6.5. Aminosav összetétel analízis

Bár az egyes fehérjéket egyedileg az aminosavsorrendjükkel, tehát a szekvenciájukkal lehet definiálni, a fehérjék között az aminosav összetételben is jelentős eltérések lehetnek. Tehát valamelyest az aminosav összetétel is jellemző a fehérjékre (lásd 6.4. táblázat)

Azt az eljárást, amellyel a fehérje aminosav összetételét meghatározzák, aminosav összetétel analízisnek, rövidítve aminosav-analízisnek nevezik. Az eljárás célja, hogy megállapítsa, az adott fehérjében az egyes aminosav fajtákból pontosan hány darab van. Az eljárás tehát nem foglalkozik az aminosav csoportok sorrendjével (ezt a szekvenálás eljárásával határozzák meg).

Az aminosav összetétel analízis feltétele, hogy a vizsgálandó fehérje homogén formában álljon rendelkezésre. A homogenitás egyik legjobb ellenőrzési módja a kétdimenziós gélelektroforézis.

Az eljárás során a fehérjét aminosavakra kell bontani. Ezt a fehérje savas hidrolízisével érik el. A peptidkötések nem-enzimatikus hidrolízise rendkívül lassú folyamat, mert a reakciónak nagyon magas aktivációs szabadentalpia gátja van. A hidrolízist rendkívül „kíméletlen” körülmények közepette végzik, a mintát 6 M sósav oldattal egy teljes napon át egy kuktaszerű készülékben 110-120°C fokon főzik. A folyamat célja ugyan a peptidkötések hidrolízise, de eközben az aszparagin és glutamin oldallánc-amid csoportjai is hidrolizálnak, és aszparaginsav illetve glutaminsav keletkezik. A folyamat során a ciszteinek és a triptofánok egy része is átalakul.

A hidrolízis végeredménye tehát aminosavak keveréke lesz. A cél ezek elválasztása, és az elválasztott aminosavak mennyiségi meghatározása. Az első analízist Stein és Moore az 1950-es évek elején dolgozták ki – az aminosav hidrolizátumot ioncsere oszlopon szeparálták és ninhidriddel detektálták az egyes aminosavakat. A módszer érzékenysége alacsony volt, helyette ma már fluoreszcens detektálást alkalmaznak.

6.4. táblázat: A különböző fehérjék aminosav összetétele eltérő

6.4. táblázat: A különböző fehérjék aminosav összetétele eltérő

A kvantitatív mérés céljából a mai módszerekben az aminosav keveréket olyan fluoreszcens vegyülettel reagáltatják, ami minden aminosavval reagál, és stabil vegyületet képez. Ilyen például a fluorescamine, amely a minden aminosavakon lévő amin csoporttal reagál (lásd 6.23. ábra). (A lizin egyszerre két fluorescamine molekulával jelölődik).

6.23. ábra: Aminocsoportok fluoreszcens jelölése fluorescamine molekulával

6.23. ábra: Aminocsoportok fluoreszcens jelölése fluorescamine molekulával

A jelölés után a 20-féle, immár fluoreszkáló komponenst kromatográfiás eljárással elválasztják egymástól, például kation-cserés kromatográfiával (lásd 6.24. ábra)

6.24. ábra: Fluoreszcensen jelzett aminosavak elválasztása és relatív mennyiségeik meghatározása

6.24. ábra: Fluoreszcensen jelzett aminosavak elválasztása és relatív mennyiségeik meghatározása

Az elválasztás előtt az oszlopot kalibrálni lehet azonos módon jelölt aminosavakkal, minden egyes aminosavra meghatározva, hogy az az adott körülmények között mekkora elúciós térfogatnál jön le az oszlopról. Az elúciós térfogat tehát beazonosítja az egyes aminosavakat. A kromatogáfia során az eluálódó mintát átvezetik egy átfolyó rendszerű küvettán, és egy fluoriméter segítségével meghatározzák a minta fluoreszcencia intenzitását. Ez az adat arányos az anyag mennyiségével (koncentrációjával). Így az elválasztás egyszerre minőségi, és mennyiségi meghatározást is lehetővé tesz.

Ezek után meghatározzák az elválasztott komponensek egymáshoz viszonyított, tehát relatív mennyiségeit. Belső standard aminosavak alapján abszolút mennyiségi meghatározásra is mód van. A legkisebb jelet adó, tehát legkisebb mennyiségűm aminosavról első menetben feltételezik, hogy abból egyetlen darab volt a fehérjében. Ha ez igaz, akkor az összes többi aminosav jele ennek a jelnek az egészszámú többszöröse. Ha ez nem teljesül, akkor feltételezik, hogy az adott aminosavból a fehérje kettőt tartalmazott. Ez esetben a jelintenzitást elosztják kettővel, majd megnézik, hogy az így kapott értékhez viszonyítva a többi aminosav jele egészszámú többszörös-e. Ezzel az iteratív módszerrel végül meghatározzák, hogy a legkisebb arányban szereplő aminosavból hány darab van a fehérjében. Ezek után a többi aminosav kópiaszáma már a jelintenzitások arányából meghatározható.