6.2. A sejtek feltárása és a fehérjék izolálása

A fehérjék természetes forrásból történő izolálásánál az első kérdés az, hogy az adott fehérje milyen szövetben fordul elő legnagyobb mennyiségben. Ez dönti el, hogy milyen szövetből induljunk ki. Fontos, hogy intracelluláris, extracelluláris (pl. vérben lévő) vagy membránfehérjéről van-e szó. Ha intracelluláris a fehérje, akkor fontos tudnunk, hogy melyik sejtalkotóban van jelen legnagyobb mennyiségben, hiszen akkor érdemes először azt a sejtalkotót izolálni. Azt a folyamatot, melynek során az eukarióta sejt egyes alkotóegységeit (pl. plazmamembrán, sejtmag, mitokondriumok) izoláljuk, sejtfrakcionálásnak nevezzük. Ennek során a sejteket feltárjuk, és az egyes fő sejtalkotókat egymástól különböző frakciókba különítjük.

6.2.1. A sejtek feltárása

A sejtek feltárásának részletes eljárása attól függ attól, hogy mi a kiindulási minta. Többsejtűek esetén a cél az, hogy a szövetet alkotó sejtek közötti kapcsolatot megszűntessük, az egyes sejtek sejtmembránja esetleg sejtfala (lásd növények, gombák) felszakadjon, a sejtek feltáródjanak.

Az eljárás során rendszerint olyan puffer oldatokat használunk, amelyek hasonlítanak a feltárandó minta natív körülményéhez. A mintát általában hűtjük, hogy lassítsuk a káros kémiai reakciókat, például a proteázok általi fehérjebontást, vagy a spontán oxidációt. A proteázok gátlására proteáz-inhibitor keveréket, az oxidáció kivédésére redukáló szereket is alkalmazhatunk. A mintában nehézfém ionok is lehetnek, amelyek komplexet képezhetnek egyes aminosav oldalláncokkal. Ennek kivédésére például etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA) alkalmazunk, amely a nehézfém-ionokkal komplexet képez, és így megköti azokat.

A két leggyakrabban alkalmazott sejtfeltáró módszer a késes homogenizálás, és az ultrahangos feltárás. A késes homogenizátor egy, a célra optimalizált „botmixer” jellegű készülék. Ezzel a készülékkel erős szerkezetű szöveteket is szét lehet roncsolni. Az ultrahangos sejtfeltárást inkább a már többé-kevésbé szétválasztott sejtek szuszpenziója esetén használatos. Az ultrahangot egy „szonikátor”-nak nevezett készülék állítja elő, amely a rezgéseket egy fém alkatrész segítségével vezeti a sejt-szuszpenzióba. Az ultrahangot rövid pulzusokban adagoljuk. A sejteket a hirtelen jelentkező nagy nyomáskülönbségekből adódó nyíróerők tárják fel.

Nyíróerőkön alapulnak mindazok az eljárások is, amelyeknél a sejt-szuszpenziót egy szűk keresztmetszetű térrészen keresztül préselik át nagy nyomást alkalmazva. Ennél a módszernél az alacsony-nyomású térrészbe jutó sejtek a hirtelen nyomásesés miatt szinte felrobbannak. Szintén a nyíróerőket alkalmazzák azok a sejtfeltárók, amelyeknél a sejt szuszpenziót egy olyan hengerbe teszik, amelyben egy, a henger átmérőjénél éppen csak kisebb átmérőjű dugattyút mozgatnak. A henger és a dugattyú fala közötti, a sejteknél csak alig nagyobb térrészben a nyíróerők miatt a sejtek feltáródnak.

Különösen ellenálló, például sejtfallal rendelkező növényi sejtek esetében kvarcszemcsék segítségével, ill. folyékony nitrogénban való lefagyasztás utáni dörzsmozsaras feltárást is alkalmaznak. Ezzel szemben a rendkívül sérülékeny vérsejtek esetében a feltáráshoz elegendő az is, ha a sejteket hipozmotikus oldatba helyezzük. Sejtfal hiányában ezek az egyedi sejtek a hirtelen beáramló víz miatt kipukkadnak.

6.2.2. Sejtfrakcionálás

A sejtfrakcionálás fő célja az, hogy a feltárt sejtek egyes alkotóit egymástól elkülönítsük, izoláljuk. A frakcionálást megelőző sejtfeltárás módszerének intenzitását ennek megfelelően optimalizálni kell. A sejtfeltárás kellően intenzív kell, hogy legyen, hogy a sejtek jelentős része feltáródjon, de ugyanakkor fontos, hogy a sejtalkotók zöme ép állapotban maradjon. A sejtek feltárása során a plazmamembrán szétesik, és kis membrán határolt részecskéket, vezikulákat képez. Ezek, és a többi sejten belüli organellum, illetve a citoszól oldott fehérjéi és egyéb anyagai alkotják azt a homogenátumot, amelyből az egyes frakciókat izoláljuk. Az egyes frakciók elválasztásának fő módszere a centrifugálás, ezért a következőkben ennek alapelvét és fő eljárásait ismertetjük.

6.2.3. Centrifugálás

Ha egy objektumot fonálon tartva pörgetünk, a fonalat húznunk kell ahhoz, hogy a test körpályán maradjon. Ezáltal akadályozzuk meg, hogy a test egy érintő egyenes mentén, egyenes vonalú egyenletes mozgást végezzen. Az az erő, amivel a tengely felé húzzuk fonalat, a centripetális erő. Az ezzel éppen ellentétes irányú, a test tehetetlenségéből fakadó fiktív erő, amellyel a test a fonálon keresztül húzza a kezünket, a centrifugális erő (Fc).

Az egyszerűség kedvéért az oldatok centrifugálása során lezajló folyamatokat az Fc erővel szokták leírni.

Az ismert Newton-féle alapegyenlet szerint:

6.8. egyenlet

Centrifugálás során a gyorsulás a szögsebesség négyzetének és a sugárnak a szorzata:

6.9. egyenlet

A fiktív centrifugális gyorsító erő, Fc vákuumban tehát:

6.10. egyenlet

A sugár és a szögsebesség-négyzet szorzata nem más, mint a centrifugálás során jelentkező gyorsító potenciál. Ezt hagyományosan (és talán kissé megtévesztő módon) a földi gravitációs térerőből fakadó nehézségi gyorsulás (g) arányában adják meg. Tehát a centrifugában ébredő gyorsulási potenciál mértékét úgy adják meg, hogy az hányszorosa a g értéknek.

Ennek a jelölésmódnak az indoka az, hogy a részecskék a földi gravitáció miatt is ülepednek. A centrifugálás során is ülepítjük a részecskéket, de ekkor a gravitációból eredő gyorsító potenciálnak sokszorosát, akár több százezerszeresét is el tudjuk érni. Ez a fajta leírás tehát azt mutatja meg, hogy a centrifugálással hányszor hatékonyabban ülepítünk a Föld gravitációs potenciáljához képest.

Amikor oldatokat centrifugálunk, akkor az oldatban lévő részecskék vákuum helyett egy adott sűrűségű közegben vannak. Természetesen erre a közegre is hat a centrifugális erő. Amennyiben a részecske sűrűsége éppen megegyezik a közeg sűrűségével, úgy a részecske a közeghez képes nem mozog, vagyis a sugárirányú elmozdulása nulla lesz. Ha a részecske sűrűsége nagyobb, mint a közegé, akkor sugár irányban elindul kifelé (miközben az általa kiszorított közeg a sugár felé halad), ha pedig a sűrűsége kisebb a közegénél, akkor elindul sugárirányban a tengely felé (miközben az általa kiszorított közeg kifelé halad).

Ennek a jelenségnek a leírását szolgálja a lebegési faktor bevezetése:

6.11. egyenlet

ahol a tört számlálójában a közeg, a nevezőjében pedig a részecske sűrűsége szerepel.

A lebegési faktorral, mint szorzótényezővel kombinált egyenlet a következő:

6.12. egyenlet

Ebből az egyenletből jól látható, hogy a centrifugálás során az adott részecskére ható erő függ a részecske tömegétől, a közeghez viszonyított sűrűségétől, a szögsebességtől, és a tengelytől való távolságtól.

Ezek közül magára a részecskére jellemző tényezők, amelyek eltérő részecskék elválasztására adnak lehetőséget, a részecske tömege, és a sűrűsége. Mint látni fogjuk, két alapvető, centrifugáláson alapuló elválasztás létezik. Az egyik esetében a tömeg és a sűrűség egyfajta kombinációja alapján zajlik az elválasztás, míg a másik esetében kizárólag a sűrűség alapján.

Amint a részecskéket a centrifugálás során elkezdjük gyorsítani, és azok elkezdenek sugár irányban mozogni, a mozgó részecskére a vándorlásával ellentétes irányú, a sebességével (az itt jellemző alacsony sebességek esetében) egyenesen arányos mértékű közegellenállási erő (Fk) lép fel. Az arányossági tényező nem más, mint a közegellenállási együttható, f, amelynek értéke Stokes törvénye szerint függ a közeg viszkozitásától, és a részecske méretétől, illetve alakjától az alábbiak szerint:

6.13. egyenlet

Ahol µ a közegre jellemző viszkozitás, gömb alakú részecskék esetében r pedig a részecske sugara. Nem gömb alakú részecskék esetében r a Stokes sugár, amely egy olyan gömb alakú részecske sugara, amely azonos diffúziós viselkedésű, mint a vizsgált, nem gömb alakú részecske. Érdemes észrevenni, hogy a részecskét mozgásában akadályozó közegellenállási tényező egyenesen arányos a részecske sugarával.

A centrifugálás folyamata során a részecske sebessége csak addig nőhet, amíg a mozgással ellentétes irányú, az ülepedési sebességgel arányos, a részecskét lassító Fk erő értéke éppen eléri a részecskét gyorsító Fc erő értékét. Egy igen rövid idő elteltével a két ellentétes irányba ható erő értéke tehát megegyezik.

6.14. egyenlet

A részecske emiatt adott, rá jellemző, állandó sebességgel vándorol. (Egyébként egy másfajta gyorsító erő, de azonos jellegű közegellenállási erő hatására kialakuló analóg jelenséget láthatunk az elektroforézis esetében is.) Az előző egyenletbe behelyettesítve az Fc erőt leíró összefüggést, az alábbi egyenletet kapjuk:

6.15. egyenlet

Ha a fenti egyenletet úgy rendezzük át, hogy a részecske sebességét elosztjuk a centrifuga által létrehozott gyorsító potenciállal, akkor egy, a részecske ülepíthetőségére vonatkozó hasznos adatot kapunk. Ez az 1/s (reciprok másodperc) mértékegységű adat jellemzi, hogy egységnyi gyorsító potenciálra a részecske mekkora ülepedési sebességgel reagál. A részecske ülepíthetőségét a szedimentációs együtthatóval lehet jellemezni, amely Theodor Svedberg nyomán a Svedberg együttható elnevezést kapta:

6.16. egyenlet

Az egyenlet számlálójában szerepelnek mindazon tényezők, amelyek pozitív módon befolyásolják az ülepíthetőséget. Minél nagyobb a részecske tömege, és minél nagyobb a közeghez viszonyított sűrűsége, annál nagyobb sebességgel ülepedik egységnyi gyorsító potenciálra vonatkoztatva. Egy adott sűrűségű részecske tömege természetesen egyenesen arányos a részecske térfogatával, más szóval egyenesen arányos a részecske sugarának a harmadik hatványával.

A nevezőben szerepel az a tényező, amely negatív értelemben befolyásolja az ülepíthetőséget. Minél nagyobb a közegre és részecskére közösen jellemző közegellenállási együttható, annál kisebb sebességgel reagál a részecske egységnyi gyorsító potenciálra. Mint láttuk, a közegellenállási együttható egyenesen arányos a részecske sugarával. Mivel a gyorsító erő a részecske sugarának harmadik hatványával, míg a lassító erő a részecske sugarának csak az első hatványával arányos, így végső soron a részecske sebessége a sugár négyzetével lesz egyenesen arányos. Azonos sűrűségű részecskék esetében tehát minél nagyobb egy részecske tömege, annál gyorsabban ülepedik, mégpedig egy négyzetes összefüggés alapján. Ezt használjuk ki a differenciál centrifugálás eljárás során.

6.2.3.1. Differenciál centrifugálás: sejtfrakcionálás részecske méret alapján

Az egyes sejtalkotók sűrűsége csak kis mértékben, míg méretük nagymértékben eltér. Így, bár a fent bemutatott esetben méret és sűrűség szerint egyaránt történik elválasztás, a méret szerinti elválás dominál.

A differenciál centrifugálásnak elnevezett eljárás során az egyes sejtalkotókat Svedberg értékeik szerint választjuk el egymástól. Szeparálási lépésenként egyre nagyobb gyorsító potenciált alkalmazunk. Egy-egy szeparálási lépésben tehát azt használjuk ki, hogy azonos gyorsító potenciálra az egyes sejtalkotók Svedberg értékeiknek megfelelően, egymástól eltérő sebességgel ülepednek. Adott gyorsító potenciál esetén adott időtartam alatt egyes sejtalkotóknak szinte teljesen, míg mások csak töredéke ülepedik ki (lásd 6.4. ábra).

6.4. ábra: A differenciál centrifugálás eljárása

6.4. ábra: A differenciál centrifugálás eljárása

Differenciál centrifugálás során egymást követő centrifugálási lépéseket alkalmazunk. Az egymást követő centrifugálások rendre egyre nagyobb fordulatszámon zajlanak. Az első centrifugálásnál csak a legnagyobb tömegű, illetve legnagyobb sűrűségű sejtalkotók ülepednek ki az adott centrifugálási idő alatt. Az első lépésből származó felülúszót a második lépésben tovább centrifugáljuk, immár magasabb fordulatszámon. Ezt a sémát követve az egymást követő centrifugálásokban rendre az egyre kisebb tömegű, illetve kisebb sűrűségű sejtalkotókat ülepítjük ki.

Egy tipikus protokoll a következőképpen néz ki. A feltárt sejt homogenátumot először viszonylag alacsonynak számító, 500 g gyorsító potenciállal centrifugáljuk 10 percig. Ilyen körülmények esetén és ilyen rövid idő alatt a centrifugacsőben csak a legnagyobb Svedberg értékű részecskék, a feltáratlan sejtek, és a sejtmagok ülepednek le. Az összes többi sejtalkotó jóval lassabban ülepedik, ezért legnagyobb hányaduk még a szuszpenzióban marad.

A felülúszót áttöltjük egy másik centrifuga csőbe, és újra centrifugálunk 20 percig, de most már nagyobb sebességű centrifugában 10.000 g gyorsító potenciállal. Ilyen körülmények között, és ennyi idő alatt már kiülepednek a sejtmagnál kisebb Svedberg értékű mitokondriumok, lizoszómák és peroxiszómák, de számos komponens továbbra is a szuszpenzióban marad.

A felülúszót egy újabb csőbe áttöltve ultracentrifugában folytatjuk az ülepítést, ahol 100,000 g gyorsító potenciál alkalmazásával 1 óra alatt kiülepedik az úgynevezett mikroszóma frakció. Ez döntően a sejtfeltárás során az endoplazmatikus retikulumból lefűződő 50-150 nanométer átmérőjű vezikulákat, és egyéb ebbe a mérettartományba eső sejtalkotókat tartalmazza. A szuszpenzióban jellemzően makromolekulák, és egyes szupramolekuláris komplexek maradnak.

Még ennél is nagyobb, több százezer g gyorsító potenciál esetén kiülepíthetők a riboszómák, illetve a nagyméretű fehérjék is.

6.2.3.2. Sűrűséggradiens centrifugálás: sejtfrakcionálás részecske sűrűség alapján

A fent említett eljárás során - első megközelítésben - homogén sűrűségű közegben zajlik a centrifugálás. Fontos hangsúlyozni, hogy itt a sűrűség kifejezés a tömeg per térfogat értelemben vett sűrűséget jelenti, és nem valamely nem szaknyelvi viszkozitás jellemzőt. Mielőtt a sűrűséggradiens centrifugálás elvét ismertetnénk, érdemes megemlíteni, hogy a fent tárgyalt differenciál centrifugálásnál is alkalmazhatnak változó sűrűségű közeget, de ezekben az esetekben a sűrűséggradiens alacsony mértékű, és csak arra szolgál, hogy az egymástól éppen elváló sejtalkotók rétegei kevésbé tudjanak folyadékáramlás által összekeveredni.

A sűrűséggradiens centrifugálás során a centrifugacsőben egy olyan közeget hoznak létre, amelynek a sűrűsége a centrifugacső alja felé haladva meredeken növekszik. Ezt valamilyen nagy sűrűségű anyag, például cézium klorid (CsCl) használatával érik el. A csőbe úgy töltenek CsCl tartalmú oldatot, hogy a betöltést magas CsCl koncentrációjú oldattal kezdik, de a betöltött oldat CsCl koncentrációja a betöltött térfogat függvényében egyenletesen csökken. Az így kialakított közeg tetejére rétegezik az elválasztandó részecskéket tartalmazó oldatot (lásd 6.5. ábra).

A mintát az alacsonysűrűségű felszínre rétegezzük. A centrifugálás során a részecskék ülepedni kezdenek. A cső alja felé haladva egyre nagyobb sűrűségű közegbe kerülnek. Minden részecske csak addig ülepedhet, amíg éppen eléri azt a közeg réteget, amelynek a sűrűsége éppen megegyezik a saját sűrűségével. Ekkor a részecske nem ülepedik tovább, hiszen a lebegési faktor értéke ekkor nulla, a részecskére nem hat eredő erő. Amint elmozdulna a nála nagyobb sűrűségű közeg fel, úgy a rotor tengelye (a centrifugacső teteje) felé ható erő visszafordítaná. Amint nála alacsonyabb sűrűségű közegbe kerülne, újra ülepedni kezdene. Ez a módszer tehát mérettől függetlenül, kizárólag sűrűség alapján választja el egymástól a részecskéket.

6.5. ábra: A sűrűséggradiens centrifugálás eljárása

6.5. ábra: A sűrűséggradiens centrifugálás eljárása

Egyensúlyi módszerről van szó, amelynél az elválasztás során kialakul egy állandósult állapot. (Ebben a tekintetben ez a módszer érdekes analógiája az elektroforézis fejezetben ismertetett izoelektromos fókuszálásnak (IEF), amely ugyan teljesen más fizikai paraméter, a fehérjék izoelektromos pontja szerint, de szintén egyensúlyra vezető módon választja el térben az egyes komponenseket. Az IEF módszerben is gradienst alkalmaznak a közegben, csak ott éppenséggel a közeg pH értéke változik egy gradiens mentén.)

Érdemes megjegyezni, hogy a két fent említett centrifugálási eljárást, mivel azok némileg eltérő tulajdonságok szerint szeparálják az egyes részecskéket, a hatékonyabb izolálás érdekében kombinálni is lehet. Differenciál centrifugálást követően az egyes frakciókat tovább lehet komponenseikre választani sűrűséggradiens centrifugálással (lásd 6.6. ábra).

Differenciál-centrifugálásnál elsősorban méret, sűrűséggradiens centrifugálásnál pedig kizárólag sűrűség alapján válnak el egymástól az egyes komponensek. A differenciál centrifugálás során együtt ülepedő, de sűrűségükben egymástól eltérő komponensek ezért egy második, immár sűrűséggradiens centrifugálás során egymástól elválaszthatók. A két eljárás egymás után végrehajtva ezért nagyobb elválasztó képességet biztosít, mint az egyes eljárások önmagukban.

6.6. ábra: Az egyes sejtalkotók sűrűsége és szedimentációs együtthatója

6.6. ábra: Az egyes sejtalkotók sűrűsége és szedimentációs együtthatója

6.2.4. Fehérjék durva frakcionálása

Miután az egyes sejtalkotókat frakciónként elválasztottuk, elkezdődhet a vizsgálni kívánt fehérje tisztításának folyamata. Ennek végére a vizsgálni kívánt fehérjét homogén formában kell izolálnunk. A homogén formában történő előállításhoz rendszerint számos, egymást követő tisztítási lépésre van szükség. Egy korábban még nem izolált fehérje esetében próba-szerencse alapú kísérletezgetés alapján születik meg az adott fehérjére optimalizált izolálási „recept”.

Az egymásra épülő tisztítási lépéseknél rendszerint a kisebb hatékonyságú, de alacsony költségű, és nagy mintatérfogatok illetve fehérjemennyiségek kezelésére alkalmas eljárásokkal kezdünk. Ezeket durva frakcionálási módszereknek is szokták nevezni. Az ilyen, elsősorban oldhatóságon, centrifugáláson, szűrésen alapuló eljárásokkal már előtisztított mintát szokták különböző kromatográfiás módszerekkel tovább tisztítani.

Az egyes fehérjéket eltérő fizikai-kémiai tulajdonságaik alapján választjuk el egymástól. A fehérje saját tulajdonságai tekintetében leginkább a következő kérdések a fontosak. Milyen hőmérséklet és pH tartományban őrzi meg natív állapotát? Hol van az izoelektromos pontja? Mekkora a molekulatömege? Egy, vagy több alegységes? Ha több alegységes, akkor milyen az alegység szerkezete, mekkora a natív molekulatömege, és mekkora az egyes alegységek molekulatömege?

A hatékony izolálási eljárás kidolgozásához, a tisztítási lépések folyamatos követéséhez az is alapvető fontosságú, hogy az izolálni kívánt fehérjét más „szennyező” fehérjék jelenlétében is ki tudjuk mutatni, lehetőleg úgy, hogy egyben a mennyiségét is mérni tudjuk. Amennyiben enzimről van szó, úgy erre az enzimaktivitás mérése a legkézenfekvőbb, feltéve hogy van olyan kémiai reakció, amit az adott kiindulási mintában kizárólag az izolálni kívánt enzim katalizál.

Bizonyos feltételek teljesülése esetén (lásd később) a mért enzimaktivitás arányos lesz az esszébe bemért enzim mennyiségével. Ezáltal minden egyes tisztítási lépést követően meg tudjuk határozni, hogy a kiindulási mennyiségnek mekkora hányadát sikerült megőriznünk. A megőrzött mennyiséget elosztva a kiindulási mennyiséggel megkapjuk a kitermelés értékét.

Ha a megőrzött enzim (általánosságban célfehérje) mennyisége mellett megmérjük a minta összes fehérjetartalmát is, akkor az enzim mennyiség / összes fehérje mennyiség arányt is meg tudjuk állapítani. Ha ezt összevetjük a tisztítási lépést megelőző (vagy a kiindulási mintára jellemző) enzim mennyiség / összes fehérje mennyiség aránnyal, akkor azt is megállapíthatjuk, hogy milyen mértékben dúsult a mintánk az izolálandó fehérje tekintetében. Amennyiben a további tisztítási eljárások már nem növelik a dúsulás mértékét, az arra utalhat, hogy a mintánk már homogén, csak az izolálni kívánt enzimet tartalmazza.

Amennyiben az izolálni kívánt fehérje olyan enzim, amelyre nincs szelektív aktivitásmérő módszerünk, illetve a fehérje nem enzim, úgy a szelektív kimutatás alapja lehet egy, az adott fehérjére specifikus anyag (pl. receptor esetében a ligandum) kötődése is. Célszerű valamilyen spektroszkópiai módszerrel detektálható, például fluoreszcens csoporttal jelölt ligandumot használni.

Amennyiben specifikus ligandum sem áll rendelkezésre, úgy egyfajta általános megoldásként a ligandum helyett az izolálni kívánt fehérje ellen előállított, arra specifikus ellenanyag is használható (Western-blot eljárás). Végül, ha ilyennel sem rendelkezünk, de ismerjük az izolálandó fehérje molekulatömegét, akkor egy kevésbé specifikus, de általános módszerrel, SDS-PAGE eljárással követhetjük a tisztítás folyamatát.

A durva frakcionálási módszerek elsősorban oldhatósági és méret szerinti különbségeken alapulnak.

6.2.4.1. Oldhatóságon alapuló eljárások

A fehérjék oldhatósága alatt azt értjük, hogy az adott fehérjéből milyen mennyiséget képes az adott oldószer egységnyi térfogata oldatban tartani. Ezt leggyakrabban mg/ml mértékegységben szokták kifejezni. Az oldhatóság nagyban függ az oldószer összetételétől. Mielőtt ennek a részleteit tárgyalnánk, az oldhatóság kérdésénél fontos tisztázni, hogy natív, vagy denaturált fehérjék oldásáról van-e szó. A megértést zavaró durva leegyszerűsítés ugyanis az a hibás feltételezés, ami szerint a natív állapotú fehérje mindenképpen oldatban van, míg a denaturált fehérje mindenképpen kicsapódik az oldatból. Az alábbi ismertetésben elsőként a natív állapotú fehérjék oldhatóságáról lesz szó, később foglalkozunk a denaturálás témakörével is.

Az oldhatóság pH-függése

Leginkább az oldat pH-értéke és ionkoncentrációja befolyásolja a natív fehérje oldhatóságát. Az oldhatóság pH-függésével kapcsolatban ismert tény, hogy a fehérjék oldhatósága izoelektromos pontjuknak (IEP) megfelelő pH értéken minimális. Ez annak tulajdonítható, hogy ezen a pH értéken, a fehérjén éppen annyi negatív töltés van jelen, mint amennyi pozitív töltés. Emiatt az egyes fehérjemolekulák a lehető legkisebb mértékben taszítják egymást, miközben az azonos számú, ellentétes töltésű molekularészletek között létrejöhető molekulák közötti elektrosztatikus kölcsönhatások száma maximális (lásd 6.7. ábra).

Az izoelektromos pont alatt a fehérjének nettó pozitív, a felett nettó negatív töltése van, az adott fehérje egyes molekulái tehát az izoelektromos ponttól eltérő pH értéken inkább taszítják egymást.

A minimális oldhatósági érték természetesen nem azt jelenti, hogy egy adott fehérje összes molekulája feltétlenül kicsapódik az IEP értékkel megegyező pH értéken. Az oldhatóság értékénél alacsonyabb fehérjekoncentráción a fehérjemolekulák mind oldatban lesznek, míg e feletti koncentráción egy egyensúly alakul ki, ahol az oldhatóságon felüli hányad reverzibilisen kicsapódik az oldatból. Ez a kicsapódás nem jelent denaturációt, a nem oldható hányad is natív konformációban van. Mindenesetre amennyiben natív állapotú fehérjéket szeretnénk kicsapni az oldatból, úgy érdemes a pH értéket a kicsapni kívánt fehérje IEP értékére állítani.

6.7. ábra: A fehérjék oldhatósága pH-függő, és az izoelektromos ponton a legkisebb mértékű

6.7. ábra: A fehérjék oldhatósága pH-függő, és az izoelektromos ponton a legkisebb mértékű

Az oldhatóság függése az ionkoncentrációtól

A fehérjék oldhatósága desztillált vízben alacsonyabb, mint olyan oldószerben, amely kis koncentrációban ionokat is tartalmaz. Amennyiben egy olyan ionmentes oldathoz, amelyben oldhatóság feletti mennyiségben vannak natív fehérjék, kis koncentrációban ionokat (sót) adagolunk, azt fogjuk tapasztalni, hogy a kicsapódott natív fehérjék is oldatba kerülnek. Ezt a jelenséget „besózásnak” (angolul salting-in) nevezik (lásd 6.8. ábra). A kismennyiségben bevitt ionok tehát növelik a fehérjék oldhatóságát.

6.8. ábra: Egy határig a növekvő ionerő növeli a fehérjék oldhatóságát, ez a „besózás” jelensége

6.8. ábra: Egy határig a növekvő ionerő növeli a fehérjék oldhatóságát, ez a „besózás” jelensége

Amint azt az oldhatóság pH-függésénél is láthattuk, a fehérjék oldhatóságát csökkenti, ha a fehérjemolekulák a felszínükön lévő töltéssel rendelkező csoportokon keresztül vonzó ionos kölcsönhatásokat létesíthetnek egymással. Az oldatba kerülő kisméretű ionok ellenionként működve képesek leárnyékolni a fehérjék felszínén lévő töltéseket, és ezáltal csökkenteni a fehérjék között kialakuló ionos kölcsönhatásokat. Ez magyarázza a „besózás” jelenségét.

Amennyiben az ionok koncentrációját egy bizonyos – az adott fehérjére jellemző – érték fölé emeljük, a fehérje oldhatósága a növekvő ionkoncentráció függvényében csökkenni fog. A csökkenő oldhatóság miatt megfelelően magas fehérjekoncentráció esetén a natív fehérjemolekulák egy része csapadékba kerül.

Ezt a jelenséget „kisózásnak” (angolul salting-out) nevezik. A jelenség oka elsősorban az, hogy az oldatba vitt ionok körül hidrátburok alakul ki. Tiszta vízben a vízmolekulák koncentrációja ~55,5 M. Amennyiben az oldott ionok koncentrációja már a mólos koncentrációtartományban van, az eredetileg szabad vízmolekuláknak tetemes része kerül az ionok körül létrejövő hidrátburokba. A vízmolekuláknak ez a hányada már nem vesz részt a fehérjemolekulák oldatban tartásában. Más szóval a fehérjemolekulákat eredetileg körülvevő hidrátburok elvékonyodik, így a fehérjék közötti apoláros kölcsönhatások felerősödnek.

Kisózásra elsősorban egyértékű kationok sóit használják. Az egyik legelterjedtebb kisózásra használt só az ammóniumszulfát. Mivel a különböző fehérjék oldhatósága eltérő mértékben függ az ionkoncentrációtól, a kisózás módszerével egy fehérjekeverék frakciókra bontható.

Jó példa erre az ammóniumszulfátos frakcionálás. Amennyiben egy izolálandó fehérje oldhatósága „átlagos mértében” függ az ammóniumszulfát koncentrációjától a következő módon lehet részlegesen izolálni. A fehérjekeverék oldatához az ionkoncentrációt lassan növelve ammóniumszulfátot adagolunk egy olyan koncentráció értékig, amelyen az izolálandó fehérjénk még éppen oldatban van, míg számos egyéb „szennyező” fehérje már kicsapódik. (Az ammóniumszulfát koncentráció növelését célszerű nem szilárd anyag, hanem telitett ammóniumszulfát oldat hozzáadásával kivitelezni.)

A kicsapódott fehérjéket centrifugálással ülepítjük. Az összecsapódó fehérjékből képződő aggregátumok „részecskemérete” hatalmas, így a kicsapódott fehérjék rendkívül gyorsan ülepednek. A felülúszót megőrizzük, és tovább adagoljuk az ammóniumszulfátot, egy olyan koncentrációértékig, amelyen az izolálandó fehérjénk már - természetesen számos egyéb fehérjeféleséggel együttesen - kicsapódik. A csapadékot centrifugálással ülepítjük, a felülúszót leöntjük. Ezáltal megszabadulunk a felülúszóban maradó „szennyező” fehérjéktől. A további izolálási lépéseket a csapadék visszaoldását követően végezzük el.

Irreverzibilis kicsapási módszerek

Mint már említettük, a denaturálódás és az oldhatóság kapcsolata összetettebb annál, mint ahogyan az a köztudatban elterjedt. Natív állapotú globuláris fehérjék esetében az apoláros oldalláncok zöme a fehérje hidrofób magjában található, bár a fehérje zömmel poláros csoportokat tartalmazó felszínén is előfordulhatnak kisebb-nagyobb apoláros részletek. Amikor egy globuláris fehérje valamilyen hatásra letekeredik, az apoláros oldalláncok felszínre kerülnek. Az apoláros csoportok körül a víz alacsony entrópiájú klatrát szerkezetet hoz létre (lásd 2.5.3. fejezet). A rendszer alacsonyabb szabadentalpia szintet érhet el, ha a klatrát szerkezet megszűnik, hiszen ezáltal a rendszer entrópiája növekedhet. Amennyiben a felszínre került apoláros csoportok egymással lépnek gyenge másodlagos kölcsönhatásba, a klatrát szerkezetek száma lecsökken, a rendszer entrópiája megnő.

Tehát a termodinamikai bevezetőben más ismertetett hidrofób hatásnak nevezett termodinamikai jelenség áll annak hátterében, hogy a letekeredett fehérjék az esetek túlnyomó részében kicsapódnak az oldatból.

Megjegyzendő ugyanakkor, hogy számos közkedvelt fehérjedenaturáló szer éppenséggel ragyogó oldószere is a denaturált fehérjéknek. Ilyen az urea, vagy a nátrium-dodecilszulfát (SDS). Ezek használatakor tehát a denaturálódást nem kíséri kicsapódás.

A globuláris fehérjék denaturálása kiváltható például magas hőmérséklet (hődenaturálás), vagy extrém pH alkalmazásával. Amennyiben az izolálandó fehérjénk valamilyen kicsapódást okozó, denaturáló hatásnak az átlagosnál jobban ellenáll, például hőstabil, vagy savtűrő, úgy ez a tulajdonsága kiaknázható az izolálás során. Megfelelően magas hőmérséklet, vagy extrém pH érték alkalmazásával a „szennyező” fehérjék jó része denaturálódott állapotban kicsapódik, centrifugálással eltávolítható, míg az izolálandó fehérjénk (rendszerint más fehérjékkel együtt) oldatban marad.

6.2.4.2. Részecskeméreten alapuló durva frakcionálási módszerek

Egyes durva frakcionálási eljárások részecskeméret alapján képesek egymástól elválasztani az egyes molekulákat. Az alább ismertetett két eljárás féligáteresztő membránokon alapul. Ezek a membránok olyan „sziták” amelyekben a lyukak mérete a molekuláris mérettartományba esik. A lyukak, illetve pórusok méreténél kisebb molekulákat a membrán átengedi, míg az annál nagyobbakat visszatartja.

A dialízis eljárása során egy féligáteresztő membránból készült, csőbe töltik a mintát (lásd 6.9. ábra). A cső két végét lezárják, és az így kialakuló „zacskót” egy puffer oldatba merítik. A féligáteresztő membránon keresztül megindul mindazoknak a molekuláknak a kétirányú átdiffundálása, amelyek átférnek a membrán pórusain. Ezeknek az anyagoknak a koncentrációja a membrán két oldalán kiegyenlítődik, tehát a membránnal határolt belső térben csökken. A puffer oldat keverésével az egyensúly beállásához szükséges idő lerövidíthető.

A külső puffer oldatot néhányszor új oldatra cserélve könnyen elérhető, hogy a póruson átjutni képes oldott molekulákat vagy ionokat tökéletesen eltávolítsuk a dialízis csőből. Ezt az eljárást elsősorban arra használjuk, hogy megváltoztassuk egy fehérjeoldat ion, vagy kismolekula összetételét. Például a korábban említett ammóniumszulfátos kicsapás után a csapadékból visszaoldott fehérjék mellől dialízissel is eltávolíthatjuk a maradék ammónium és szulfát ionokat.

6.9. ábra: A dialízis eljárása

6.9. ábra: A dialízis eljárása

Az ultraszűrés során is féligáteresztő membránt használunk. A dialízissel ellentétben ennél az eljárásnál valamilyen erőhatással kényszerítjük át az oldatot ezen a membránon. A víz, és a pórusoknál kisebb oldott komponensek átjutnak, míg a pórusoknál nagyobb komponensek visszatartódnak. Megfelelő méretű pórus alkalmazásával a fehérjék két frakcióra oszthatók, az egyikbe a pórusoknál kisebbek, a másikba a pórusoknál nagyobbak kerülnek. Az említett erőhatást biztosíthatja centrifugálás (Centricon csövek), vagy valamilyen nagynyomású inert gáz (Amicon berendezések). A dialízishez képest a fő különbség abban áll, hogy a pórusoknál nagyobb, visszatartott komponensekre nézve az oldat egyben töményebbé is válik. Az ultraszűrés tehát egyben koncentrálja is a visszatartott fehérjéket.

6.2.4.3. Liofilizálás

Fehérjeoldatokat az ultraszűrésen kívül úgy is töményíthetünk, hogy az oldatból a vizet, és egyéb illékony komponenseket elpárologtatjuk. Bár elvileg a bepárlást egyszerűen az oldat melegítésével is gyorsíthatnánk, a fehérjék natív állapotban tartása szempontjából ennél kíméletesebb eljárást szoktak alkalmazni. Ilyen eljárás a fagyasztva szárítás, vagy más néven liofilizálás.

Ennek során az oldatot lefagyasztjuk, és nagyon alacsony nyomású, légritka térbe helyezzük, amelyben egy folyamatosan hűtött spirált is elhelyeznek. Az illékony anyagok a mintából szublimálnak, és ráfagynak a hűtött spirálra. A szublimálás hőt von el, és folyamatosan hűti a kifagyasztott mintát. Amennyiben kellően nagy felületen fagyasztottuk ki az oldatot, úgy elegendően intenzív ez a hűtés ahhoz, hogy a minta fagyott állapotban maradjon mindaddig, amíg az összes illékony komponens eltávozik.

A folyamat végére a fehérje szilárd halmazállapotban marad hátra az egyéb nem illékony komponensekkel együtt. Liofilizálás során figyelembe kell venni, hogy milyen nem-illékony komponensek vannak a kiindulási oldatban. Nem illékony savak vagy lúgok szélsőséges kémhatást okozhatnak a visszaoldott mintában. A liofilizálás nem csak fehérje oldatok töményítésére szolgál, de egyben kiváló módja lehet annak is, hogy egy már homogén állapotúra tisztított fehérjét szárított állapotban hosszú időkre stabilan tárolhassunk.