6.6. A fehérjék szekvenálás

6.6.1. Sanger módszerének lényege, és jelentősége

Ma már közismert, hogy a fehérjék (a DNS által) egyértelműen definiált aminosavsorrenddel rendelkeznek. Mielőtt Frederick Sanger az ötvenes évek elején meghatározta az első fehérjeszekvenciát, az inzulin aminosavsorrendjét, ez még korántsem volt elfogadott tény. Az egyik akkori iskola azt állította, hogy a fehérjék szekvenciájában rövidebb szekvenciarészletek ismétlődnek szabályosan. Más elméletek szerint egy-egy adott fehérje egy olyan molekulapopulációt jelent, amelynek szekvenciája egy átlag körül „mozog”, és az egyes molekulák egymástól akár nagy eltéréseket is mutathatnak. Mindezek az elméletek azért jöttek létre, mert még nem volt ismert, hogy a biológiai információ hogyan tárolódik, és hogyan fejeződik ki. Ezért semmit sem tudtak a fehérjeszintézis mikéntjéről sem. A vegyészek többsége számára nem tűnt reálisnak, hogy létezhet olyan kémiai reakció, amely eredményeként egy akkora polimer, mint a fehérje, 100%-os hatékonysággal szintetizálódna úgy, hogy annak a végeredménye egy homogén fehérjepopuláció legyen.

Sanger átütő jelentőségű eredménye alapján kiderült, hogy a fenti elméletekkel szemben a fehérjének jól definiált aminosavsorrendje van, abban nem ismétlődik semmilyen repetitív szekvencia. Az is nagy felismerés volt, hogy a szekvenciában az aminosavak bármilyen kombinációja megengedett. Eredményéért Sanger 1958-ban kémiai Nobel-díjat kapott.

Sanger teljesítménye az akkori peptidkémia csúcsát jelentette. Elsőként dolgozott ki egy eljárást, amellyel a fehérjék, illetve peptidek N-terminálisán lévő aminosav identitása meghatározható volt. Ehhez kifejlesztett egy új vegyületet, az 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene-t (FDNB). A molekula enyhén lúgos pH-n szelektíven reagál a fehérje aminocsoportjaival, és stabil kovalens terméket képez, aminek intenzív sárga színe van. A termék ellenáll a fehérje, vagy peptid teljes savas hidrolízisének. Az egyetlen α-aminocsoporton módosított aminosav a hidrolízis termékben az eredeti N-terminális aminosav. Ezzel a módszerrel megállapította, hogy az inzulin két polipeptidláncból áll. Az A lánc 21, a B lánc 30 aminosav csoportot tartalmaz.

Akkoriban az aminosav összetétel analízis már ismert volt, és néhány olyan szeparációs technika is elérhető volt, amivel peptideket lehetett egymástól elválasztani.

Sanger mindezek alapján a következő logika mentén fejtette meg a heterodimer inzulin két láncának szekvenciáját:

1) Homogén formában izolálta mindkét láncot.

2) Meghatározta mindkét szekvenálandó fehérjelánc aminosav összetételét (lásd aminosav összetétel analízis).

3) Meghatározta mindkét fehérjelánc N-terminális aminosavát.

4) Részleges (parciális) savas hidrolízissel, illetve proteázos emésztéssel olyan sokféle egyedi kispeptidre hidrolizálta a fehérjeláncot, ahányra csak lehetett. Ezeknek a peptideknek a szekvenciája emiatt természetesen egymással átfedő volt.

5) A tipikusan 2-4 aminosavból álló peptideket különféle kromatográfiás és elektroforetikus módszerekkel elválasztotta egymástól.

6) Mindegyik peptidnek meghatározta az N-terminális aminosavát, és az aminosav összetételét.

7) A nagyszámú peptid N-terminális adataiból, és aminosav összetételéből rekonstruálni lehetett azt az egyetlen lehetséges szekvenciát, amely a mérési adatokkal összhangban volt. Sanger módszere rendkívül munkaigényes volt, és egyáltalán nem nyilvánvaló, hogy általános módszerként is használható lett volna az inzulinnál lényegesen nagyobb fehérjék esetében. Sanger nem is a módszerért, hanem magáért az eredményért, és az abból fakadó nagy horderejű ismeretekért kapott Nobel-díjat.

6.6.2. Aminosav csoportok egyenkénti eltávolítása az N-terminálisról: az Edman-módszer

Amikor Sanger meghatározta az első fehérjeszekvenciát, már ismert volt Pehr Edman módszere. Edman egy merőben újfajta degradációs eljárást dolgozott ki, amivel egyenként volt képes eltávolítani aminosav csoportokat a fehérje N-terminálisáról. Ezt a módszert Sanger ugyan ismerte, de mégsem használta, mert az akkor elérhető technológiák miatt körülményesnek tartotta. Valójában Sanger kísérletes megközelítésének fő logikája és Edman speciális módszere együttesen eredményezték azt az általános, nagy hatékonyságú eljárást, amely azután világszerte elterjedt. Érdemes megjegyezni, hogy manapság már egyszerűbb a fehérjék szekvenciáját a kódoló DNS-szekvenálásán (amelynek kidolgozásáért Sanger egy további Nobel-díjat kapott) keresztül meghatározni, de ismeretlen izolált fehérje minták aminosavsorrendjét a mai napig a Sanger / Edman eljárással fejtik meg. Az alábbiakban ismertetjük ezt a kombinált eljárást.

A fő lépések (egyszerűsítve):

1) A homogén formában izolált fehérjeszekvencia-specifikus felvagdosása legalább két különböző proteázzal, és a peptidek izolálása. Ezek lesznek az átfedő peptidek

2) Az egyes kapott peptidek teljes szekvenálása Edman módszerével (lásd 6.25. ábra és 6.26. ábra).

3) A teljes szekvencia rekonstruálása

4) Diszulfidhidak azonosítása (ha vannak)

Vizsgáljuk meg közelebbről Edman módszerének forradalmian új megközelítését, majd konkrét kivitelezési módját.

Edman megközelítése a lényegnél ragadta meg a szekvenálás problémáját. Könnyű belátni, hogy a fehérje szekvenálás elvi értelemben legegyszerűbb módja az, ha a polipeptidlánc valamelyik terminálisáról egyenként, egymást követő lépésekben távolítjuk el az aminosavakat. Egy-egy lépést követően meghatározzuk, hogy milyen aminosavat szedtünk le. Edman tehát olyan kémiai eljárást dolgozott ki, ami ezt tette lehetővé.

A probléma ugyanakkor ennél többrétű. Képzeljük el, hogy a kémiai eljárásunk, mondjuk az N-terminális felől, egyenként távolít el aminosavakat. Egyéb speciális megoldás híján, amint az eljárás eltávolítja az első aminosavat, a második kerül a terminálisra, amit az eljárás természetesen szintén eltávolít. Ezután jön a harmadik aminosav, és így tovább. Önmagában egy ilyen reakció tehát kontrollálatlanul halad előre. Emiatt pillanatok alatt lehetetlenné válik meghatározni, hogy az egyes aminosavak milyen sorrendben voltak.

Edman eljárásának azonban van egy elementárisan fontos jellegzetessége.

A kémiai reakciót két egymást követő lépésre bontotta, amelyek egymástól erősen eltérő körülmények között mennek csak végbe. Olyan körülmények között, ahol az első lépés végbemegy, a második lépés nem megy végbe, míg olyan körülmények között, ahol a második megy végbe, az első lépés nem zajlik le.

6.25. ábra: Az Edman eljárás elvi vázlata

6.25. ábra: Az Edman eljárás elvi vázlata

Nézzük meg ezt konkrétabban (lásd 6.26. ábra).

6.26. ábra: Az Edman eljárás molekuláris mechanizmusa

6.26. ábra: Az Edman eljárás molekuláris mechanizmusa

Az N-terminális aminosav eltávolításának első lépése olyan magas pH-t igényel, ahol az a-aminocsoport nem hordoz pozitív töltést. Ezen a pH-n reagáltatjuk a fehérjét fenil-izotiocianáttal, amely kovalens kötést hoz létre az aminocsoporttal. Ezután a pH-t savasra állítjuk, amikor is lezajlik a második lépés. Az N-terminális aminosavat követő peptidkötés a kovalens módosítás miatt szelektíven destabilizálódik, és savas pH-n gyorsan elhasad. A módosított aminosav leválik, megjelenik az új N-terminális.

A fenil-izotiocianáttal jelölt aminosav fluoreszkál. Az aminosav csoporton keresztül kromatográfiával megállapítható, hogy melyik aminosavról van szó, a fluoreszcens csoporton keresztül pedig igény szerint a mennyisége is meghatározható. Mivel a közeg savas, ezért hiába van jelen feleslegben fenil-izotiocianát, az nem reagál az új N-terminálissal. A reagenseket, a jelölt aminosavat és az eggyel rövidebb fehérjét egymástól elválasztjuk, és újra végrehajtjuk a fent leírt lépéseket.

Ez a megközelítés oldatban is működik, de minden ciklust követően nagyhatékonyságú elválasztási lépéseket igényel.

Edman módszerének hatékonyságát tovább növelte az az újítás, melynek során a reakciót oldatfázis helyett szilárdfázison hajtották végre. A fehérjét egy megfelelő szilárd hordozóra kötötték. A magas pH-n végrehajtott fenil-izotiocianátos jelölést követően a szilárd fázisról egyszerűen lemosható a fenil-izotiocianát felesleg. Az oldatkörnyezet is könnyen lecserélhető savasra, és a felszabaduló módosított aminosav könnyen lemosható. A szilárd fázison történő végrehajtás könnyen automatizálhatóvá tette az eljárást. Az Edman módszerrel mintegy 50 aminosavnyi szakaszok szekvenciáját lehet nagy biztonsággal meghatározni.

A fehérjék túlnyomó része több száz aminosavból áll. A teljes szekvencia rekonstruálásához ezért a fehérjét szekvencia-specifikus módon kell hasítani, a keletkező peptideket el kell választani egymástól, és külön-külön meg kell szekvenálni. Ha pl. tripszinnel emésztjük meg a fehérjét, akkor minden lizint és arginint követő peptidkötés hidrolizál, és egymással szekvenciálisan át nem fedő peptideket kapunk, amelyek C-terminálisán csak lizin, vagy arginin lehet (az eredeti C-terminálist tartalmazó peptid kivételével). Ha csak tripszinnel hasított peptideket szekvenálnánk, akkor nem tudnánk az eredeti sorrendbe rendezni őket.

A megoldás az, hogy egy másik, a tripszintől eltérő szelektivitású proteázzal is hasítjuk a fehérjét. Például kimotripszinnel, ami triptofán, tirozin és fenilalanin után hasít. Az így kapott peptideket is megszekvenáljuk. A tripszines és  kimotripszines peptidek átfedő információt tartalmaznak, így az összehasonlításukből egyértelműen rekonstruálható az eredeti szekvencia, amelyből származtak (lásd 6.27. ábra)

6.27. ábra: Két eltérő specifitású proteázzal hasítva a fehérjét, átfedő peptidek keletkeznek, amelyek külön-külön meghatározott szekvenciájából a teljes szekvencia rekonstruálható

6.27. ábra: Két eltérő specifitású proteázzal hasítva a fehérjét, átfedő peptidek keletkeznek, amelyek külön-külön meghatározott szekvenciájából a teljes szekvencia rekonstruálható

6.6.3. A diszulfidhidak pozíciójának meghatározása

Ha a fehérjében diszulfidhidak vannak, akkor azokat is azonosítani kell. Minden diszulfidhídban szereplő cisztein esetében meg kell állapítani, hogy melyik másik ciszteinnel alkot diszulfidot. Ezt a következő lépésekből álló eljárással lehet kideríteni:

1.) A fehérje kis peptidekre hasítása savas közegben, ahol a diszulfidhidak épen maradnak. A megfelelően végrehajtott hasítás eredményeként kizárólag monomer és dimer peptidek keletkeznek, és minden dimer peptid csak egyetlen diszulfidhidat tartalmaz.

2.) A peptidek elválasztása papír elektroforézissel. Az egyes peptidek eltérő töltésűek, és összetételüknek megfelelően eltérő módon alakítanak ki gyenge kölcsönhatásokat a papírral, mint hordozó közeggel. Emiatt eltérő sebességgel vándorolnak.

3.) Az elválasztott peptidek perhangyasav gőzzel való kezelése a papíron. A kezelés során a diszulfidhidak felbomlanak, és a dimer peptidek helyett két monomer peptidek kapunk, amelyek 1-1 extra negatív töltést hordoznak a rajtuk megjelenő ciszteinsav csoport miatt (lásd 6.28. ábra).

6.28. ábra: A diszulfidhidak felnyitása és a ciszteinek módosítása perhangyasavas kezeléssel

6.28. ábra: A diszulfidhidak felnyitása és a ciszteinek módosítása perhangyasavas kezeléssel

4.) Újabb elektroforézis az előzővel merőleges irányban. Ennek során a monomer peptidek ugyanolyan sebességgel vándorolnak, mint az első elektroforézis során, így a második elektroforézis végére a papír átlóján helyezkednek el. Az eredetileg dimer, de a kezelés során monomerré váló peptidek azonban a második elektroforézis során már megváltozott sebességgel vándorolnak, így az átlón kívül helyezkednek el (lásd 6.29. ábra).

5.) Átlón kívüli minták szekvenálása. Ezzel pontosan meghatározható, hogy mely peptidek alkottak egymással dimereket, és ezen keresztül meghatározható, hogy mely ciszteinek alkottak egymással diszulfid hidat.

6.29. ábra: A diagonál módszer azonosítja a diszulfidhíddal összekapcsolt peptideket

6.29. ábra: A diagonál módszer azonosítja a diszulfidhíddal összekapcsolt peptideket