6. fejezet - Fehérjék izolálása és fehérjevizsgáló módszerek

Tartalom

6.1. A spektroszkópia alapjai
6.1.1. Minőségi meghatározás: spektrumok
6.1.2. Mennyiségi meghatározás: a Lambert-Beer törvény
6.2. A sejtek feltárása és a fehérjék izolálása
6.2.1. A sejtek feltárása
6.2.2. Sejtfrakcionálás
6.2.3. Centrifugálás
6.2.4. Fehérjék durva frakcionálása
6.3. Kromatográfiás eljárások
6.3.1. Ioncserés kromatográfia
6.3.2. Fehérjék elválasztása méret szerint: gélszűrő kromatográfia
6.3.3. Reverz-fázisú kromatográfia: fehérjék elválasztása hidrofób jelleg alapján
6.3.4. Affinitás-kromatográfia
6.4. Elektroforetikus eljárások
6.4.1. Az elektroforézisről általánosságban
6.4.2. A poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE)
6.5. Aminosav összetétel analízis
6.6. A fehérjék szekvenálás
6.6.1. Sanger módszerének lényege, és jelentősége
6.6.2. Aminosav csoportok egyenkénti eltávolítása az N-terminálisról: az Edman-módszer
6.6.3. A diszulfidhidak pozíciójának meghatározása

(szerző: Pál Gábor)

Miután megismerkedtünk a fehérjék legalapvetőbb tulajdonságaival, nézzük át, hogyan lehet fehérjéket homogén formában izolálni, illetve hogyan lehet a fehérjék egyes fontos tulajdonságait meghatározni. Ezek az ismeretek megkönnyítik majd annak megértését, hogy a későbbi fejezetekben bemutatott ismeretanyagot vajon milyen módon tárhatták fel a kutatók.

6.1. A spektroszkópia alapjai

Mielőtt a fehérjék izolálásának témakörét tárgyalnánk, ismerkedjünk meg a legalapvetőbb vizsgálati módszer, a spektroszkópia alapjaival.

Az elektromágneses sugárzás rendkívül sokféle formában használható fel anyagvizsgálatokra. Ezek a vizsgálatok a spektroszkópia területére esnek. Mint már láttuk, a rendkívül kis hullámhosszú röntgensugár, és a rendkívül nagy hullámhosszú rádiófrekvenciás sugárzás egyaránt felhasználható molekulák térszerkezetének meghatározásához (lásd röntgendiffrakció és mágneses magrezonancia az 5.1. fejezetben).

A fent említett sugárzásoktól eltérően a ~190-320 nm illetve a ~320-800 nm hullámhossz tartományba eső elektromágneses sugárzás, vagyis az ultraibolya (UV) és a látható (VIS) tartományba eső fény abban az energiatartományban van, amellyel az atomok és molekulák külső héján lévő elektronok jól gerjeszthetőek.

Az elektrongerjesztés miatti fényelnyelés mérésén alapuló spektrofotometria a legalapvetőbb spektroszkópiai módszer.

Azok az anyagok, amelyek a látható tartományban nyelnek el fényt, színesek. A központi fontosságuk miatt a biokémia által legtöbbet vizsgált fehérjék zöme, és a nukleinsavak nem ilyenek. Ugyanakkor ezek az anyagok karakteres fényelnyelést mutatnak az UV tartományban.

A fényelnyelés egy rendkívül alapvető eljárás mind minőségi, mind mennyiségi meghatározások esetében. A fényelnyelés hullámhossz-függése, vagyis az elnyelési spektrum jellemző arra az elektronszerkezetre, amelyet a fény gerjeszt. Az elnyelési spektrum tehát függ az anyagminőségtől, ezért minőségi anyag-meghatározásra használható. Az elnyelés mértéke ugyanakkor függ a fényt elnyelő anyag mennyiségétől, ami pedig mennyiségi meghatározásokat tesz lehetővé.

A fényelnyelés mértékét két, egymással összefüggő módon szokás kifejezni. Az egyik a transzmisszió, T (áteresztés), a másik az extinkció, E (kioltás, megszűnés), vagy ennek másik megnevezése az abszorbancia, A (elnyelés).

Vegyünk egy monokromatikus, azaz egyetlen, konkrét hullámhosszal jellemezhető I0 intenzitású fénynyalábot, ami haladjon át a vizsgált mintán (lásd 6.1. ábra).

6.1. ábra: A spektrofotometria a fényelnyelés mérésén alapul

6.1. ábra: A spektrofotometria a fényelnyelés mérésén alapul

Belátható, hogy az (eredetivel azonos hullámhosszú) áthaladó fény I intenzitása vagy megegyezik a beeső fény intenzitásával (ha a mintában lévő elektronok nem gerjesztődnek, tehát a minta nem nyel el), vagy kisebb annál (ha a minta a fény egy részét elnyeli).

A transzmittancia, T (áteresztőképesség) azt mutatja meg, hogy a minta a beeső fény hanyadrészét engedi át. A transzmittancia definíció szerint az alábbi egyenlettel írható le:

6.1. egyenlet

A T értéke az 1 (nincs fényelnyelés) és a 0 (minden fény elnyelődik) tartományban van. Használatos a T% mértékegység is, amely százalékban fejezi ki az áteresztőképességet:

6.2. egyenlet

A fényelnyelés jelensége egy másik, mint látni fogjuk hasznosabb matematikai formában is kifejezhető az extinkció (más néven abszorbancia), E fogalmával. Definíció szerint:

6.3. egyenlet

Az extinkció egy dimenzió nélküli mérőszám. Ha nincs fényelnyelés, akkor az E értéke nulla. Ha a fény egytizede megy át a mintán, akkor az E értéke 1, ha 99% nyelődik el, akkor az E = 2.

Az extinkció és a transzmittancia kapcsolatát az alábbi egyenlet írja le:

6.4. egyenlet

Ugyanez az extinkció és a százalékos transzmittancia kapcsolatát az alábbi egyenlet írja le:

6.5. egyenlet

A 6.1. táblázat számokban mutatja be a fényelnyelés és a százalékos fényáteresztő képesség viszonyát.

6.1. táblázat: Egyes abszorbancia értékek, és a hozzájuk tartozó százalékos transzmittancia

6.1. táblázat: Egyes abszorbancia értékek, és a hozzájuk tartozó százalékos transzmittancia

6.1.1. Minőségi meghatározás: spektrumok

Amennyiben az extinkció értékét megmérjük és ábrázoljuk a hullámhossz függvényében, spektrumot kapunk. Egy homogén anyag spektruma jellemző az elnyelést okozó anyag elektronszerkezetére, tehát magára az anyagra. Az adott anyag minden olyan változása, amely érinti az elektronszerkezetet, spektrális változással jár, így kimutatható. Jó példa erre a NAD koenzim oxidált és redukált állapotainak eltérő spektruma (lásd 6.2. ábra; lásd még 20.16. ábra).

6.2. ábra: A NAD koenzim redukált és oxidált formája jellegzetesen eltérő spektrumot ad.

6.2. ábra: A NAD koenzim redukált és oxidált formája jellegzetesen eltérő spektrumot ad.

Az oxidált és a redukált forma egyaránt rendelkezik egy adenin gyűrűvel, emiatt mindkét formának van 260 nm közelében egy elnyelési csúcsa. A redukált forma azonban egy 340 nm körüli extra csúccsal is rendelkezik, ami a redukció következményeként megjelenő, a nikotinsavamid részletet érintő kinoidális szerkezetnek köszönhető.

Az aminosavak közül a triptofán, a tirozin és a fenilalanin például UV tartományban jellegzetes spektrummal rendelkeznek, 280 nm környékén maximális elnyelést mutatnak. A fehérjék túlnyomó többségében jelen vannak ezek az aminosav csoportok, így a fehérjék túlnyomó többségének 280 nm körül elnyelési maximuma van. A fehérjék 220 nm körül is komoly elnyelési csúccsal rendelkeznek. Ez a peptidkötésnek tulajdonítható.

A nukleinsavak a pirimidin és purin bázisok miatt 260 nm környékén rendelkeznek abszorpciós maximummal, ezt az adenin részlet elnyelése révén már a NAD/NADH spektrumával kapcsolatban (lásd 6.2. ábra) már említettük.

6.1.2. Mennyiségi meghatározás: a Lambert-Beer törvény

A Lambert-Beer törvény kapcsolatot teremt az extinkció, és a fényelnyelést okozó anyag koncentrációja között.

A mérés során az anyag c koncentrációjú oldatát egy mintatartó edénybe, küvettába helyezzük. A küvetta anyagát úgy kell megválasztani, hogy az ne nyeljen el a mérésben használt hullámhosszon. A küvetta fény irányával megegyező kiterjedése megadja a fényutat (l). A küvettát egy spektrofotométer készülékbe helyezzük. A készülék méri a beeső fény I0, és az áteső fény I intenzitását, és kiszámítja az extinkció értékét (lásd 6.3. ábra)

6.3. ábra: Oldott anyagok abszorbanciája arányos az anyag koncentrációjával, és a fényút hosszával

6.3. ábra: Oldott anyagok abszorbanciája arányos az anyag koncentrációjával, és a fényút hosszával

A Lambert-Beer törvény szerint egy fényelnyelő anyag oldatkoncentrációja, és az oldat extinkciós értéke között lineáris összefüggés áll fenn az alábbi egyenlet szerint:

6.6. egyenlet

ahol E az extinkció, c az oldott anyag koncentrációja, l a fény küvettában megtett útja cm mértékegységben, míg ε az extinkciós együttható (koefficiens). Az ε pontos megnevezése és mértékegysége a koncentráció mértékegységéhez igazodik. A koncentrációt leggyakrabban molaritásban (M) adjuk meg. Ilyenkor az ε-t moláris extinkciós együtthatónak nevezzük, mértékegysége M-1 x cm-1.

Az ε számértéke megegyezik a vizsgált anyag 1 mólos oldatának extinkciójával, ha a fényút 1 cm. (Ez természetesen egy elméleti érték, a valóságban egy fényelnyelő anyag 1 mólos oldatának elnyelési értéke olyan magas lenne, hogy az nem lenne mérhető).

Az egyenletből c értéke kifejezhető:

6.7. egyenlet

A moláris extinkciós együttható és a fényút ismeretében tehát egy anyag koncentrációja megmérhető az extinkció meghatározásán keresztül.

A Lambert-Beer egyenlet érvényességének szigorú feltételei vannak: az összefüggés kizárólag monokromatikus fényre vonatkozik; az oldószer a méréshez használt hullámhosszon nem nyelhet el; a vizsgált anyag fizikokémiai állapota nem függhet a koncentrációjától (egyes anyagok például magasabb koncentrációban aggregálódnak).

A fotometria tehát egy rendkívül széleskörűen használható eljárás oldott anyagok azonosítására, és koncentrációjuk mérésére.