6.3. Kromatográfiás eljárások

A kromatográfiás eljárások során a minta két fázis között oszlik meg. Van egy úgynevezett állófázis (esetenként korlátozott mozgású fázis), és egy mozgófázis. Az állófázis leggyakrabban szilárd, a mozgófázis pedig folyadék. Ilyenkor folyadékkromatográfiás eljárásról beszélünk.

A tipikus folyadékkromatográfiás elválasztásnál az állófázis anyaga mikroszkopikus „gyöngyökből” áll. Ezeket a szemcséket egy csőbe töltik, tehát egy kromatográfiás oszlopot készítenek. A szemcséknek nagy a fajlagos felszínük. Egyes eljárásoknál a szemcsék belsejében adott méretű csatornák is vannak.

Az eljárás során, a kromatográfiás oszlopon átfolyatjuk a fehérjekeverék oldatot, majd meghatározott, egyes eljárásokban változó összetételű pufferrel mossuk le a fehérjéket az oszlopról. A fehérjék, eltérő tulajdonságaik szerint eltérő időt töltenek az állófázisban és a mozgófázisban. Minél hosszabb időt tölt el egy fehérje az állófázisban, annál lassabban halad át az oszlopon, annál később eluálódik az oszlopról.

6.3.1. Ioncserés kromatográfia

Az ioncserés kromatográfia esetében az oszlopot olyan szemcsékkel töltjük fel, amelyek felszíne töltésekkel rendelkező funkciós csoportokat hordoz. Ezek a funkciós csoportok kovalensen vannak a szemcsékre rögzítve.

Ha a funkciós csoportok negatív töltésűek, akkor a fehérjék pozitív töltésű csoportjaival képes vonzó kölcsönhatást létesíteni. Az ilyen kromatográfiát kationcserés kromatográfiának hívjuk. Ha a funkciós csoportok pozitív töltésűek, akkor a fehérjék negatív töltésű csoportjaival képes vonzó kölcsönhatást létesíteni. Az ilyen kromatográfiát anioncserés kromatográfiának hívjuk.

A 6.10. ábra a leggyakrabban alkalmazott anioncserés illetve kationcserés funkciós csoportokat mutatja be.

6.10. ábra: A kationcserés és az anioncserés kromatográfia során alkalmazott tipikus funkciós csoportok

6.10. ábra: A kationcserés és az anioncserés kromatográfia során alkalmazott tipikus funkciós csoportok

Nézzük meg az eljárás lényegét a kationcserés kromatográfia példáján keresztül (lásd 6.11. ábra).

A fehérjekeveréket a kationcserélő oszlopra töltve azok a fehérjék alkotnak többé-kevésbé stabil komplexet az oszlop negatívan töltött funkciós csoportjaival, amely fehérjék az adott pH-n rendelkeznek pozitív töltésű oldalláncokkal. Minél több ilyen oldallánc van a fehérjén, annál stabilabb lesz ez a kölcsönhatás.

Azok a fehérjék, amelyek egyáltalán nem képesek vonzó kölcsönhatást létesíteni az oszloptöltettel, egyszerűen átáramolnak az oszlopon, és az úgynevezett átfolyó frakcióban jelennek meg, gyakorlatilag akkora térfogatú frakcióban, amekkora térfogatú az eredeti fehérjeoldat volt.

6.11. ábra: Az kationcserés kromatográfia sémája.Az oszloptöltetet kialakító gyöngyök (szürke gömbök) felszínén kovalensen kötött negatívtöltésű funkciós csoportok vannak. Az egyes fehérjék (piros és kék gömbök) eltérő felszíni töltéseik miatt eltérő mértékben képesek vonzó kölcsönhatást kialakítani a gyöngyökkel, így elválaszthatók egymástól.

6.11. ábra: Az kationcserés kromatográfia sémája. Az oszloptöltetet kialakító gyöngyök (szürke gömbök) felszínén kovalensen kötött negatívtöltésű funkciós csoportok vannak. Az egyes fehérjék (piros és kék gömbök) eltérő felszíni töltéseik miatt eltérő mértékben képesek vonzó kölcsönhatást kialakítani a gyöngyökkel, így elválaszthatók egymástól.

A kötődő fehérjék e helyett az oszlop egy „szeletében” egy „korongban” kitapadnak az oszlopon (színes fehérjék esetén ez jól látható). Ez a „korong” vándorol az oszlop vége felé, ahogy a puffert áramoltatjuk. A fehérjék ilyenkor folyamatosan disszociálnak a felszínről, és némi vándorlás után újra kötődnek a felszínre. Minél erősebben kötődik egy fehérje a felszíni funkciós csoportokhoz, annál lassabban vándorol a neki megfelelő „korong”. Az egyes fehérjék „korongjai” tehát elválnak egymástól. A legegyszerűbb, úgynevezett izokratikuseljárás esetén állandó összetételű pufferrel mossuk az oszlopot. Ilyenkor az erősen kötődő fehérjék „korongja” csak nagyon nagy térfogatnyi puffer átáramoltatása után érkezik le az oszlopról.

Az elterjedtebb eljárástípusban valamilyen pufferösszetevőnek a koncentrációját fokozatosan növeljük. Egy olyan pufferösszetevőjét, amely elősegíti a fehérjék és a töltet közötti kölcsönhatás megszűnését. Ioncsere esetén a leggyakoribb megoldás egy oldott só koncentrációjának a folyamatos növelése („só-gradiens”). Az oldott ionok versengenek az elektrosztatikus kölcsönhatással. Minél stabilabban kötődik egy fehérje az oszloptöltethez, annál magasabb ionkoncentrációnál történik meg a fehérje elúciója. Egy ilyen eljárásnál azt látnánk, hogy az egyes „korongok” csak bizonyos ionkoncentráció esetén vándorolnak mérhető sebességgel az oszlopon. A gradiensnek ez az ionkoncentrációja mintegy „végigsöpri” az adott fehérjét az oszlopon. Ez az eljárás mind anioncsere, mind kationcsere esetén alkalmazható.

A másik lehetőség a pH-gradiens. Ennek során úgy változtatjuk fokozatosan az eluáló puffer pH-értékét, hogy a töltethez kötődő fehérjék fokozatosan elveszítsék a kötődést biztosító töltésüket. Anion-csere esetén a pH-t folyamatosan csökkentve a fehérjék negatív töltésű oldalláncai pKa értéküknek megfelelően fokozatosan protont vesznek fel, így elvesztik töltésüket. Kation-csere esetén a pH-értéket folyamatosan növelve a kötést biztosító pozitív töltésű fehérje oldalláncok deprotonálódnak, és semlegessé válnak.

6.3.2. Fehérjék elválasztása méret szerint: gélszűrő kromatográfia

Gélszűrés esetén a szemcsék porózus szerkezetűek, belsejüket meghatározott átmérőjű pórusok szövik át. A szemcsék anyaga olyan, hogy ahhoz éppenséggel ne kötődjenek a fehérjék másodlagos kölcsönhatásokkal. A szemcsék belseje egy korlátozottan mozgó fázis, a szemcsék közötti tér a mozgófázis (lásd 6.12. ábra).

A mintát az oszloptérfogathoz képest kicsi (1-3%) térfogatban juttatják az oszlopra. Azok a molekulák, amelyek minden póruson bejutnak, a puffer átáramoltatásakor egyaránt átjárják a szemcsék közötti, és a szemcséken belüli térrészeket is, tehát bejárják a teljes oszloptérfogatot. Ezek a molekulák tehát akkor érkeznek le az oszlopról, ha egy teljes oszloptérfogatnyi puffert átáramoltattunk.

Azok a molekulák, amelyek egyik pórusba sem tudnak bevándorolni, kizáródnak a szemcsékből, és csak a szemcsék közötti térrészt járják be. A puffer átáramoltatása során ezek a szemcsék közötti térfogatnak megfelelő puffer-mennyiség átáramlásakor, tehát hamarabb leérkeznek az oszlopról. Azok a molekulák, amelyek a két említett szélső mérettartomány között vannak, köztes puffer térfogatoknál érkeznek le.

6.12. ábra: A gélszűrő kromatográfia méret szerint választja el a molekulákat

6.12. ábra: A gélszűrő kromatográfia méret szerint választja el a molekulákat

6.3.3. Reverz-fázisú kromatográfia: fehérjék elválasztása hidrofób jelleg alapján

A kromatográfia kezdetén az oszloptöltetek, tehát a szemcsék hidrofil anyagból voltak. Ilyenek volt például a különböző szilikátok. Ezeken választottak el molekulákat eltérő adszorpciós képességük alapján. Gyakran kis szerves molekulákat választottak el, amelyeket apoláros oldószerekben oldva vittek az oszlopra.

Később kémiai módosításokkal, tipikusan hosszú alkil láncokkal befedték az eredetileg poláros felszínt. Ezek a nagy alkil csoportok a hidrofób hatás révén képesek vízből hidrofób felületű molekulákat megkötni. Az eredeti fázisok elrendezése tehát megfordult, innen a „fordított fázis” elnevezés.

A fehérjék ugyan alapvetően poláros felszínűek, de a legtöbb fehérje felületén vannak kisebb-nagyobb apoláros „foltok” is. Ha ezeket a vízben oldható fehérjéket fordított fázisú oszlopra visszük, a fehérjék a hidrofób hatás miatt hidrofób felszínükkel a szemcsék hidrofób felületére tapadnak. Amennyiben az oldatban gradiens-szerűen növeljük valamilyen apoláros részt is tartalmazó oldószer (például acetonitril) koncentrációját, úgy az versengeni fog a hidrofób felszínekért, és a fehérjék rendre eluálódnak.

Számos fehérje esetében jól működik a fenti eljárás, de sok fehérje túl stabilan kötődik a nagy alkil-csoportokhoz, esetleg denaturálódva kötődik, vagy az eluáláshoz használt szerves oldószer hatására denaturálódik. Ezért dolgozták ki a hidrofób interakciós kromatográfiát. Ennél azt használják ki, hogy magas ionerőn erősebb a hidrofób hatás. Így a fehérjék kisebb méretű hidrofób csoportokhoz is stabilan kötődnek. Az elúcióhoz nem kell szerves oldószert alkalmazni, elegendő csökkenteni a puffer ionkoncentrációját.

6.3.4. Affinitás-kromatográfia

Számos olyan fehérje ismert, amely biológiai szerepe kapcsán nagy szelektivitással kötődik egyetlen másik fehérjéhez, vagy éppen kismolekulához. A receptorok például szelektíven kötődnek a megfelelő hormonhoz, az enzimek a szubsztrátjukhoz, stb. Az affinitás-kromatográfia során az ilyen nagy szelektivitású molekuláris felismerést aknázzuk ki. A komplexet képző molekulák közül az egyiket az oszlop szemcséihez rögzítjük, és így egyetlen elválasztási lépésben sikeresen izolálható a szelektív kötőpartner akár hatalmas feleslegben lévő egyéb fehérjék keverékéből (lásd 6.13. ábra).

6.13. ábra: Az affinitás-kromatográfia szelektív molekuláris felismerés alapján választ el egyetlen molekula típust nagyszámú „szennyező” molekulától

6.13. ábra: Az affinitás-kromatográfia szelektív molekuláris felismerés alapján választ el egyetlen molekula típust nagyszámú „szennyező” molekulától