6.4. Elektroforetikus eljárások

6.4.1. Az elektroforézisről általánosságban

Elektroforézis során egy-egy elektród külön-külön egy-egy puffer tartályba merül, és a két puffer tartály között töltött részecskék számára átjárást biztosítunk (lásd 6.14. ábra). Ha a két elektród között egy elektromos tápegységgel elektromos potenciálkülönbséget, tehát feszültséget hozunk létre, akkor ennek hatására elektronok áramlanak a tápegységen keresztül az anód felől a katód felé. A katódra kerülő elektronokat a pufferben lévő vízmolekulák veszik fel, hidrogén gáz és hidroxidionok keletkeznek. Az anódon eközben vízmolekulák adnak le ugyanannyi elektront, mint amennyi a katódról levált, oxigén gáz keletkezik, és protonok (illetve ezek víz molekulákra kerülésével hidroxónium ionok) keletkeznek. A két puffer tartály között töltött részecskék számára átjárást biztosító összeköttetésen a pozitív töltésű ionok (kationok) a negatív töltésű katód felé, a negatív töltésű ionok (anionok) pedig a pozitív töltésű anód felé vándorolnak. Az egyes ionok eltérő töltésük és méretük miatt eltérő sebességgel vándorolnak, tehát így elválaszthatók egymástól. A vándorlás sebességét befolyásoló legalapvetőbb fizikai összefüggések ismerete rendkívül fontos annak megértéséhez, hogy az egyes konkrét elektroforézis eljárások esetében az egyes molekulák miért lesznek eltérő sebességűek, milyen elven választhatók el egymástól.

6.14. ábra: Az elektroforézis alapelve

6.14. ábra: Az elektroforézis alapelve

Az elektroforézis során a töltéssel rendelkező testre Fe elektromos erő hat, amelynek értéke egyenlő a „q” töltés és az „E” elektromos térerő szorzatával:

6.17. egyenlet

Az E elektromos térerő mértékegysége (newton/coulomb), illetve (volt/cm). Az elektroforézisek egyik fő paramétere az alkalmazott elektromos térerő, amit volt/cm értékben adnak meg.

A vándorló részecskére kis sebesség esetén a sebességgel (v) egyenesen arányos mértékű, a vándorlás irányával ellentétes irányú Fk közegellenállási erő hat:

6.18. egyenlet

A közegellenállási erő nagysága a közegre és a testre vonatkozó információkat egyaránt tartalmazó közegellenállási együtthatóval (f) fejezhető ki. Minél nagyobb a részecske, és minél „akadályozóbb” a közeg, annál nagyobb az f értéke.

Az elektroforézis elindításakor a részecske (pillanatszerűen rövid idő alatt) arra a sebességre gyorsul, amelynél a közegellenállási erő értéke éppen eléri az ellentétes irányú elektromos erő értékét:

6.19. egyenlet

A részecskére ható eredő erő ekkor nulla, tehát a részecske innen egyenletes sebességgel halad (Fe = Fk, tehát Feredő = 0).

6.20. egyenlet

A részecske elektroforetikus mozgékonysága (μ) megmutatja, hogy az adott részecske (adott közegben) egységnyi térerő esetén mekkora sebességgel vándorol. Ez egyenesen arányos a töltésével, és fordítottan arányos az adott közegre és a részecskére együttesen jellemző közegellenállási együtthatóval.

Az eltérő mozgékonyságú töltött részecskék elektroforézis során egymástól elválaszthatók, hiszen azonos közegben azonos elektromos térerő alkalmazásával eltérő sebességgel vándorolnak.

A biokémiai és molekuláris biológiai vizsgálatoknál a töltéssel rendelkező makromolekulák közül leginkább a fehérjék és a nukleinsavak elválasztásához alkalmazzák az elektroforézis elvét. Minden esetben valamilyen térhálós gélben zajlik az elektroforézis, ezért ezeket az eljárásokat összefoglalóan gélelektroforézis eljárásoknak nevezzük.

Az elektroforézis fent említett elve önmagában nem követeli meg, hogy annak során valamilyen gélt is alkalmazzunk. A kezdetek kezdetén nem is alkalmaztak géleket. A töltéssel rendelkező részecskéket homogén folyadékfázisban vándoroltatták. Ezzel az eljárással alapvetően három probléma adódott.

Az egyik, hogy a közönséges folyadékok az eltérő méretű ionok mozgását ugyan eltérő mértékben akadályozzák, de ez az eltérés igen kismértékű, tehát az elválasztás nem hatékony. A másik probléma azzal kapcsolatos, hogy egyszerű folyadékfázis esetén a folyadékfázisban akár kis hőmérsékletkülönbségek hatására is áramlások indulnak el, amelyek rontják az elválasztást. A harmadik probléma, hogy folyadék-fázisban minden irányban jelentős a diffúzió mértéke, ami szintén rontja az elválasztás hatékonyságát.

Mindhárom problémára megoldást kínál a térhálós gélek alkalmazása. Az ionokat nem homogén puffer közegben vándoroltatjuk, hanem egy olyan puffer közegben, amelyet valamilyen térhálós gél „sző át”. Ez a gél megakadályozza a folyadékáramlás kialakulását, és az egyszerű folyadékfázishoz képest lényegesen nagyobb mértékben akadályozza a részecskék mozgását, ezáltal csökkenti a diffúzió mértékét. Mindezek mellett az elválasztás hatékonysága szempontjából a gél legfontosabb szerepe az, hogy a vándorló részecskék méretétől függően radikálisan eltérő mértékű akadályt jelent. Az adott térhálós gélre jellemző átlagos pórusméretnél nagyobb részecskék a gélben gyakorlatilag nem vándorolnak, azokat tehát visszatartja. A pórusméretnél jóval kisebb részecskék számára a gél „érzékelhetetlen” vagyis ezekre csak a pufferoldatra jellemző közegellenállás érvényesül. A két szélsőérték közötti részecskeméret tartományban azonban a gél erősen méretfüggő módon lassítja a részecskék vándorlását. Ebből következik, hogy egy-egy konkrét gél csak egy–egy konkrét részecskeméret tartományban használható, tehát minden konkrét feladathoz tartozik egy optimális pórusmérettel rendelkező gél.

Az elektroforézis során alkalmazott géllel szemben a következő általános követelmények merülnek fel. Legyen vízzel nedvesedő, kémiailag stabil (ne lépjen kémiai reakcióba az elektroforézis során), ne hordozzon töltéseket (ne viselkedjen ioncserélőként), legyen fizikailag ellenálló, legyen átlátszó, ne festődjön az elválasztott anyagok kimutatására használt festékkel, s legyen szabályozható a pórusmérete.

Nem ismerünk olyan anyagot, amely a molekuláris biológia által vizsgált igen nagy részecskeméret tartományt önmagában átfedné, tehát olyat, amelyből szélsőségesen eltérő pórusméretű géleket lehetne készíteni. A molekuláris biológiai vizsgálatokban alapvetően kétféle anyag vált be, amelyek megfelelnek a fenti kritériumoknak. Az egyik a poliakrilamid, a másik az agaróz. A poliakrilamid gélben az akrilamid gyökös polimerizációjával keletkező poliakrilamid szálakat kovalens kötések kötik össze. Az agaróz gélben ezzel szemben a poliszacharid láncok között másodlagos kötőerők alakulnak ki. A poliakrilamid gélek pórusmérete viszonylag kicsi, ezért ezt a gélt elsősorban fehérjék és kisebb nukleinsavak elválasztásánál alkalmazzák. Az agaróz gélek pórusmérete sokkal nagyobb, ezért elsősorban nagyméretű nukleinsavak elválasztására használják. A továbbiakban az egyes poliakrilamid alapú eljárásokat tekintjük át.

6.4.2. A poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE)

6.4.2.1. A PAGE módszerről általánosságban

Amint azt már említettük, a poliakrilamid gélt kisebb nukleinsavak elválasztásánál is alkalmazzák. A Sanger-féle DNS-szekvenálás esetében például ezzel a módszerrel választják el egymástól az eltérő hosszúságú, lineáris, egyszálú DNS molekulákat. Az eljárás felbontása a néhányszor 10-bázis hossztól a nagyjából 1000 bázis hosszúságig terjedő mérettartományban olyan nagy, hogy képes az egymástól csak 1-1 bázis hosszal eltérő molekulákat is elválasztani. DNS esetében tehát egyértelműen a lánc hossza szerint zajlik az elválasztás. Ennek az az oka, hogy a DNS (és RNS) estében az egységnyi molekulatömegre (polimer-hosszra) eső negatív töltések száma, vagyis a relatív töltés azonos. Ez annak köszönhető, hogy minden monomer egység tartalmaz egy foszfátcsoportot, ami a negatív töltést hordozza. Megfelelő denaturálószer (pl. urea) alkalmazása mellett a lineáris molekulák alakja is azonos lesz. Így kizárólag a denaturált molekula mérete szerint válnak majd el egymástól. (Ugyanezt látjuk majd az SDS-PAGE esetében fehérjék vonatkozásában, lásd később). A PAGE módszernek azonban számos olyan változata van (SDS-PAGE, izoelektromos fókuszálás, 2D PAGE), amelyek elsősorban fehérjék különböző tulajdonságok szerinti elválasztására alkalmas.

A különböző fehérjék egy adott pH értéken más-más töltéssel rendelkeznek. Ráadásul az egyes fehérjék mérete és alakja is eltérő. Ha vizes oldatban elektromos erőtér alkalmazásával a fehérjéket vándorlásra késztetjük, az egyes fehérjék eltérő töltésük, méretük és alakjuk miatt különböző sebességgel mozognak, és ez alapján egymástól elválaszthatók. Mivel az elválasztás egyszerre többféle elven zajlik, ezért ugyan nagyhatékonyságú, de pusztán egy-egy elválasztás alapján nem tudjuk meghatározni, hogy egy adott fehérje miért vándorol gyorsabban egy másiknál: elsősorban azért, mert nagyobb a töltése, vagy azért, mert kisebb a mérete. A fent már említett, később ismertetendő PAGE változatokat éppen azért fejlesztették ki, hogy a fehérjék kizárólag méret, vagy éppenséggel kizárólag izoelektromos pont alapján váljanak el (lásd később).

A poliakrilamid gél létrehozása: az akrilamid vizes oldatban, megfelelő katalizátorok és iniciátorok jelenlétében gyökös polimerizációra képes, és a reakció során nagy molekulatömegű, lineáris polimer, ún. poliakrilamid keletkezik. Mivel az akrilamid rákkeltő és mutagén, alkalmazásánál megfelelő óvatosság szükséges. A polimer forma azonban már nem mérgező. Ez utóbbi vizes oldata nagy viszkozitású. Ha megfelelő keresztkötő ágenst, N,N’-metilénbiszakrilamidot is alkalmazunk, a hosszú poliakrilamid láncok között "hidak" képződnek, és térhálós szerkezetű gél jön létre (lásd 6.15. ábra). Az elektroforézis során az ionokat (nukleinsavakat vagy fehérjéket) ebben a gélben vándoroltatjuk.

Mint arról már szó esett, az eljárás különlegesen nagy felbontóképességgel rendelkezik, a gélben a molekulák sebességére töltésük, méretük, illetve alakjuk is befolyással bír. A gél méret szerinti „molekulaszűrő” hatását a gél átlagos pórusmérete szabja meg. A pórusméret az akrilamid monomer koncentrációjának és a térhálósító metilénbiszakrilamid százalékos arányának alkalmas megválasztásával tág határok között változtatható. A gél mechanikus tulajdonságai kb. 4-20% akrilamid koncentráció-tartományban kedvezőek. A keresztkötő metilénbiszakrilamid mennyisége az alkalmazott akrilamid monomernek rendszerint 1-3%-a. A poliakrilamid rendelkezik mindazon már említett tulajdonságokkal (hidrofil, nem hordoz töltéseket, kémiailag stabil), amik az elektroforézis során előnyösek. Ezeken felül további fontos tulajdonsága, hogy az elválasztandó fehérjékkel nem lép semmilyen fehérje-specifikus kölcsönhatásba, és nem zavarja a fehérjék detektálására szolgáló festési reakciókat sem. Ha az elektroforézist natív (nem-denaturáló) közegben, alacsony hőmérsékleten végezzük, számos enzim megőrzi natív szerkezetét és így enzimaktivitását, ami alapján ezek a gélben specifikusan kimutathatók.

6.15. ábra: A térhálós poliakrilamid gél kialakulása

6.15. ábra: A térhálós poliakrilamid gél kialakulása

Gélkészítés során az igényszerinti koncentrációjú akrilamid / metilénbiszakrilamid oldathoz megfelelő pH értékű pufferoldatot keverünk, majd a gyökös polimerizációt egy alkalmas katalizátor és iniciátor hozzáadásával indítjuk el. A katalizátor általában peroxidszulfát, mely vizes közegben spontán bomlik, ami által szabad gyökök keletkeznek. Ezek a szabad gyökök azonban önmagukban nem képesek az akrilamid molekula kettős kötését felhasítva elindítani a gyökös polimerizációt, viszont gerjesztik az iniciátor molekulákat. Ez utóbbiakból ekkor olyan szabad gyökök alakulnak ki, amelyek már kiváltják a polimerizációt. A leggyakrabban használt iniciátor a tetrametil-etilén-diamin (TEMED). A katalizátor és az iniciátor koncentrációját úgy választjuk meg, hogy a polimerizáció, így a gélesedés 10-30 perc alatt teljes mértékben végbemenjen.

Az elektroforézis "geometriája" szerint kétféle eljárás használatos. Az elsőként kidolgozott módszer esetében a pufferrel, katalizátorral, iniciátorral összekevert akrilamid / metilénbiszakrilamid oldatot egy az egyik végén lezárt üvegcsőbe öntik. Az így létrejövő géloszlopban csak egyetlen mintát lehet futtatni. A jelenleg elterjedt eljárásokban a fent említett oldatot két, egymással párhuzamos üveglap közé töltjük (lásd 6.16. ábra). Így egy gél lemez alakul ki, amelyben egyidejűleg, egymás mellett, azonos körülmények között számos mintát futtathatunk, melyek ily módon egymással könnyen összehasonlíthatók. Ez nagyban megkönnyíti az elektroforézis eredményének kiértékelését.

Az elektroforézis sikerét döntő mértékben befolyásolja a gél akrilamid koncentrációja és a pH helyes megválasztása. Fehérjék esetén rendszerint az izoelektromos pontnál magasabb pH-n dolgozunk. Ekkor a fehérjék negatív töltésűek, így az anód felé vándorolnak. A puffer szerepe nemcsak abban áll, hogy az elektroforézis ideje alatt a pH-t állandó értéken tartja, hanem a puffer ionjai végzik az áram vezetés legnagyobb részét is. Normális esetben a fehérjeionok az áram vezetésében csak elhanyagolható mértékben vesznek részt, vagyis a fehérjék átviteli száma kicsi. Ha azonban a puffer koncentrációja túl alacsony, megnő a fehérjék szerepe az áram vezetésében, ami általában elkenődött fehérjesávokat eredményez. Az optimálisnál magasabb puffer koncentráció esetén viszont túl kicsi lesz a fehérjék mobilitása, ami szintén rontja az elválasztás minőségét, mivel a megnövekedett időigény miatt a diffúzióra is több idő jut.

6.16. ábra: A vertikális elrendezésű poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE).A natív PAGE eljárás során a fehérjék mérete és töltése egyaránt befolyásolja a vándorlás sebességét, míg az SDS PAGE eljárás a fehérjéket kizárólag méret szerint választja el egymástól.

6.16. ábra: A vertikális elrendezésű poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE). A natív PAGE eljárás során a fehérjék mérete és töltése egyaránt befolyásolja a vándorlás sebességét, míg az SDS PAGE eljárás a fehérjéket kizárólag méret szerint választja el egymástól.

Az alkalmazott puffer rendszerek szempontjából a gélelektroforetikus technikákat két nagy csoportba oszthatjuk. Folytonos (kontinuus)puffer rendszerről beszélünk, amikor ugyanazt a puffert alkalmazzuk a gélben, mint az elektródokat tartalmazó puffer-tankokban. Ennek a módszernek az előnye az egyszerűségében rejlik, viszont a felbontóképessége valamivel rosszabb, mint a bonyolultabb ún. diszkontinuus puffer rendszereké.

A diszkontinuus elektroforetikus technikák két különböző koncentrációjú gélt, és három különböző puffer rendszert alkalmaznak. A futtató (más néven szeparáló) gél fölé egy ún. koncentráló (más néven: tömöritő) gélt polimerizálunk. Ennek akrilamid koncentrációja a futtató gélénél jóval alacsonyabb, olyannyira, hogy itt a molekulaszűrő hatás még nem érvényesül. A három különböző puffer rendszerben két különböző aniont alkalmaznak. Mindkét gélben a puffer anion komponense egy erős sav maradéka, melynek disszociáció foka gyakorlatilag nem függ a közeg pH-jától, vagyis töltése széles pH tartományban állandó. Ez a komponens általában a kloridion. Tank pufferként viszont olyan puffer rendszert alkalmaznak, melynek anion komponense egy gyenge sav savmaradéka, pl. glicinát-anion. A tankpufferben a pH 8,3.

A kistérfogatú fehérjemintát a koncentráló gél felszínére rétegezzük. Feszültség hatására a fehérjeionok és a tank puffer anionjai belépnek a koncentráló gélbe. A koncentráló gélben a pH 6,8, ami alig magasabb, mint a glicin izoelektromos pontja (6,5). Ilyen pH-n a glicin molekula csak parciálisan negatív (az idő nagy részében nettó semleges ikerionos állapotban van), elektroforetikus mobilitása alacsony, így lokálisan csökken a töltéssel rendelkező molekulák koncentrációja. Ez helyileg megnöveli az elektromos ellenállást. Minthogy az elektromos körben az áramerősség állandó kell, hogy legyen, (nincs makroszkopikus töltésszétválás), Ohm törvényének megfelelően az ellenállással arányosan megnő a térerő is, ezért a fehérjék vándorlása felgyorsul, amíg el nem érik az ionokban gazdag, kis elektromos ellenállású kloridion frontot. Minthogy a kloridion frontban az ellenállás, és így a térerő kicsi, a fehérjék sebessége csökken, és a front mögött mintegy összetorlódva igen vékony sávban vándorolnak a futtató gél felszínéig.

A futtató, vagy más néven szeparáló gélben a helyzet megváltozik. A szeparáló gél pH értéke 8,8-9,0 között van. Ezen a pH-n a glicinben lévő aminocsoportok egy része elveszti az extra protonját, így elveszti a pozitív töltését. A glicinát-ion parciális negatív töltése emiatt megnő, ezért mobilitása is megnövekedik. Így a glicinát töltéshiányából eredő koncentráló hatás megszűnik, a fehérjék a továbbiakban különböző töltésük miatt eltérő sebességgel vándorolnak. Ráadásul a futtató gél akrilamid koncentrációját már úgy választjuk meg, hogy a molekulaszűrő hatás is érvényesüljön, és a gél az elválasztani kívánt fehérjék mérettartományában a lehető legnagyobb mértékben szeparáljon méret szerint is.

Az elektroforetikus eljárások többségénél a futtatás során jelzőfestéket alkalmazunk, amit a mintába keverünk. Ez a kis molekulatömegű, negatív töltésű festék rendszerint gyorsabban vándorol a gélben, mint az elválasztandó makromolekula-ionok (pl. fehérjék). A festék mintegy láthatóvá teszi a futási frontot, így egyértelművé válik, mikor tekinthető az elválasztás befejezettnek. A leginkább használatos jelzőfesték a brómfenolkék.

A továbbiakban ismertetjük az egyes PAGE eljárásokat, a legegyszerűbbtől az egyre összetettebb felé haladva.

6.4.2.2. Natív-PAGE

A natív-PAGE fehérjék elválasztására szolgáló eljárás. Ennek során igyekszünk olyan körülmények közepette vándoroltatni a fehérjéket, hogy azok megtartsák natív térszerkezetüket. Az elektroforézist tehát nem-denaturáló közegben, és rendszerint alacsony hőmérsékleten végezzük. Ilyen körülmények között számos enzim megőrzi natív szerkezetét és így enzimaktivitását. Ezáltal ezek az enzimek a gélben specifikusan kimutathatók még akkor is, ha nagyon nagy mennyiségben vannak jelen más fehérjék is. Egy ilyen „festési” eljárás során a gélt egy olyan szubsztrát oldatába áztatjuk, amelyet a kimutatni kívánt enzim szelektíven alakít át, és amelynek terméke színes és oldhatatlan. Így ahol a gélben az adott enzim megtalálható, ott annak helyét színes csapadék jelzi.

Ezen felül a natív-PAGE kiválóan alkalmas arra is, hogy egy olyan, alaposan megtisztított fehérjepreparátum esetén, amely csak egyetlen fehérjét tartalmaz, megnézzük, hogy az valóban homogén-e. Egyetlen éles csíkot csak akkor kaphatunk, ha a fehérjénk homogén. Amennyiben a tisztítás során a fehérjemolekulák egy része kémiailag módosult, (pl. dezaminálódott, vagy diszulfidhíd átrendeződésen ment át), esetleg aggregálódott, úgy egynél több csíkot kapunk. A natív-PAGE arra is kiválóan alkalmas, hogy detektáljuk vele két vagy több fehérjekomponens egymással alkotott komplexének kialakulását. A kovalens kötésekkel, vagy éppen másodrendű kölcsönhatásokkal létrejövő alegységszerkezet, vagy két önálló fehérje (pl. enzim-inhibitor, receptor-ligandum) között kialakuló komplex ugyanis a natív elektroforézis során stabilan együtt marad, együtt vándorol.

A natív elektroforézisek során különösen ügyelni kell arra, hogyan viszonyul egymáshoz a gélben alkalmazott puffer pH értéke és az elválasztani kívánt fehérje, vagy fehérje-komplex izoelektromos pontja, hiszen ez szabja meg a fehérje vándorlási irányát.

6.4.2.3. SDS-PAGE

Az SDS-PAGE is fehérjék elválasztására használt módszer, csakhogy itt a fehérjéket denaturált állapotukban vándoroltatjuk. Az általános bevezetőben leírtak szerint a hagyományos (natív) akrilamid-gélelektroforézis során a szeparáció a fehérjék töltésétől, alakjától és méretétől egyaránt függ, ezért első megközelítésben nem alkalmas pl. fehérje molekulatömeg meghatározásra. Arra sem ad választ, hogy egy már tisztított mintában lévő fehérje több alegységes-e, hiszen natív körülmények között az alegységek együtt maradnak. Ezen kérdések megválaszolására a poliakrilamid gél elektroforetikus technikák leginkább elterjedt válfaja, az SDS poliakrilamid gélelektroforézis bizonyult alkalmasnak (lásd 6.17. ábra).

Az SDS (sodium-dodecyl-sulphate) egy anionos detergens. Ha a fehérjemintát SDS-sel és diszulfidhidakat bontani képes redukáló szerrel kezeljük magas hőmérsékleten, radikális konformációváltozások következnek be. A fehérjék közötti kölcsönhatások megszűnnek, az alegység szerkezet felbomlik, a fehérjék denaturálódnak. Az SDS mintegy "kitekeri" a fehérjéket, apoláros részével azok belső, hidrofób magját fellazítja, és mivel anionos detergens, a fehérjéket negatív töltésekkel látja el.

6.17. ábra: Az SDS-PAGE eljárás méret szerint választja el a fehérjéket

6.17. ábra: Az SDS-PAGE eljárás méret szerint választja el a fehérjéket

A kötődött SDS mennyisége nagyjából független a polipeptidlánc szekvenciájától, ellenben egyenesen arányos a lánc hosszával, vagyis a fehérjék molekulatömegével. Ez más szóval azt jelenti, hogy az SDS kezelés után az összes fehérje relatív töltése nagyjából azonos lesz. Ráadásul a kezelés hatására az egyes fehérjék alakja is hasonlóvá válik. A negatív töltésű SDS molekulák taszítják egymást, ezért az SDS-kezelt fehérjék valószínűleg közel rúd alakúak lesznek. Mindez azt eredményezi, hogy az egyes fehérjék ugyanolyan módon lesznek kizárólag méretük szerint elválaszthatók, ahogy korábban azt a lineáris egyszálú (denaturált) DNS molekulák PAGE elválasztása során már láttuk. A bevezetőben említett három tulajdonság (relatív töltés, alak, méret) szerinti szeparálás helyett ugyanis itt is csak méret szerinti szeparáció történik. Mivel a molekulaméret arányos a molekulatömeggel, az SDS poliakrilamid gélelektroforézis végső soron molekulatömeg szerint szeparál.

Ez a legelterjedtebb, legolcsóbb módszer a fehérjék alegység molekulatömegének viszonylag pontos meghatározására. A tapasztalat szerint a fehérje relatív mobilitása (a fehérje futási távolsága osztva a jelzőfesték futási távolságával) a fehérje molekulatömeg logaritmusának függvényében monoton csökken. Ha a mintánkat ismert molekulatömegű fehérjékkel azonos gélben futtatjuk, a standard fehérjék futása alapján készített kalibráló egyenesről a mintában lévő fehérjék alegység molekulatömege leolvasható (lásd 6.18. ábra)

A 6.2. táblázat azt mutatja, hogy különböző akrilamid koncentrációjú gélek esetén milyen mérettartományban teljesül a relatív mobilitás és a molekulatömeg logaritmusa között előbb említett összefüggés.

6.18. ábra: Ismeretlen fehérje molekulatömegének meghatározása SDS-PAGE eljárással készített kalibrációs egyenes alapján

6.18. ábra: Ismeretlen fehérje molekulatömegének meghatározása SDS-PAGE eljárással készített kalibrációs egyenes alapján

6.2. táblázat: Az egyes akrilamid gélkoncentrációk eltérő fehérjeméret-tartományokhoz ideálisak

6.2. táblázat: Az egyes akrilamid gélkoncentrációk eltérő fehérjeméret-tartományokhoz ideálisak

Az SDS poliakrilamid gél elektroforézis a leginkább elfogadott módszer annak eldöntésére, hogy egy fehérje, ill. enzimpreparátum homogén-e. Különösen jól alkalmazható bonyolultabb fehérje-asszociátumok, multienzim komplexek vizsgálatára. A denaturáló SDS-PAGE során ezek a komplexek alkotóikra esnek szét, és az egyes polipeptidláncok külön-külön vándorolnak a gélben. A fehérjék gélben történő megfestésével mennyiségi meghatározásra is lehetőség nyílik, így nem csak azt lehet megállapítani, hogy egy alaposan megtisztított, sokkomponensű komplex hányféle alegységből áll, de meg lehet határozni az egyes alegységek számának egymáshoz viszonyított arányát is.

6.4.2.4. Izoelektromos fókuszálás

Izoelektromos fókuszálás során olyan körülményeket teremtünk, hogy a fehérjék kizárólag az izoelektromos pontjukalapján váljanak el egymástól (lásd 6.19. ábra). Az eljárás azon alapul, hogy a fehérjéken lévő, proton leadásra illetve felvételre képes csoportok disszociációs állapota függ a környezetük pH értékétől (lásd Henderson-Hasselbalch egyenlet). A fehérjék nettó töltése tehát függ a közeg pH értékétől. Amennyiben egy fehérjén a savas oldalláncok (Asp, Glu) száma meghaladja a bázikus (Arg, Lys, His) oldalláncok számát, úgy a fehérje semleges közegben negatív töltésű lesz, izoelektromos pontja (IEP), vagyis az a pH érték, amelyen a fehérje eredő töltése nulla, a savas tartományba esik. Az ilyen fehérjéket savas fehérjéknek is nevezzük. Amikor a fehérje bázikus oldalláncainak a száma múlja felül a savas oldalláncok számát, akkor semleges közegben a fehérje pozitív töltésű lesz, izoelektromos pontja a bázikus pH tartományba esik. Ezeket a fehérjéket bázikus fehérjéknek is szokták nevezni.

6.19. ábra: A fehérjék izoelektromos fókuszálása

6.19. ábra: A fehérjék izoelektromos fókuszálása

Mivel az eltérő fehérjék IEP értéke igen széles tartományt fed le (lásd 6.3. táblázat), ezért az izoelektromos pont alapján történő elválasztás hatékony módszer.

Ha a közeg pH értéke alacsonyabb, mint a fehérje IEP értéke, akkor a fehérje pozitív töltésű lesz, és a katód felé vándorol. Ha a közeg pH értéke magasabb, mint a fehérje IEP értéke, akkor a fehérje töltése természetesen negatív lesz, és a fehérje az anód felé vándorol. Ha a pH értéke éppen megegyezik a fehérje IEP értékével, akkor a fehérje nettó töltése nulla, ezért elektroforézis során nem vándorol.

Amennyiben olyan közegbe helyezzük a fehérjét, amelyben a pH a katód és az anód között fokozatosan (gradiens mentén) változik, úgy a fehérje elindul a vele ellentétes töltésű pólus felé. A pozitív töltésű anódnál alacsony pH értékű közeget, a negatív töltésű katódnál magas pH értékű közeget hoznak létre.

6.3. táblázat: A fehérjék izoelektromos pontja nagyon széles tartományt fed le

6.3. táblázat: A fehérjék izoelektromos pontja nagyon széles tartományt fed le

Miközben a fehérje a változó pH értékű közegben vándorol, a töltése is változni fog. Ha negatív töltésűként az anód felé vándorol, úgy az egyre savasabb közegben egyre több protont vesz fel egészen addig, míg a rajta lévő negatív és pozitív töltések száma megegyezik, vagyis eléri az izoelektromos pontját. Ekkor a fehérjére nem hat eredő elektromos erő, ezért nem vándorol tovább. Ha a spontán diffúzió miatt mégis közelebb kerül az anódhoz, akkor újabb protonok felvétele miatt pozitív töltésűvé válik, és visszafelé vándorol a katód felé. Ugyanilyen gondolat mentén, ha az adott fehérje pozitív töltésűként a katód felé vándorolt, akkor az egyre magasabb pH értékű tartományon át haladva fokozatosan protonokat ad le, míg eléri izoelektromos pontját, és megáll. Ha diffúzióval közelebb kerül a katódhoz, akkor protonokat ad le, és az elektromos erő újra az anód felé vándoroltatja. Tehát a fehérjék mindegyike a saját IEP értékének megfelelő pH értékű gél-tartományba fókuszálódik, a fehérjék IEP értékük alapján válnak el egymástól (lásd 6.20. ábra). A fenti folyamatok logikájából következik, hogy érdektelen, hogy a fehérjét a gél mely pontján visszük a rendszerbe, ettől függetlenül „megtalálja” az IEP értékének megfelelő pontot.

6.20. ábra: Az izoelektromos fókuszálás fizikokémiai alapelve

6.20. ábra: Az izoelektromos fókuszálás fizikokémiai alapelve

Az eljárás meghatározó eleme, hogy egy - lehetőleg lineáris - gradiens szerint változó pH értéket hozzunk létre a gélben. Erre két módszer ismeretes. Az egyik az amfolit hordozók alkalmazása. Az amfolit kifejezés az amfoter elektrolit kifejezés rövidítése. Az amfolitok olyan kis szerves molekulák, amelyeken egyszerre vannak jelen gyenge savas és gyenge bázikus csoportok. Ezeknek az anyagoknak az eredő töltése is a pH függvénye.

Az izoelektromos fókuszálás során olyan amfolitokból készítenek keveréket, amelyek IEP értéke egymástól csak kismértékben tér el, és együttesen átfednek egy bizonyos IEP tartományt. Ezt a keveréket a gélbe juttatják, és létrehozzák a gélben az elektromos teret. Ekkor a fehérjékre már említett folyamat zajlik le. Minden amfolit elindul a töltésének megfelelően valamelyik pólus felé, majd az izoelektromos pontjánál megáll. Mihelyst ez a folyamat lezajlott, az amfolitok pufferként működve stabilan tartják a közvetlen környezetük pH értékét. Így alakul ki a pH gradiens, amiben a fehérjék elválaszthatók.

A másik, a fentinél még finomabban szabályozott pH gradienst úgy hozzák létre, hogy speciális amfolitokat alkalmaznak. Olyanokat, amelyeket kovalens kötésekkel bele lehet polimerizálni az akrilamid gélbe. A gélöntés során hozzák létre a leendő gél oldatában a megfelelő amfolitok gradiensét, amely a gél polimerizáció során kovalensen rögzül. Így ezekben a gélekben egyfajta immobilizált pH gradiens alakul ki. Az, hogy milyen értékek között érdemes a pH gradienst létrehozni, függ az elválasztandó fehérjék IEP értékeitől.

Bármelyik eljárással hozzuk is létre a pH gradienst, amikor már minden fehérje elérte az IEP értékének megfelelő helyzetet a gélben, az elektroforézist folytatva nem történik további vándorlás. A rendszer egyfajta állandósult állapotba kerül.

Az izoelektromos fókuszálás során jelentkező egyik potenciális technikai problémát az jelenti, hogy a fehérjék oldhatósága izoelektromos pontjukon a legalacsonyabb, így egyes fehérjék az IEP értékük közelében kicsapódhatnak a gélben. Ezt megakadályozandó leggyakrabban ureát is adnak a rendszerbe, amely segít oldatban tartani a fehérjéket. Ez egyes fehérjék esetében ahhoz vezet, hogy a fehérje oldatban marad, de denaturált állapotban lesz. Urea alkalmazásakor a kiértékelésnél figyelembe kell venni, hogy a natív illetve a denaturált állapotú fehérje izoelektromos pontja eltérő lehet (mivel az egyes disszociábilis csoportok pKa értéke függ a csoport lokális környezetétől). Az urea emellett a nem diszulfidhidakkal stabilizált alegységszerkezetet is felbonthatja. Membránfehérjék elválasztásánál pedig a fehérje oldatba vitelét nem-ionos detergensekkel segítik elő.

Izoelektromos fókuszálásnál kizárólag IEP alapján igyekszünk elválasztani a fehérjéket, ezért a gél kizárólag a keveredéses folyadékáramlás megakadályozását szolgálja, tehát nem szabad molekulaszűrőként viselkednie. Ennek érdekében kifejezetten alacsony akrilamid koncentrációjú, nagy pórusméretű géleket alkalmaznak. Emiatt ritkábban ugyan, de ennél a technikánál agaróz gélt is alkalmaznak. Az eljárást leggyakrabban vízszintesen elhelyezett gélekben folytatják intenzív hűtés mellett.

6.2.4.5. Kétdimenziós- (2D) elektroforézis

A legkülönbözőbb elválasztás technikák célja az, hogy egy sokkomponensű rendszer minden egyes összetevőjét elválassza az összes többi összetevőtől. Az elválasztás természetesen az összetevőknek valamilyen fizikai-kémiai tulajdonságban tetten érhető eltérésein alapul. Sokkomponensű elegyek esetében gyakori probléma, hogy pusztán egyetlen tulajdonság szempontjából nem tér el az összes komponens egymástól. Ilyenkor az adott tulajdonság szerinti elválasztás eredményeképpen lesznek olyan összetevők, amelyek homogénen elválnak a többitől, de lesznek olyanok is, amelyek továbbra is más összetevőkkel együtt, keverékben maradnak. Természetesen ezeket a keverékeket is el lehet választani komponensekre, amennyiben egy, az előzőekben alkalmazottól eltérő, attól lehetőleg tökéletesen független egyéb tulajdonság szerinti elválasztást alkalmazunk. Jó példa erre a fehérjék nagyhatékonyságú elválasztására bevezetett kétdimenziós poliakrilamid gélelektroforézis (2D PAGE), amelyben két, az előbbiekben már tárgyalt technikát kombinálnak (lásd 6.21. ábra).

Az SDS poliakrilamid gél elektroforézis a leginkább elfogadott módszer annak eldöntésére, hogy egy fehérje, ill. enzimpreparátum homogén-e. Különösen jól alkalmazható bonyolultabb fehérje-asszociátumok, multienzim komplexek vizsgálatára. A denaturáló SDS-PAGE során ezek a komplexek alkotóikra esnek szét, és az egyes polipeptidláncok külön-külön vándorolnak a gélben. A fehérjék gélben történő megfestésével mennyiségi meghatározásra is lehetőség nyílik, így nem csak azt lehet megállapítani, hogy egy alaposan megtisztított, sokkomponensű komplex hányféle alegységből áll, de meg lehet határozni az egyes alegységek számának egymáshoz viszonyított arányát is.

6.21. ábra: Kétdimenziós (2D) elektroforézis: izoelektromos fókuszálás és SDS PAGE kombinálása

6.21. ábra: Kétdimenziós (2D) elektroforézis: izoelektromos fókuszálás és SDS PAGE kombinálása

Amint az első dimenzióban megtörtént az elválasztás, ezt a gél-csíkot SDS oldattal itatják át, és egy SDS- poliakrilamid gél egyik szélére illesztik. Az elektródok megfelelő elrendezésével az IEP alapján elválasztott fehérjéket az eredeti elválasztási irányra merőlegesen vándoroltatják a poliakrilamid gélbe, és végrehajtanak egy már ismertetett SDS-PAGE elválasztást. Ennél a lépésnél tehát konkrét, és átvitt értelemben is egy másik dimenzió szerint zajlik az elválasztás. Egyrészt az előző elválasztási irányra merőleges, második térdimenzióban válnak el a komponensek, másrészt az előzőekben alkalmazott tulajdonságtól (IEP) teljesen független második tulajdonság, a molekulaméret szerint történik ez az elválasztás.

Tehát amennyiben az izoelektromos fókuszálás során egy-egy térrészben még több, azonos IEP értékű fehérje volt jelen, úgy ezek most méret szerinti elválhatnak egymástól.  Érdemes megjegyezni, hogy erre a második elválasztásra mindaz érvényes, amit az SDS-PAGE esetében már leírtunk. Azok a másodlagos kölcsönhatások, amik az izoelektromos fókuszálásnál esetleg még egyben tartottak fehérje alegységeket megszűnnek, és az egyes alegységek elválnak egymástól. A diszulfidhidak felbontásához természetesen itt is redukáló szert kell alkalmazni. Ebben a második dimenzióban tehát elkülönült polipeptidláncok vándorolnak. Tehát amennyiben az izoelektromos fókuszálásnál egy adott térrészben egy adott több-alegységes fehérje volt jelen, úgy a második dimenzió szerinti elválasztásban most már annak alegységei vándorolnak. Ha eltérő méretű alegységekből áll a fehérje, úgy ezek az alegységek a második dimenzióban elválnak egymástól

.

A 6.22. ábra jobb oldalán egy valós 2D elektroforézis eredményét látjuk, amelyben a kólibaktérium fehérjéit választották el egymástól.

6.22. ábra: A 2D ELFO eljárás egyes lépései

6.22. ábra: A 2D ELFO eljárás egyes lépései