7.6. A kooperativitás jelensége, és matematikai leírása

Az ideális szállító fehérje annál erősebben köt, minél nagyobb mértékben telített (és fordítva, annál könnyebben ereszti el a ligandumot, minél többet eleresztett már). Egyetlen kötőhellyel rendelkező molekula nem viselkedhet így, hiszen ott a kötőhely vagy foglalt, vagy nem. Csak egynél több kötőhely esetén lehetséges ilyen effektus, amennyiben az egyes kötőhelyek „kommunikálnak”, tehát az egyes kötőhelyek ligandumkötése nem független egymástól.

Ha egy ligandum belépését segíti, hogy a fehérje egy másik ligandum-kötőhelyén már van kötődött ligandum, akkor a kötőhelyek között definíció szerint pozitív kooperativitás van.

Független kötőhelyek esetén a több kötőhelyes fehérje ligandumkötését ugyanolyan egyszerű derékszögű hiperbola írja le, mint az egy kötőhelyes fehérjéét. A kooperativitás esetén azonban más lesz a helyzet.

Nézzük meg ezt a matematika nyelvén kifejtve.

Először is gondoljuk végig, hogy a pozitív kooperativitás fenti definíciója alapján mi lenne a jellemző egy teoretikus, tökéletesen kooperatív, „n” kötőhellyel rendelkező fehérjére. A tökéletes kooperativitás azt jelentené, hogy az n kötőhely mindegyike csak akkor tudna ligandumot kötni, ha a többi kötőhely is éppen ligandumot köt. Tehát vagy csak együtt, egyidejűleg kötnek, vagy sehogy. Ekkor tehát csak két fehérje-állapot létezik, amelyikben mind az n hely ligandum-kötött, illetve amelyben egyik sem köt ligandumot. A két állapot között egyensúly áll fent.

Ennek egyszerű sémáját a 7.6. egyenlet mutatja.

7.6. egyenlet

Vegyük észre, hogy a 7.6 egyenlet a 7.1. egyenletnek egy olyan változata, amelyben a fehérjén n kötőhely van, és ezek csak egyszerre köthetnek. Ebből a formalizmusból ugyanazzal a logikával, amivel a 7.2. egyenlettől a 7.5. egyenletig jutottunk, az alábbi egyenletrendszer következik.

A 7.7. egyenletben definiáljuk az erre az esetre vonatkozó asszociációs állandót.

7.7. egyenlet

Az egyenletben tehát Ka az asszociációs állandó, míg [PLn] a telített protein-ligandum komplex moláris koncentrációja.

A 7.7. egyenlet átrendezése a 7.8. egyenlethez vezet:

7.8. egyenlet

A telítés erre az esetre alkalmazott egyenletét, és annak a 7.8. egyenlet segítségével történő átalakítását a 7.9. egyenlet mutatja.

7.9. egyenlet

A 7.9. egyenlet a 7.5. egyenlet egy módosult változata, amelyben számolunk azzal, hogy n kötőhely van, amelyek egymással kooperálnak. Ezt az egyenletet Archibald Hill-vezette be 1910-ben, annak nyomán, hogy a hemoglobin oxigénnel történő telítésének görbéjét analizálta. A végső egyenlet ennek emlékére az ún. Hill-egyenlet, melyben „n” a Hill-együttható.

Emlékezzünk, az egyenletet egy tökéletesen kooperatív rendszerre vezettük le, ahol „n”, tehát a Hill-együttható megegyezik a fehérje kötőhelyeinek a számával.

A kérdés, hogy amikor az egyenletet konkrét mérési eredményekre vonatkoztatva értékeljük ki, akkor a Hill-együttható vonatkozásában milyen eredményekre juthatunk. Számos több-kötőhelyes fehérje telítésének konkrét mérésével kísérletesen is meghatározták a Hill-együttható értékét. Az esetek egy részében kiderült, hogy a Hill-együttható értéke 1-nek adódott. Ez azt jelenti, hogy bár a fehérjének egynél több kötőhelye van, azok egymással nem kommunikálnak, a rendszer nem kooperatív. Kooperativitás hiányában tehát n = 1.

Azt az egyenlet bevezetésénél már láttuk, hogy tökéletes, és ezért nem realisztikus „végtelen nagymértékű kooperativitás” esetén a Hill-együttható megegyezne a kötőhelyek számával.

A valóságban, azokban a rendszerekben, ahol pozitív kooperativitás van, a Hill-együttható értéke 1 és a kötőhelyek számának számértéke között van. Végtelen kooperativitás tehát nincs.

Ez valójában nem meglepő, hiszen itt egyfajta információáramlásról van szó az egyes kötőhelyek között. Az információ tartalma kétféle lehet. Egy addig ligandumot nem kötött hely „üzenhet”, hogy most éppen ligandumot kötött, és ezzel a többi kötőhely konformációját megváltoztatva azokat erősebb kötőhellyé teheti. Olyan mechanizmus azonban nem létezhet, amely elérné, hogy amennyiben az egyik hely éppen ligandumot kötött meg, úgy a többi is ugyanabban a pillanatban ugyanezt megtegye. Márpedig ez lenne a tökéletesen kooperatív eset.

A másik, fordított üzenet az lehet, hogy a kötőhely ligandum-kötött állapotból éppen üres állapotba kerül, vagyis elereszti a ligandumot. Ez az esemény azzal kellene, hogy járjon, hogy a többi kötőhely kisebb affinitású kötőhellyé váljon. Ez az üzenet sem lehet azonban olyan, hogy azonnal minden kötőhely eleressze a ligandumot, csak mert az egyik ezt megtette. Márpedig ez lenne tökéletes kooperativitás esetében.

Nézzük meg, hogy Hill-eredetileg hogyan határozta meg az együttható értékét. Akkoriban még nem létezett számítógép, így olyan módon transzformálta át az egyenletet egyszerű algebrai átalakításokkal, hogy az lineáris alakot öltsön, és „n” legyen az egyenes meredeksége. Így egyszerű egyenes illesztéssel meg tudta határozni „n” értékét (lásd 7.10. és 7.11. egyenleteket). (A Hill által meghatározott n érték 3,6 volt.)

Az egyenlet linearizálásának első lépéseként bevezetésre, majd kifejtésre került a θ/(1-θ). (Emlékeztetünk rá, hogy a 7.5. egyenlet szerint, egy kötőhely esetén θ = [L]/([L]+Kd).)

7.10. egyenlet

Mivel a θ kísérletesen mérhető, a θ/(1-θ) érték egyszerű számítással megkapható. Az ötletes algebrai trükknek köszönhetően, egy egyszerű mérési adat áll szemben egy olyan törttel, amelyben a Hill-együttható egyelőre kitevőben van. A 7.10. egyenletben vesszük a 7.11. egyenlet mindkét oldalának logaritmusát.

7.11. egyenlet

Az oxigénkötő fehérjére vonatkoztatott 7.11. egyenletben a ligandum koncentrációt az oxigén parciális nyomása helyettesíti, a disszociációs állandó helyett pedig a fél-telítéshez szükséges oxigén parciális nyomás áll.