5.5. A fehérje térszerkezet kialakulása

Mielőtt rátérnénk, hogy hogyan tekeredik fel a polipeptidlánc, tehát mi a folding mechanizmusa, vizsgáljuk meg, hogy a natív térszerkezet hogyan tekeredik le, mit tudunk meg a polipeptidlánc „unfolding”-jából.

5.5.1. A fehérjék letekeredése, az „unfolding”.

A fehérje natív szerkezete megszűntethető a hőmérséklet emelésével, vagy különböző anyagok, ún. denaturálószerek, urea vagy guanidin-hidroklorid (GndHCl) adagolásával (lásd 5.22. ábra). A fehérje szerkezetváltozása általánosságban spektroszkópiával követhető például a fehérje triptofánjainak fluoreszcencia tulajdonságain keresztül (lásd 5.23. ábra). A natív szerkezetben a triptofánok zöme a fehérje belsejében el van temetve, apoláros környezetben van. A letekeredett fehérjében a triptofánok vízzel kerülnek kölcsönhatásba. A két eltérő állapotú triptofán fluoreszcencia tulajdonságai (elnyelési és emissziós maximumok) eltérők. Enzimek esetében a natív szerkezet detektálása az enzim aktivitásán keresztül is megvalósítható.

5.22. ábra: A két leggyakrabban használt fehérjedenaturáló szer az urea és a guanidin-hidroklorid

5.22. ábra: A két leggyakrabban használt fehérjedenaturáló szer az urea és a guanidin-hidroklorid

Amikor a hőmérséklet emelésével a rendszer hőmozgásában rejlő átlagos kinetikai energiát növeljük, a rendezett natív szerkezete egy bizonyos szűk hőmérséklet tartományban összeomlik, mintegy „megolvad” (lásd 5.23. ábra). A hődenaturáció fő oka valószínűleg az, hogy a hőmérséklet emelésével megszűnik a letekeredett állapotra jellemző nagyszámú klatrát-szerkezet. Ezáltal a letekeredett állapotból a natív állapotba való „kimenekülés” fő termodinamikai oka szűnik meg. Vegyük észre, hogy a fő változás nem a natív, hanem a letekeredett szerkezetet érinti. Ebből is látszik, hogy a stabilitáshoz nem elegendő a natív szerkezetre fókuszálni, egyszerre kell figyelembe venni a natív, és a letekeredett szerkezet állapotát.

A letekeredés denaturálószer adagolásával is kiváltható (lásd 5.23. ábra). A leggyakrabban használt denaturálószerek az urea és a guanidin-hidroklorid (lásd 5.22. ábra). Ezek a kaotróp, vagyis káoszt elősegítő anyagok a jelenlegi ismeretek szerint szintén a klatrát-szerkezet megszüntetésén keresztül fejtik ki főleg a hatásukat. Ezáltal elsősorban a letekeredett szerkezetet stabilizálják. Vegyük észre, hogy a letekeredés itt is egy szűk tartományban, ebben az esetben a kaotróp anyag szűk koncentrációtartományában megy végbe.

5.23. ábra: Egy globuláris fehérje denaturációs görbéje.A denaturálószer koncentrációjának növelésével, illetve a hőmérséklet emelésével egyre nő a letekeredett fehérjék aránya. Ez az arány egy szűk koncentráció- illetve hőmérséklettartományban meredeken emelkedik. A legegyszerűbb modell szerint a fehérje térszerkezete vagy teljes mértékben natív, vagy teljes mértékben letekeredett, a kettő között nincs átmenet. Az 50%-os letekeredési szint esetében tehát a fehérjemolekulák 50%-a tökéletes natív, másik 50%-a tökéletesen letekeredett szerkezetű.

5.23. ábra: Egy globuláris fehérje denaturációs görbéje. A denaturálószer koncentrációjának növelésével, illetve a hőmérséklet emelésével egyre nő a letekeredett fehérjék aránya. Ez az arány egy szűk koncentráció- illetve hőmérséklettartományban meredeken emelkedik. A legegyszerűbb modell szerint a fehérje térszerkezete vagy teljes mértékben natív, vagy teljes mértékben letekeredett, a kettő között nincs átmenet. Az 50%-os letekeredési szint esetében tehát a fehérjemolekulák 50%-a tökéletes natív, másik 50%-a tökéletesen letekeredett szerkezetű.

A szerkezet szűk tartományon belüli összeomlása azt jelzi, hogy a natív szerkezet egy bizonyos destabilizáló hatást még tolerál, majd egy határ felett összeomlik. Ez arra utal, hogy a natív szerkezetet egymással együttműködő, kooperatív kölcsönhatások stabilizálják. Amint ezek egy része felbomlik, úgy az azonnal meggyengíti a fennmaradó kölcsönhatásokat, és a teljes rendszer összeomlik.

Ennek megfelelően a legegyszerűbb „minden vagy semmi” modell szerint a fehérje térszerkezete vagy teljes mértékben natív, vagy teljes mértékben letekeredett, a kettő között nincs átmenet. Az 5.23. ábra diagramját tehát úgy kell értelmezni, hogy például az 50%-os letekeredési szint esetében a fehérjemolekulák fele tökéletes natív szerkezetben van, a másik fele tökéletesen letekeredett állapotú.

5.5.2. Az Anfinsen-kísérlet

Christian Anfinsen az 1960-as évek elején bizonyította, hogy egy kisméretű, globuláris enzim fehérje, az RN-áz (ribonukleáz, RNS-bontó enzim; a térszerkezetét, kiemelve a 4 diszulfidhidat, lásd 5.24. ábra) tökéletesen reverzibilisen renaturálható (lásd 5.25. ábra).

A kísérlet lényege röviden a következő: az RN-áz enzimaktivitása jelzi a natív szerkezet meglétét, ezért ezen keresztül mérhető, hogy a jelenlévő RN-áz molekulák hanyadrésze van natív állapotban. Az RN-áz fehérje diszulfidhidakat is tartalmaz, azért teljes denaturáláshoz nem elegendő denaturálószert, ureát adni, a diszulfidhidakat valamilyen redukálószerrel, például merkaptoetanollal fel kell nyitni. Urea és merkaptoetanol hozzáadására az RN-áz fehérje „letekeredett”, az aktivitása teljesen megszűnt.

5.24. ábra: Az RN-áz enzim térszerkezete.(világoskék: β-lemez, barna: α-hélix, sárga: diszulfidhíd; PDB: 2AAS)

5.24. ábra: Az RN-áz enzim térszerkezete. (világoskék: β-lemez, barna: α-hélix, sárga: diszulfidhíd; PDB: 2AAS)

A kísérlet lényegi része ezután következett. Amint az ureát és a merkaptoetanolt dialízissel eltávolította, a fehérje minden különleges segédanyag nélkül visszanyerte az aktivitását, feltekeredett (lásd 5.25. ábra). Az is kiderült, hogy amennyiben a merkaptoetanolt gyorsan, és teljes mértékben eltávolította, a feltekeredés alacsony hatékonyságú volt. Ha azonban nagyon alacsony koncentrációban hagyott az oldatban merkaptoetanolt (a teljes redukáláshoz szükségesnél sokkal alacsonyabb koncentrációban), akkor a feltekeredés hatékonysága rendkívüli mértékben megnőtt.

5.25. ábra: Az Anfinsen-kísérletben szereplő fehérjeszerkezeti állapotok, és az ezekhez vezető körülmények.A hibás diszulfidhidas állapot akkor halmozódik fel, ha a redukálószert gyorsan eltávolítják.

5.25. ábra: Az Anfinsen-kísérletben szereplő fehérjeszerkezeti állapotok, és az ezekhez vezető körülmények. A hibás diszulfidhidas állapot akkor halmozódik fel, ha a redukálószert gyorsan eltávolítják.

A natív RN-áz molekulában 4 diszulfidhíd, a teljesen letekeredettben tehát 8 szabad cisztein van. A redukálószer gyors és teljes eltávolítása azzal járt, hogy felszaporodtak azok a szerkezetek, amelyek hibás diszulfidhidakat tartalmaztak. Ezekből a lokális (tehát nem abszolút) szabadentalpia minimumokat reprezentáló hibás szerkezetekből csak a diszulfidhidak felbomlásával lehet kikerülni, ami lassú folyamat. Kis koncentrációban lévő merkaptoetanol elegendő volt ahhoz, hogy felbontsa a hibás, feszített szerkezetű diszulfidokat, új esélyt adva a molekuláknak a helyes feltekeredésre. A natív állapotra jellemző, stabilabb diszulfidhidakat a nagyon alacsony koncentrációban alkalmazott merkaptoetanol nem bontotta fel. Később számos más fehérje esetében is sikerült kimutatni, hogy a térszerkezetet az elsődleges szerkezet kódolja.

Az Anfinsen-kísérlet elvi jelentősége: a kísérlet bebizonyította, hogy a fehérje foldingja a denaturációt kiváltó okok megszűntével spontán végbemegy. Ez csak azzal magyarázható, hogy a natív térszerkezet valamilyen módon „bele van kódolva” a fehérje aminosavsorrendjébe. Az aminosavsorrend, tehát az elsődleges szerkezet egyértelműen meghatározza a térszerkezetet, tehát a harmadlagos szerkezetet! Anfinsen ezért a felismerésért 1972-ben kémiai Nobel-díjat kapott.

Az önálló feltekeredés képessége egyfajta autonómiát jelent a fehérjékre nézve. A biológiai rendszerekben számos esetben tapasztalunk alapvető egymásrautaltságot a komponensek között. Például DNS kódolja a fehérjéket, de a dekódolást, illetve a DNS másolását fehérjék végzik. A feltekeredés képessége ugyanakkor éppenséggel lehet a fehérje autonóm tulajdonsága.

Fontos kihangsúlyozni, hogy a tudomány mai állása szerint pusztán az aminosavsorrendből, egyéb független információk (például hasonló szekvenciájú fehérjék térszerkezetének ismerete) nélkül a kutatók egyelőre nem tudják kiszámolni, „meghatározni” a fehérje térszerkezetét. Az információ tehát „ott van”, de annak kifejtési módját egyelőre nem sikerült kellő részletességgel feltárni.

Az Anfinsen kísérlet azt mutatja meg, hogy nincsen elvi akadálya annak, hogy egy fehérje a szekvenciájában kódolja a térszerkezetét, és autonóm módon képes legyen feltekeredni. Ez azonban nem jelenti azt, hogy az élő szervezetben ne lenne a legtöbb fehérje számára hasznos a feltekeredés folyamatának segítése, katalizálása. Ismert tény, hogy a sejtekben számos olyan fehérje működik, amely javítja a feltekeredés hatékonyságát. Ezek a dajkafehérjék (chaperon-ok).

A sejtben hatalmas koncentrációban vannak jelen a fehérjék. Amikor a polipeptidlánc szintetizálódik, a még el nem készült lánc az oldat felé forduló apoláros részei miatt aggregálódhat. A dajkafehérjék egyik típusa (chaperonin-ok) hatalmas fehérje komplexet alkot, amely egyfajta kalitkába zárja a letekeredett fehérjét (Anfinsen tiszteletére ezt Anfinsen-kalitkának nevezték el), és ATP bontásból származó energiával segíti a feltekeredést. A segítés főleg az aggregálódás megakadályozásán keresztül történik.

A kólibaktérium GroEL/GroES chaperonin komplexének szerkezetét az 5.26. ábra illusztrálja. A GroEL és a GroES fehérjék több alegységből állnak, tehát negyedleges szerkezettel bírnak (lásd 5.6. fejezet).

A GroEL összesen 14 darab, 57 kDa méretű alegységből alakul ki. Szerkezete két gyűrűből épül fel, mindkét gyűrűt 7 alegység alkotja. A 14-alegységes fehérje így D7-es szimmetriával rendelkezik. (A szimmetriák általános leírását lásd 5.6). A két gyűrű egy hengert alkot. A GroES 7 darab, 10 kDa méretű alegységből áll, és sapkaszerűen lezárja a henger egyik oldalát. Így jön létre az Anfinsen-kalitka.

Más dajkafehérjék konformációs csapdákból segítik kijutni a feltekeredő fehérjét. Az eukarióták endoplazmás retikulumában működő protein-diszulfid-izomeráz például az Anfinsen-kísérletben kis koncentrációban alkalmazott merkaptoetanollal analóg módon segíti a feltekeredést: elősegíti a hibás diszulfidhidak bomlását. (A első protein-diszulfid-izomeráz enzimet magyar kutató, Venetianer Pál írta le.) Szintén konformációs csapdából segíti kijutni a feltekeredő fehérjét a peptidil-prolin cisz/transz izomeráz enzim is, amely a nem natív konfigurációjú prolinok átalakulását katalizálja.

Elméleti szempontból a dajkafehérjék léte tehát önmagában nem mond ellent az Anfinsen-kísérletből levont következtetés univerzális érvényének. Ugyanakkor a mai ismeretek szerint a fehérjék egy kis hányada kizárólag dajkafehérjék segítségével képes feltekeredni. A térszerkezeti információ ezek esetében is a primer szerkezetben kódolt, de önállóan nem tud érvényre jutni, csak dajkafehérjék segítségével. Másképpen fogalmazva, bár a feltekeredésnek termodinamikai gátja nincs, kinetikailag (tehát időben) a natív szerkezet elérése (a termodinamikai egyensúly beállta) csak nagyon lassan történne meg segítőfehérjék nélkül.

5.26. ábra: AGroES/GroEL komplex (chaperonin)térszerkezete (PDB:1AON)

5.26. ábra: AGroES/GroEL komplex (chaperonin) térszerkezete (PDB:1AON)

5.5.3. A fehérjék feltekeredése: a Levinthal-paradoxon

Az ismeretek egyszerű kombinálása olykor nagyon fontos következtetésekhez vezethet. Nézzük meg, mire jutunk, ha kombináljuk a fehérjék térszerkezetével, a molekuláris mozgások sebességével, és a fehérje feltekeredés sebességével kapcsolatos ismereteket.

Cyrus Levinthal 1968-ban az alábbi gondolatkísérletet tette közzé: vegyünk egy 100 aminosavas fehérjét. A fehérje natív főlánc szerkezetét 99 Φ, és 99 Ψ szöggel lehet megadni, ez tehát 198 torziós szög. Vizsgáljuk meg, hogy teljesen letekeredett állapotából mennyi idő alatt érheti el a főlánc a natív szerkezetet, ha véletlenszerűen próbálgatja végig az összes lehetséges konformációt. Tegyük fel, hogy minden torziós szög esetén valójában csak 3 értéket képes felvenni a szerkezet. Ez azt jelenti, hogy a főlánc 3198 eltérő konformációban lehet. Ez nagyjából 3×1094 egyedi konformáció. Ha az egyes konformációk közötti átmenetek idejét egy pikoszekundumnak vesszük (a valóságban is legfeljebb ilyen gyorsan mehetnek végbe a konformációváltozások), akkor 3×1082 másodpercbe telne az összes konformáció véletlenszerű végigjárása. Egy év kb. 3×107 másodperc, tehát 1075 évbe telne ez a próbálgatás. Nos, ez több mint 1065-szer meghaladja az univerzum korát. A valóságban a fehérjék akár a másodperc ezred, sőt milliomod része alatt is feltekeredhetnek. A gondolatmenetben tehát valahol komoly ellentmondás van. Emiatt ezt a gondolatmenetet Levinthal paradoxonnak nevezték el.

Vajon hogyan lehet az ellentmondást feloldani? A gondolatmenetben minden abban szereplő adat kísérletesen igazolt, vagy legalábbis az ismeretek által kellően alátámasztott. A gondolatmenetben egyetlen olyan kijelentés van, ami ugyan logikusnak tűnik, de amelyet semmilyen kísérletes adat nem támaszt alá. Ez az, hogy a feltekeredés során a főlánc véletlenszerűen próbálgatja végig az egyes konformációs állapotokat.

A paradoxon feloldása tehát abban áll, hogy elvetjük azt a lehető legegyszerűbb, ezért logikusnak tűnő, de ezek szerint helytelen feltevést, miszerint a feltekeredés egy teljesen random folyamat lenne.

Nos, ha nem teljesen random, akkor mi lehet a megoldás? Levinthal azt javasolta, hogy a feltekeredést a fehérjében lokális kölcsönhatások indítják el. A fehérje valamelyik szekvencia-részlete lokális kölcsönhatások révén (lásd pl. alfa hélix) rendkívül gyorsan elnyeri a natív konformációját. Ez a lokális rend leszűkíti a környező részek konformációs lehetőségeinek a számát, meghatározza, hogy azok milyen konformációt vehetnek fel. Ezt a folyamatot ahhoz hasonlította, ahogyan a kristálygóc irányítja a kristályosodás folyamatát. Legegyszerűbben megfogalmazva ez azt jelenti, hogy létezik egy, vagy több feltekeredési útvonal, a fehérje szerkezete ezen, vagy ezeken halad végig, ahelyett, hogy az összes lehetséges utat bejárná.

5.5.4. A fehérjék feltekeredése: a folding tölcsér

A feltekeredés folyamatának jelenleg elfogadott általános modelljét nagyon szépen lehet illusztrálni a „folding tölcsér”-rel (lásd 5.27. ábra).

A Levinthal paradoxonban említett hatalmas számú konformációs állapot mindegyikét reprezentálni lehet 1-1 ponttal egy n-dimenziós matematikai térben, ahol „n” számú adat tökéletesen definiál egy adott konformációt. Főlánc esetén ez az összes torziós szög adata lenne. Egy ilyen térben minél hasonlóbb két konformáció, annál kisebb a hozzájuk rendelt pontok egymástól való távolsága. A valóságban ugyan nem tudnánk megtenni, de az illusztrálhatóság kedvéért ábrázoljuk az egyes konformációkhoz tartozó pontokat egy háromdimenziós térben elhelyezkedő felületen.

A Levinthal paradoxonban nem szerepelt az a gondolat, hogy minden egyes konformációhoz tartozik egy szabadentalpia érték. Ebben az ábrázolásban legyen ez is egy független adat. Kérdés, hogy milyen alakzat szemlélteti legjobban az eddig összegyűlt ismereteket.

5.27. ábra: A folding tölcsér.A folding tölcsért a feltekeredés termodinamikai hátterének illusztrálására vezették be, ennek részleteit lásd a főszövegben.

5.27. ábra: A folding tölcsér. A folding tölcsért a feltekeredés termodinamikai hátterének illusztrálására vezették be, ennek részleteit lásd a főszövegben.

Az egyik ismeret, hogy a natív szerkezet a legalacsonyabb szabadentalpia szintű szerkezet. A háromdimenziós térben a függőleges tengely (a – mint látni fogjuk – tölcsérszerű képződmény magassága) feleljen meg a szabadentalpia szintnek. Az alakzatunknak tehát kell, hogy legyen egy legalsó pontja, ami a natív állapotnak felel meg.

Teljesen rendezetlen, teljesen letekeredett konformációs állapot csillagászati számú lehet, és ezekhez tartozik a legmagasabb szabadentalpia érték. Tehát az alakzatnak kell, hogy legyen egy maximális magassága, amelyhez maximális számú pont tartozik. A két véglet között részben rendezetett szerkezetű, köztes szabadentalpia szinten lévő állapotok tartoznak majd. Az egyre alacsonyabb szabadentalpia szintekhez egyre kevesebb konformációs állapot, tehát egyre kevesebb pont tartozik.

Ezek a kritériumok együttesen egy tölcsérszerű felületet eredményeznek (lásd 5.27. ábra). A függőleges tengely, mint említettük, a szabadentalpia szintet jelzi. Minden szabadentalpia szintnél elmetszhetjük a tölcsért egy vízszintes síkkal. Az így kapott zárt alakzat kerülete (a tölcsér kerülete) reprezentálja a konformációs entrópiát. A tölcsér tetején a kerület maximális, jelezve, hogy a teljesen letekeredett állapotokból van a legtöbbféle, ezek rendelkeznek együttesen a legnagyobb konformációs entrópiával.

Ebben az ábrázolásmódban a feltekeredés folyamata úgy illusztrálható, hogy egy-egy teljesen letekeredett állapothoz tartozó pont mintegy „legurul” a tölcsér aljára. A pont lefelé haladása természetesen konformációs állapotok során történő áthaladást jelent. A feltekeredést a csökkenő szabadentalpia szint hajtja. Emlékezzünk vissza, spontán folyamatnál a rendszer szabadentalpiája csökken, ez hajtja a folyamatot. A tölcsér pereméről rendkívül sokféle útvonalon haladhat lefelé a pont, de ahogy egyre lejjebb jut, az általa reprezentált feltekeredő polipeptidlánc egyre kevesebb fajta konformáció közül választhat. Ezt jelzi az alakzat egyre szűkülő, tölcsér alakja.

Az 5.27. ábra jobb oldalán szereplő összetettebb kép azt is mutatja, hogy a tölcsér felszínén „hegyek”, és „gödrök” lehetnek. A hegyek olyan szabadentalpia gátakat illusztrálnak, amiken akadályozott az átjutás. Ezek lassítják a feltekeredést. A gödrök lokális szabadentalpia minimumokat illusztrálnak, amikben hosszabb-rövidebb időt eltölthet a polipeptidlánc. Az itt lévő pontok ideiglenesen felszaporodó, részben rendezett állapotú szerkezeteket, szakszóval folding intermedier-eket reprezentálnak.

Ez az elegáns leírás nagyban segíti, hogy el tudjuk képzelni, mit jelenhetnek a feltekeredési útvonalak, vagy a folding intermedierek, de nem részletezi a feltekeredés molekuláris mechanizmusát. Ezzel kapcsolatban csak röviden megemlítjük, hogy a folding mechanizmusára alapvetően két fő, egymásnak ellentmondó elmélet született. Az egyik a vázszerkezet-modell (framework model), a másik a hidrofób összeomlás modell (hydrophobic collapse model).

A vázszerkezet modell szerint a feltekeredés viszonylag korai szakaszában létrejönnek a natív állapotra jellemző másodlagos szerkezeti elemek, majd ezek egymással másodlagos kölcsönhatásokba lépve alakítják ki a natív szerkezetet a hidrofób maggal. A hidrofób összeomlás modell szerint a sorrend fordított, a feltekeredés egyik korai szakaszában kialakul egy hidrofób mag (az ebben az állapotban lévő szerkezetet moltenglobule-nak, „megolvadt gombócnak” nevezik), majd ezek után alakulnak ki a másodlagos szerkezeti elemek.