kétféle elrendeződésben alkothatnak lemezeket, ahogyan azt a 4.31. ábra mutatja. A láncok elrendeződése lehet antiparallel és parallel.

Az antiparallel esetre a jellemző torziós szögpár: Φ= –139º, Ψ= +135º, míg a parallel esetre:

Φ= –119º, Ψ= +113º.

Mint látható, a β-lemezt nem feltétlenül olyan lánc részletek alkotják, amelyek a szekvenciában egymáshoz közel esnek. Az egyes láncok egymástól távol is lehetnek a primer szerkezetben. A 4.31. ábra azt is mutatja, hogy egyetlen lemezen belül lehetnek parallel és antiparallel elrendeződésű β-láncok is. Az oldalláncok a láncon haladva felváltva a lemez síkja fölé és alá nyúlnak. A hidrogénhidak a parallel láncok között kevésbé egyenesek (a donor-hidrogén-akceptor atomok kevésbé esnek egy vonalba, kissé jobbra csavarodnak), de a láncon egyenletesen elosztva helyezkednek el.

Az antiparallel láncoknál a H-hidak egyenesebbek, de kevésbé egyenletesen oszlanak el a szerkezetben.

A kialakuló β-lemez lehet tisztán parallel, antiparallel, vagy vegyes. Az ismert fehérjeszerkezetek alapján a β-lemezek rendszerint 2-12 láncból állnak, míg a β-láncokat átlagosan 5-12 aminosav maradék alkotja.

4.31. ábra: Aβ-lemezben az egymás melletti láncok lehetnek parallel és antiparallel lefutásúak

4.31. ábra: A β-lemezben az egymás melletti láncok lehetnek parallel és antiparallel lefutásúak

Ahogyan azt a 4.32. ábra és 4.33. ábra mutatják, a β-lemezek síkja, legyen szó akár parallel, akár antiparallel (vagy vegyes) lemezről, paravánszerűen hajtogatott (redőzött). Az egymás mellé rendeződő szálakban az egymás mellé kerülő aminosav egységek oldalláncai azonos irányba mutatnak, és így a síknak mindig azonos oldalára kerülnek. A szekvenciában egymást követő oldalláncok, a szekvenciában haladva rendre hol a sík egyik oldalán, hol a sík másik oldalán helyezkednek el.

4.32. ábra: A parallel aβ-lemezek térszerkezete

4.32. ábra: A parallel a β-lemezek térszerkezete

4.33. ábra: Az antiparallel aβ-lemezek térszerkezete

4.33. ábra: Az antiparallel a β-lemezek térszerkezete

4.4.4. β-kanyarok

A hélixek és β-láncok egyirányba haladó szerkezetek. A globuláris fehérjékben ezekből a szerkezetekből vissza kell kanyarodni ahhoz, hogy egy gömbszerű háromdimenziós szerkezet jöjjön létre. A visszakanyarodás történhet nagyon rövid szakasz igénybevételével, hajtűszerűen. Ennek a megoldásnak a szabályos szerkezeti elemei a β-kanyarok, amelyekre a 4.34. ábrán látunk két példát. Az ábrán az egyes aminosav csoportokat gömbök jelölik. A II. β-kanyar típus harmadik aminosav-csoportja mindig glicin.

4.34. ábra: Két gyakoriβ-kanyar felépítése

4.34. ábra: Két gyakori β-kanyar felépítése

A 4.35. ábra összefoglalóan illusztrálja, hogy a másodlagos szerkezeti elemek jellemző torziós szögpárjaik miatt hol helyezkednek el a Ramachandran diagramon.

4.35. ábra: Az egyes gyakori másodlagos szerkezeti elemek pozíciója a Ramachandran diagramon

4.35. ábra: Az egyes gyakori másodlagos szerkezeti elemek pozíciója a Ramachandran diagramon

Az ábrán szerepel néhány olyan változat vagy típus, amelyek még nem kerültek megemlítésre. A β-lemezekkel kapcsolatban eddig azt az esetet tárgyaltuk, amikor a lemez egy síkban van. A globuláris fehérjékben lévő β-lemezek azonban tipikusan nem sík, hanem hajlított, tekeredő lapot képeznek. A 4.35. ábra illusztrálja a jobbra csavarodó β-lemez szerkezetet, és jelzi azt a diagram területet is, ami az ehhez a szerkezethez tartozó torziós szögpároknak felel meg.

Eddig csak jobbmenetes α-hélixekről ejtettünk szót. A főlánc azonban ellenkező irányban is tekeredhet úgy, hogy a peptidgerinc csoportok szabályos hidrogénhíd kötéseket hoznak létre. Ez egy balmenetes α-hélixet eredményezne. A balmenetes α-hélixben az oldalláncok részlegesen ütköznének a főlánc más csoportjaival, ezért a fehérjékben nem igazán jönnek létre ilyen hélixek. A Ramachandran ábrázolás mégis jelöli ezt a típust. Ennek az oka az, hogy bár kiterjedt balmenetes hélixek nem jöhetnek létre, egy-egy néhány aminosav csoportot tartalmazó rövid szakasz mégis felvehet balmenetes hélix szerkezetet.

A 4.35. ábra jelez egy kollagén tripla-hélix szerkezetet is, amellyel a fibrilláris fehérjékkel foglalkozó fejezetben találkozunk (lásd 4.5.3)

Nézzük meg egy globuláris fehérje, a szérumalbumin Ramachandran diagramját (lásd 4.36. ábra).

Az ábra a polipeptidgerinc összes torziós szögeit megjeleníti egyetlen Ramachandran diagramon. Ami elsőre szembeötlő, hogy az aminosav-csoportok elsöprő többségének konformációs állapota a diagram zölddel jelzett, tehát az alaninokra vonatkozó elméleti számítások alapján funkciós csoport ütközésekkel nem járó, „megengedett” területére esik. Az is látszik, hogy a csoportok legnagyobb hányada α-hélix konformációban van, míg maradék zöme β-lemezeket alkot. Csak elvétve találunk olyan csoportot, amely konformációja tiltott zónára esik. Az ilyen csoportok létezésére két fő magyarázat van. Az egyik, hogy ezek glicinek, amelyek számára nagyobb megengedett konformációs felület áll rendelkezésre a Ramachandran diagramon, mint alanin részére. Ezért az adott konformáció nem jár szerkezeti feszültséggel.

4.36. ábra: A szérumalbuminban szereplő aminosav-csoportokΦ/Ψszögpárjai a Ramachandran diagramon

4.36. ábra: A szérumalbuminban szereplő aminosav-csoportok Φ / Ψ szögpárjai a Ramachandran diagramon

A másik lehetőség, hogy az adott csoport nem glicin, a lokális konformáció szerkezeti feszültséggel jár, de mégis létrejöhet, mert azt egyéb, közeli kölcsönhatások kompenzálják, stabilizálva a szerkezetet.

A másodlagos szerkezetek létrejöttében az oldalláncoknak alárendelt szerep jut, hiszen ezeket a szerkezeteket főlánc csoportok közötti hidrogénhidak stabilizálják. Ennek ellenére az ismert fehérjeszerkezetekből származó statisztikák alapján világos, hogy az egyes aminosav csoportok eltérő gyakorisággal fordulnak elő a három fő másodlagos szerkezeti formában. Ezt illusztrálja a 4.37. ábra.

4.37. ábra: Az egyes aminosavak eltérő arányban szerepelnek különböző másodlagos szerkezeti elemekben

4.37. ábra: Az egyes aminosavak eltérő arányban szerepelnek különböző másodlagos szerkezeti elemekben

Az 4.37. ábra a 20 fehérjealkotó aminosavat az alapján csoportosítja, hogy milyen gyakorisággal fordulnak elő α-hélix szerkezetben. Az aminosavak felülről lefelé csökkenő gyakoriság szerint kerültek felsorolásra. α-hélix szerkezetben leginkább azok az aminosavak fordulnak elő, amelyek oldallánca elég nagyméretű ahhoz, hogy védje a hélixben lévő hidrogénhidakat a víz támadása ellen. Emellett az is fontos, hogy az oldallánc ne legyen képes hidrogénhíd partnerként versengeni a gerinc csoportokkal. A hélixben a következő okok miatt lehet alacsony az aminosav gyakorisága: hidrogénhidat kínál a főlánc csoportok számára (pl. Ser, Thr, Asn, Tyr); túl kicsi az oldallánca ahhoz, hogy védje a hidrogénhidakat (Gly) nincs főlánc N-H csoportja, amin keresztül a hélix stabilizáló főlánc hidrogénhíd kialakul (Pro).

A β-lemezekre az jellemző, hogy ezeknél maximális hely nyílik az oldallánc elhelyezésére. Ezért a legnagyobb térkitöltésű oldalláncok gyakran szerepelnek β-lemezek szerkezetben. A rövid oldalláncú, hidrogénhidat képző aminosavak (Asp, Ser, Asn), valamint a prolin és a glicin itt is alulreprezentáltak.

A β-kanyarokban felülreprezentált a glicin és a prolin, valamint egyéb, a már említett szerkezetek számára „szerkezettörő” tulajdonságú Asp, Ser és Asn.