9. fejezet - Enzimkinetika

Tartalom

9.1. A Michaelis-Menten kinetika első modellje
9.2. A Michaelis-Menten kinetika továbbfejlesztett modellje
9.3. A kezdeti sebesség értékek és a fő kinetikai paraméterek meghatározása.
9.4. Enzimgátlás típusok
9.4.1. Kompetitív gátlás
9.4.2. Unkompetitív gátlás
9.4.3. Kevert típusú gátlás

(szerző: Pál Gábor)

Az enzimreakciók termodinamikai értelmezésének és a háromféle katalízis mechanizmusának bemutatását követően áttérünk az enzimkinetika alapvető összefüggéseinek leírására. Kifejezetten arra fókuszálunk, hogy miként lehet megmérni a katalizált reakció sebességét, milyen fő kinetikai paraméterek jellemzik az enzimatikus reakciót, mi jellemző a leghatékonyabb enzimekre, és milyen mechanizmusokkal lehet az enzimeket gátolni.

Mivel itt már kizárólag enzimkatalizált reakciókról lesz szó, a kiindulási anyagunkat szubsztrátnak nevezzük majd, és S jelöléssel hivatkozunk rá. A terméket továbbra is P betű jelzi.

A korábbi A + B → P sémával szemben a lehető legegyszerűbb, S → P esettel foglalkozunk.

Az enzimkinetika tudományág kialakulásának hajnalán az enzimek fizikai mibenlétéről, a sebességnövelés lehetséges mechanizmusairól még szinte semmit nem tudtak.

A legegyszerűbb elsőrendű kémiai reakciónál a fenti jelöléseket használva a nem katalizált S → P reakció sebessége V= d[P]/dt = k[S]. Más szóval a reakció sebessége egyenesen arányos S koncentrációjával. A sebesség így elvileg „végtelenségig” növelhető, annak csak S oldhatósága szabna gátat.

Amennyiben egy enzim katalizálja az átalakulást, a reakció nagyságrendekkel gyorsabban zajlik, ugyanakkor jellegzetesen eltérő az [S]-V függvény. Állandó [E] esetén kis [S] értékeknél az [S] növelésével a V reakciósebesség közel egyenes arányban, tehát lineárisan növekedik, de egyre nagyobb kiindulási [S] esetén a V egyre kevésbé növekedik, és egy maximális érték felé tart (lásd 9.1. ábra jobb oldala). Ez az úgynevezett telítési (vagy szubsztráttelítési) görbe.

9.1. ábra: A termékkoncentráció–idő valamint a kezdeti sebesség-szubsztrátkoncentráció grafikonok

9.1. ábra: A termékkoncentráció–idő valamint a kezdeti sebesség-szubsztrátkoncentráció grafikonok

9.1. A Michaelis-Menten kinetika első modellje

Az első kinetikai modell, amely sikeresen magyarázta a fenti jelenséget, Leonor Michaelis és Maud Menten nevéhez fűződik, és azon a ma már triviálisnak tűnő feltételezésen alapult, hogy az enzim és a szubsztrát között fizikai kapcsolat jön létre, ami egy átmeneti enzim-szubsztrát komplexet eredményez. Ezt a sémát a 9.1. egyenlet mutatja, ahol ES jelöli a ma már Michaelis nevével fémjelzett komplexet.

9.1. egyenlet

A fenti, legegyszerűbb séma a következő feltételezéseken alapul. Az enzim és a szubsztrát között pillanatszerűen gyors reakcióban kialakul az ES komplex, ezért ennek a részreakciónak a sebességi állandóival a modell nem is foglalkozik. Ezek helyett csak az egyensúlyi állandót (KS) (nem-kovalens E-S kölcsönhatás esetén ez egy disszociációs állandó) definiálják a 9.2. egyenlet szerint.

9.2. egyenlet

A modell szerint az ES komplex termékké bomlásának üteme, a katalitikus sebességi állandó, amelynek jelölése kcat, lényegesen alacsonyabb értékű, mint az egyensúlyi állandóban rejlő sebességi állandók. E szerint a modell szerint a termék irányú bomlás olyan alacsony ütemű, hogy (a mérés során) praktikusan nem befolyásolja az [E], [S] és [ES] egyensúlyi koncentrációkat.

Vezessük le, hogy a fenti reakció séma, és kiindulási feltételek esetén milyen függvény szerint függne a kezdeti sebesség a szubsztrát koncentrációjától.

A 9.1. egyenletben szereplő sémából következik a reakciósebességnek a 9.3. egyenlete, amely egy elsőrendű kémiai reakciót tükröz, amelyben a termékkeletkezés sebessége kizárólag egyfajta anyagnak, az ES komplexnek a koncentrációjával arányos.

9.3. egyenlet

A séma nem számol azzal, hogy az enzimből és a termékből a fordított irányú reakcióból szintén ES jöhet létre, mivel a reakció legelejét vizsgáljuk, amikor még nem keletkezett termék. Ezért is fontos hangsúlyozni, hogy az így definiált sebesség kezdeti, nulla időpillanathoz tartozó reakciósebesség (ezért V0 a jelölése).

Ahhoz, hogy olyan egyenlethez jussunk, amely ES nem ismert koncentrációja helyett ismert enzim és szubsztrát-koncentrációkat tartalmaz, a 9.2. egyenletet felhasználva ki kell fejeznünk az ES koncentrációt a kísérletben beállított, tehát ismert koncentrációkkal.

Ehhez vegyük figyelembe, hogy a szabad enzimkoncentráció, a teljes enzimkoncentráció, és az ES komplexben lévő enzimkoncentráció között a 9.4. egyenletben felírt, egyszerű összefüggés áll fenn:

9.4. egyenlet

A 9.4 egyenletet a 9.2 egyenlettel kombinálva kapjuk a 9.5. egyenletet:

9.5. egyenlet

Mindkét oldalt megszorozva az ES koncentrációval a 9.6. egyenletet kapjuk.

9.6. egyenlet

A 9.7. egyenletben az ES tartalmú tagokat egymás mellé rendezzük,

9.7. egyenlet

majd a 9.8. egyenletben kiemeljük az [ES]-t a szorzatok összeadásából:

9.8. egyenlet

Végül mindkét oldalalt elosztjuk [ES] szorzójával, így a 9.9. egyenlethez jutunk:

9.9. egyenlet

Ezzel az ismeretlen ES koncentrációt az ismert teljes enzimkoncentráció, a szabad szubsztrát koncentráció, és az egyensúlyi állandó segítségével fejeztük ki.

Amennyiben olyan kiindulási körülményt teremtünk, amelyben a teljes szubsztrát koncentráció nagyságrendekkel meghaladja a teljes enzimkoncentrációt, úgy az a szubsztrát mennyiség, amely ES komplexbe kerül, elhanyagolható lesz az összes szubsztrát mennyiségéhez képest. (Ez a kísérletek során rendszerint könnyen biztosítható, de érdemes megjegyezni, hogy az élőlényekben zajló valós folyamatokban az esetek jó részében nem teljesül). Emiatt a szabad szubsztrát koncentráció (a reakció elején) praktikusan megegyezik majd a teljes szubsztrát koncentrációval, tehát mind az [ET], mind az [S] kísérletesen meghatározott, ismert értékű adat.

A következő lépésben a 9.3 egyenlet alapján mindkét oldalt megszorozzuk a kcat sebességi állandóval, ami a kezdeti sebességet fogja megadni a 9.10. egyenlet szerint.

9.10. egyenlet

Vegyük észre, hogy az elérhető legmagasabb, tehát maximális sebességi értéket, amelynek jelölése Vmax, akkor kapjuk, ha az összes enzim ES komplexben van. Ebben az esetben a szubsztrát telíti az oldatban jelenlévő enzim molekulákat. Ekkor tehát [ES] = [ET]. A 9.10. egyenlet jobboldalán a számlálóban szereplő kcat ET szorzat tehát nem más, mint maga a Vmax. Ennek figyelembevételével kapjuk a 9.11. egyenletet, ami a legegyszerűbb, eddig tárgyalt enzimkinetikai modell végső egyenlete:

9.11. egyenlet

Ez az egyenlet egy derékszögű hiperbola függvény, amelynek általános felírása: Y=P1X/(P2+X), ahol X a független változó, jelen esetben a szubsztrát koncentráció, Y a függő változó, jelen esetben a kezdeti sebesség, a P1 és P2 pedig a függvény paraméterei, jelen esetben a két állandó, a Vmax és a KS.

Vegyük észre, hogy ez az egyenlet kiváló összhangban van a már említett, a 9.3. ábrán is bemutatott tapasztalati [S]-V0 összefüggéssel az alábbiak szerint. Amikor [S]<<KS, akkor [S] a nevezőben elhanyagolható, és a 9.12. egyenlethez jutunk:

9.12. egyenlet

A 9.12. egyenletben a szubsztrát koncentráció szorzója két állandó hányadosa, amely hányados maga is állandó. A Ks értékéhez képest elhanyagolhatóan alacsony szubsztrát koncentráció tartományban tehát a kezdeti sebesség – a tapasztalattal egyezően –, lineáris függvénye a szubsztrát koncentrációnak, tehát ez egy (szubsztrátra nézve) elsőrendű reakció egyenlete.

Amikor [S]>>KS, akkor a 9.11. egyenletben éppenséggel a KS lesz elhanyagolható az [S] értékéhez képest a nevezőben. Az elhanyagolást elvégezve a 9.13. egyenlethez jutunk:

9.13. egyenlet

Amikor tehát a szubsztrát koncentrációja nagymértékben meghaladja a KS értékét, a szubsztrát telíti az enzimet, minden enzim ES komplexbe kerül, a kezdeti sebesség eléri a maximálisan elérhető értéket, további szubsztrát koncentráció növelésével a sebesség már nem növelhető. Ebben a szubsztrát koncentráció tartományban a kezdeti sebesség tehát már gyakorlatilag nem függ a szubsztrát koncentrációjától, a reakció a szubsztrátra nézve nulladrendű. A 9.3. ábránszereplő grafikont emiatt szokás telítési görbének, vagy szubsztráttelítési görbének nevezni.

Amikor a szubsztrát koncentrációja éppen megegyezik a KS számértékével, akkor a reakció kezdeti sebessége éppen a Vmax érték fele. Az itt levezetett 9.11. egyenlet tehát leíró értelemben jól használható. Ugyanakkor mégis alapvető problémákat vet fel. Minél hatékonyabb egy enzim, annál inkább tarthatatlan az a kiindulási feltételezés, hogy az enzimkatalízis során a nagysebességgel zajló szubsztrát fogyás ne mozdítaná be az enzim, a szubsztrát és az ES komplex között – az eredeti feltételezés szerint pillanatszerűen gyorsan - kialakuló egyensúlyt. A fenti leírás tehát éppen a leghatékonyabb enzimek jellemzésére nem alkalmas.

A másik probléma az, hogy a fenti modell ellentmondásban van a termodinamikai bevezetőben leírtakkal is. A KS egy disszociációs állandó, ami mint ilyen, kötéserősség, más szóval affinitás jellemzésére is alkalmas. A KS ebben a modellben megadja, hogy az enzim mennyire stabil kölcsönhatást létesít a szubsztráttal, milyen „erősen” köti azt. A modell szerint minél alacsonyabb a KS, annál hatékonyabb az enzim, hiszen annál alacsonyabb szubsztrát koncentráción éri el a reakció sebessége Vmax értékének a felét. Csakhogy a valóságban minél stabilabb kölcsönhatást létesít az enzim a szubsztráttal, annál lassabbnak kell lennie a reakciónak, hiszen az enzim éppenséggel stabilizálná a szubsztrátot. Az enzimnek természetesen meg kell kötnie a szubsztrátot, de igazán hatékonyan a rendkívül instabil átmeneti állapottal kell kölcsönhatást létesítenie, azt kell stabilizálnia (lásd 8. fejezet).