8.5. Az enzimkatalízis molekuláris mechanizmusa

Az eddigiekben megtárgyaltuk az enzimkatalízis termodinamikai hátterét, de még nem esett szó arról, hogy konkrétan milyen molekuláris mechanizmusok keretében megy végbe a sebességnövelés. Az alábbiakban ezt foglaljuk össze, és az egyes megoldási típusokat konkrét példán keresztül részleteiben is megtárgyaljuk.

Molekuláris mechanizmus szerint három fő típust különítünk el, a fémion-katalízis, az általános sav-bázis katalízist és a kovalens katalízist. Mindegyik típusra igaz, tehát az enzimekre általánosan jellemző, hogy az enzim több száz aminosav csoportja közül elkülöníthető néhány csoport, amely szoros együttműködésben kulcsszerepet játszik a katalízisben. Ezek a csoportok alkotják az enzimnek az úgynevezett aktív centrumát. Az enzimek egy részében ettől világosan elkülöníthető a szubsztrátkötő hely, amely a szubsztrátot, illetve az átmeneti állapotot stabilizálja.

8.5.1. Fémion katalízis

A fémionok már említett nagy töltéssűrűsége a katalízisben számos eltérő módon is szerepet játszhat. A legegyszerűbb esetben segíthet a szubsztrát megkötésében. A foszforilált szubsztrátok esetében például tipikus, hogy az enzim valamilyen fémiont is használ. Egyes átmeneti állapotok negatív töltést hordoznak, így ezeket a fémion stabilizálhatja. A fémionok elektronelszívó hatása növelheti egyes csoportok, pl. a víz savas karakterét, tehát protonleadó képességét. A protonleadást követően visszamaradó, fémionhoz kötött hidroxil erős nukleofil.

Erre a mechanizmusra jó példa a szénsavanhidráz enzim működése. A reakció, amit ez az enzim katalizál, a víz reverzibilis reakciója széndioxiddal (lásd 8.6. ábra).

8.6. ábra: A víz reverzibilis reakciója széndioxiddal

8.6. ábra: A víz reverzibilis reakciója széndioxiddal

A katalizálatlan reakció önmagában is viszonylag gyors, de a szervezetben sokkal gyorsabban kell végbemennie. A szövetekben a sejtek által termelt CO2 a koncentrációviszonyoknak megfelelően vízzel reagálva szénsavat képez. Ennek a folyamatnak pillanatszerűen kell végbemennie ahhoz, hogy ne keletkezzenek buborékok, amelyek trombózist okozhatnak. A tüdőben a reakció a koncentráció-viszonyoknak megfelelően ellenkező irányban zajlik. Itt is hasonlósan gyors reakcióra van szükség, de ebben az esetben ahhoz, hogy a tüdőben áthaladó vér nagy sebességgel megszabadulhasson a széndioxidtól, a gáz halmazállapotú széndioxid kilégzésre kerülhessen.

8.7. ábra: A szénsavanhidráz enzim szerkezete és az aktívhely felépítése (PDB: 1CA2)

8.7. ábra: A szénsavanhidráz enzim szerkezete és az aktívhely felépítése (PDB: 1CA2)

A szénsavanhidráz enzim aktívhelyén egy cinkion található, amit három hisztidil oldallánc N-atomjai koordinálnak. A negyedik koordinációs pozícióban egy vízmolekula van (lásd 8.7. ábra).

Ez a vízmolekula központi szerepet játszik a reakció katalízisében. A cinkionon keresztüli koordinációja miatt ez a vízmolekula már neutrális közegben, tehát pH 7,0 körül felerészben leadja a protonját. Ugyanez a disszociáció mérték az oldatban lévő víz-molekuláknál csak kb. 15,7-es elméleti pH értéknél következne be. A cinkion tehát jelentősen növeli a vízmolekula savasságát, és ezáltal nukleofil OH¯ csoportot állít elő (lásd 8.8. ábra. és 8.9. ábra).

8.8. ábra: A szénsavanhidráz aktívhelyén hisztidil oldalláncokkal koordinált cinkion aktivál egy vízmolekulát

8.8. ábra: A szénsavanhidráz aktívhelyén hisztidil oldalláncokkal koordinált cinkion aktivál egy vízmolekulát

A reakció sebességének pH-függése mutatja, hogy abban egy pKa»7 értékkel rendelkező disszociációra képes funkciós csoport vesz részt. Ez a cinkion által aktivált vízmolekulának felel meg (lásd 8.9. ábra).

8.9. ábra: A szénsavanhidráz katalitikus aktivitásának pH-függése

8.9. ábra: A szénsavanhidráz katalitikus aktivitásának pH-függése

A cinkion által aktivált OH¯ sokkal erősebb nukleofil, mint a víz, ezért hatékonyabban támadja a széndioxidot. A keletkező hidrogénkarbonát anion egy vízre cserélődik, ami újfent protont ad le. Az enzim-katalizálta reakcióban másodpercenként mintegy egymillió ilyen ciklus játszódik le (lásd 8.10. ábra).

8.10. ábra: A szénsavanhidráz enzim által katalizált reakció lépései

8.10. ábra: A szénsavanhidráz enzim által katalizált reakció lépései

A ciklus egyetlen lépése sem lehet lassabb, mint maga a teljes katalizált reakció, tehát a proton első lépésben történő eltávolítása is legalább másodpercenként egymilliószor meg kell, hogy történjen. Erre egy „proton csatorna” szolgál (lásd 8.11. ábra). Egy hisztidin veszi át a protont, ami az oldatban pufferként található kisméretű bázisoknak adja azt át.

8.11. ábra: A szénsavanhidráz által katalizált reakció részletes molekuláris mechanizmusa

8.11. ábra: A szénsavanhidráz által katalizált reakció részletes molekuláris mechanizmusa

8.5.2. Általános sav-bázis katalízis

Egyes kémiai reakciók katalizálhatók savval, bázissal, esetleg mindkettővel. A katalízis ennél a mechanizmus típusnál gyakran abban áll, hogy az átmeneti állapotban egy nagy energiájú (emiatt kis frekvenciával kialakuló), negatívan töltött csoport ideiglenes protonálódik, majd később protont ad le. Az első lépést sav képes katalizálni, a másikat bázis. Vizes oldatban, savas közegben H3O+, lúgos közegben OH¯ lehet a katalizátor, és ekkor specifikus sav, illetve specifikus bázis katalízisről beszélünk. A kétféle katalízis egy időben nem mehet végbe nagy hatékonysággal, hiszen vagy a hidroxónium ion koncentrációja magas, vagy a hidroxid ioné.

Egy általános HA sav, illetve B: bázis ugyanilyen katalizáló szerepet tölthet be. Ekkor általános sav illetve bázis katalízisről beszélünk. Egy enzim aktív helyén egyszerre lehet jelen általános sav és általános bázis, ezért a kétféle katalízis egyszerre végbemehet. Jó példa erre a trióz-foszfát-izomeráz enzim mechanizmusa (lásd 8.12. ábra). Az enzim a glikolízis egyik lépését katalizálja.

8.12. ábra: Az általános sav-bázis katalízis szép példája a trióz-foszfát-izomeráz enzim működése

8.12. ábra: Az általános sav-bázis katalízis szép példája a trióz-foszfát-izomeráz enzim működése

Az enzim aktívcentrumának oldalláncai rendre két különböző szubsztrát-csoporttal reagálnak a reakció során. Ha az egyiktől protont vesznek fel, akkor a protont majd egy másiknak adják le, illetve ha az egyiknek protont adnak le, akkor a protont majd egy másiktól veszik fel. Így alakul át a szubsztrát. Az enzimatikus reakció első lépésben az enzim egyik glutaminsavának (Glu165) disszociált karboxilcsoportja funkcionál bázisként, és egy hisztidin (His 95) nem-protonált imidazol csoportja tölti be a sav szerepét. (A nem protonált imidazol ebben az esetben tehát sav, de az ismert esetek nagyobbik részében bázisként működik).

Az első lépésben a dihidroxiaceton-foszfát egyik része tehát protont veszít, másik része protont nyer, és ennek megfelelően elektronszerkezete átrendeződik, egy éndiol átmeneti állapot keletkezik. (Az enzim nélküli reakcióban egy kedvezőtlenül magas energiájú töltés-szeparáció jönne létre az átmeneti termékben. A C1 szénatom pozitív töltésű lenne, míg a karbonil oxigén negatív.)

A második lépésben a negatív töltésű imidazol bázisként protont vesz fel az éndiol C1 szénatomjához kapcsolódó hidroxilcsoporttól. A negatív töltés megjelenése a két szénatom közötti kettőskötés felbomlásához vezet. A glicerinaldehid-3-foszfát kialakulásához vezető utolsó lépésben a protonált Glu165 immár savként protonálja a negatív töltésű átmeneti állapotot. Tessék felfigyelni rá, hogy a hisztidin oldallánca általános savként és bázisként is funkcionál!

8.5.3. Kovalens katalízis

Az előző két reakciómechanizmus típusban az enzim azáltal csökkentette az aktiválási szabadentalpiát, hogy polarizálta a reakcióban résztvevő molekulák kötéseit, illetve protonokat vett fel ezektől a molekuláktól és / vagy protonokat adott át nekik. Ezeknek az eseteknek egy részében az átmeneti állapot pontosan ugyanaz a molekula a nem katalizált, és a katalizált folyamatban. Az eltérés csak az, hogy a katalizált folyamatban az enzim elősegíti az átmeneti állapot kialakulását, illetve stabilizálja a már létrejött átmeneti állapotot. Az első két mechanizmus típusban az enzim és a reakcióban szereplő molekulák között azonban nem alakul ki kovalens komplex.

A kovalens katalízis különlegessége éppen abban áll, hogy átmeneti kovalens kötés alakul ki az enzim és az átalakuló szubsztrát között. Az enzim ezáltal teljesen új reakcióutat nyit meg, olyat, ami az enzim hiányában nem valósulhatna meg. Erre jó példa a szerin-proteázok működése, amit a kimotripszin működésén keresztül mutatunk be.

Mielőtt a részleteket ismertetnénk, fontos megjegyezni, hogy a három felsorolt katalitikus mechanizmus típus nem zárja ki egymást. Egyes enzimreakciókban akár mindhárom mechanizmus tetten érhető. A kimotripszin esetében például a kovalens katalízis mellett sav-bázis katalízis is szerepet játszik.

A kimotripszin a szerin-proteázok közé tartozik. A szerin-proteázok az élő szervezetben peptidkötések hidrolízisét katalizálják. A reakciót szintetikus szubsztrátokkal vizsgálva ugyanakkor kiderült, hogy nem csak peptidkötés (R-CONH-R’), de észterkötés (R-COO-R’) hidrolízisét is képesek katalizálni.

A szerin-proteázok a nevüket egy különlegesen reakcióképes szerin oldalláncról kapták. Amikor kimotripszint reagáltattak diizopropil-fluoro-foszfáttal (DFP), azt tapasztalták, hogy a DFP-kezelt enzim inaktiválódott. (A DFP veszélyes méreg, mert az ingerületátvitelben meghatározó szerepet játszó acetil-kolin észterázt is gátolja, mely enzim azt itt ismertetett mechanizmussal analóg módon működik.) Ez a totális gátlás arra utalt, hogy az enzimnek valamelyik, a katalízisben kulcsfontosságú csoportja módosult. A módosítás helyét peptidanalitikai módszerekkel határozták meg. Kiderült, hogy a kimotripszinben szelektíven csak a Ser195 hidroxilja módosult (lásd 8.13. ábra).

8.13. ábra: A diizopropil-fluoro-foszfát egyetlen konkrét szeril oldalláncot módosítva inaktiválja a kimotripszint

8.13. ábra: A diizopropil-fluoro-foszfát egyetlen konkrét szeril oldalláncot módosítva inaktiválja a kimotripszint

Ez a felismerés egyszerre két igen lényeges információt tárt fel. Az egyik az, hogy a Ser195 elengedhetetlen résztvevője a katalízisnek, hiszen módosítása tökéletesen inaktiválja az enzimet.

A másik, hogy a Ser195 valami miatt különlegesen reakcióképes, ugyanis maga a DFP nem különösebben reaktív, sem szabad szerin aminosavval, sem más, a fehérjében lévő egyéb szerin oldallánccal nem reagál. Ez egyértelműen arra utalt, hogy a Ser195 csoportot valami aktiválja.

A kimotripszin által katalizált reakció sebességének pH-függése arra utalt, hogy a katalitikus centrumban egy hisztidinnek is fontos szerepe van. Ezt a hisztidint később az enzim röntgendiffrakciós szerkezete igazolta, és azt is feltárta, hogy egy harmadik oldalláncnak, egy aszpartátnak is elengedhetetlen szerepe van (lásd 8.14. ábra). A három oldallánc, a Ser195, His57, Asp102 együttműködő egységére bevezették a katalitikus triád elnevezést.

A reakció számos lépésből áll, de a teljes folyamat két fő szakaszra bontható, a kovalens enzim-szubsztrát köztitermék kialakulásához vezető acilezés és az ennek elbomlását eredményező dezacilezés fázisára. Az acilezés végére egy átmeneti termék és az enzim között a reaktív szerin oldalláncon keresztül kovalens kötéssel acilszerin alakul ki (acilenzim), ami a második szakaszban a dezacilezés során hidrolízissel bomlik. A katalízis során egy kedvezőtlenül magas energiájú, töltéssel rendelkező, átmeneti állapot is kialakul, amit az enzim stabilizál (lásd az enzimreakció termodinamikai leírását). A reakcióban sav-bázis reakciólépés is szerepel, így ez a folyamat az enzimekről mondott alapelvek számos elemét mutatja. A szerin-proteázok esetében az enzimen jól elkülöníthető a szubsztrát megkötéséért felelős szubsztrátkötő zseb, és a katalízis lezajlásának helyszíne, az aktív hely. A szubsztrátkötő apparátus pozícionálja a hasítandó kötést a katalitikus apparátushoz. A kötési energia az aktiválási energia csökkentésére fordítódik.

8.14. ábra: A kimotripszin térszerkezete, a katalitikus triád és a szubsztrátkötő hely bemutatása (PDB: 1GCT)

8.14. ábra: A kimotripszin térszerkezete, a katalitikus triád és a szubsztrátkötő hely bemutatása (PDB: 1GCT)

Nézzük meg részletesen, hogyan katalizálja a kimotripszin a peptidkötés hidrolízisét (lásd 8.15. ábra-8.22. ábra).

8.15. ábra: Szubsztrátkötés, a nem-kovalens Michaelis-komplex kialakulása

8.15. ábra: Szubsztrátkötés, a nem-kovalens Michaelis-komplex kialakulása

Első lépésként a szubsztrátkötő zseb megköti a szubsztrátot. A kimotripszinnek van egy nagyméretű apoláros zsebe, amely elsősorban Trp, Tyr és Phe oldalláncokat tud hatékonyan megkötni. A kötőzseb a hasítandó peptidkötést a katalitikus triádhoz képest optimális helyzetbe pozícionálja (lásd 8.15. ábra). A kötőzsebbe került csoport karbonil szénatomja közel kerül a Ser195 hidroxil oxigénjéhez. Ezt a nem-kovalens komplexet Michaelis-komplexnek nevezik.

A második lépésben kialakul egy tetraéderes átmeneti állapot (lásd 8.16. ábra). Az Asp102 és a His57 között hidrogénhíd van, ami növeli a His57 bázikusságát. A His57 protont von el a Ser195 oldallánctól. Mint látható, a reakciónak ez az eleme, egy általános bázis katalízis. Az így aktivált Ser195 oldallánc támadja a szubsztrát karbonil szénatomját. Az eredmény egy labilis, nagyenergiájú, negatív töltésű tetraéderes átmeneti állapot, amit az úgynevezett oxianion kötőhely stabilizál két hidrogénhíd kötéssel. Ezek a kötések egy-egy peptidkötés NH-csoporton keresztül alakulnak ki.

8.16. ábra: Az első tetraéderes átmeneti állapot kialakulása

8.16. ábra: Az első tetraéderes átmeneti állapot kialakulása

A tetraéderes átmeneti állapot olyan rövidéletű, hogy nem izolálható, sőt, eddig detektálni sem sikerült. Létezését elméleti számítások támasztják alá, továbbá az, hogy az átmeneti állapotot imitáló szintetikus molekulák hatékonyan gátolják az enzimet. Szintén az átmeneti állapot létét támasztják alá a katalitikus antitestek (abzimek; az antitest, antibody és az enzim szóból). Ezeket átmeneti állapot analógok, mint antigének ellen termeltetik. Az abzimek a hozzáadott „normál” szubsztrátot enzimként átalakítják.

A His57 a Ser195-től felvett proton segítségével hidrogénhidat létesít a tetraéderes átmeneti állapot nitrogénjével. Ez a kötés elősegíti majd a peptidkötés hasadását a következő lépésben (lásd 8.17. ábra).

8.17. ábra: Az acilenzim kialakulása, az első termék távozása

8.17. ábra: Az acilenzim kialakulása, az első termék távozása

A harmadik lépésben a His57 protonálja az első termék távozó csoportját, ami egy általános sav katalízis lépés. Így kialakul az első termék távozó csoportja, vagyis az N-terminális aminocsoportja, és az első termék, vagyis a polipeptid C-terminális felé eső része távozik az enzimről. A polipeptid első, aminoterminus felé eső része azonban egy észterkötésen keresztül kovalensen kötve marad az enzimhez. Ezt intermediert acilenzimnek nevezzük. Az acilenzim a tetraéderes átmeneti állapottal ellentétben egy valódi átmeneti termék, ami speciális szubsztrátok esetén detektálható, sőt izolálható is. Ezzel az első szakasz, az acilezés szakasza lezárult.

8.18. ábra: A vízmolekula aktiválása

8.18. ábra: A vízmolekula aktiválása

A reakció negyedik lépésében megkezdődik a dezacilezés fázisa. A His57 egy hidrogénhíd kölcsönhatáson keresztül aktiválja a belépő vízmolekulát, ami ezáltal nukleofil támadást intéz az acilenzim, vagyis a szubsztrát és az enzim között kialakult labilis észterkötés karbonil szénatomja ellen. (lásd 8.18. ábra).

8.19. ábra: A második tetraéderes átmeneti állapot kialakulása

8.19. ábra: A második tetraéderes átmeneti állapot kialakulása

A reakció ötödik lépésében újabb rövidéletű, negatív töltésű tetraéderes átmeneti állapot alakul ki, amit újfent az oxianion kötőhely stabilizál (lásd 8.19. ábra). A His57 a víztől átvett protonon keresztül (újabb általános bázis katalízis lépés) hidrogénhidat alakít ki a Ser195 oxigénjével, elősegítve a második termék kialakulását.

A reakció hatodik lépésében a His57 hidrogénhíd kölcsönhatásban szereplő protonja átkerül a Ser195 oxigénjére, és kialakul a második termék (lásd 8.20. ábra). Az első termék az eredeti peptid második fele volt, és az annak megfelelő új N-terminális alakult ki az első termék távozása előtt. A második termék az eredeti peptid első, N-terminális részének felel meg, és távozása előtt ennek új C-terminálisa alakul ki.

8.20. ábra: Az acilenzim elbomlása

8.20. ábra: Az acilenzim elbomlása

8.21. ábra: A második termék távozása

8.21. ábra: A második termék távozása

A reakció utolsó, hetedik lépésében távozik a második termék, és visszakapjuk az enzim eredeti állapotát (lásd 8.21. ábra).

A reakciósor könnyebb áttekinthetősége érdekében a teljes ciklust egyetlen közös ábrában is bemutatjuk (lásd 8.22. ábra).

8.22. ábra: A kimotripszin működési mechanizmusának összefoglaló ábrája

8.22. ábra: A kimotripszin működési mechanizmusának összefoglaló ábrája