9.2. A Michaelis-Menten kinetika továbbfejlesztett modellje

A fent említett ellentmondások miatt az enzimkinetikai modellt tovább kellett fejleszteni az alábbiak szerint.

A továbbfejlesztett séma már számol az enzim és a szubsztrát ES komplexhez vezető reakciójának sebességi állandójával (jelölése k1), valamint az ES komplex enzimre és szubsztrátra történő visszaalakulásának sebességi állandójával (jelölése k-1). A sémát a 9.14. egyenlet mutatja.

9.14. egyenlet

A modell szerint az enzim és a szubsztrát oldatának összekeverésekor nem egy dinamikus egyensúly, hanem egy stacionárius állapot (angolul steady-state) áll be szinte pillanatszerű gyorsasággal. A stacionárius állapotban a körülményektől függően akár hosszú ideig állandó lehet az ES komplex koncentrációja. (Pontosabban megfogalmazva az ES koncentrációja a pillanatszerű emelkedés után folyamatosan csökken, de ez a csökkenés jóval kisebb ütemű, mint a szubsztrát fogyásának vagy a termék keletkezésének az üteme, és a modellben elhanyagolható.) Ehhez az kell, hogy az ES komplex kialakulásának k1 sebességi állandóval jellemzett üteme éppen megegyezzen az ES komplex elbomlásának ütemével. Ezt a 9.2. ábra szemlélteti.

9.2. ábra: A stacionárius modell: az ES komplex azonos ütemben keletkezik és fogy, koncentrációja állandó

9.2. ábra: A stacionárius modell: az ES komplex azonos ütemben keletkezik és fogy, koncentrációja állandó

A reakciót szubsztrát hozzáadásával indítjuk. (Az ábra arányai csalnak, hogy egyetlen oldalon be lehessen mutatni a lényeget. A stacionárius szakasz valójában már néhány ezredmásodperc alatt kialakul, és akár percekig is fennmaradhat. A valóságban az [S] sokkal magasabbról indul, hiszen [S] >> [E].)

A bomlás egyrészt végbemehet a termék kialakulásának irányában k2 sebességi állandóval, illetve ezzel ellentétes irányban, szabad enzimet és szubsztrátot eredményezve k-1 sebességi állandóval. A stacionárius állapot kialakulását a 9.2. ábra illusztrálja, annak fent körülírt feltételét pedig a 9.15. egyenlet írja le.

9.15. egyenlet

Ezt a feltételezést elsőként G.E. Briggs és James B.S. Haldane javasolta, ennek ellenére az alábbiakban kifejtett, továbbfejlesztett modellt is Michaelis-Menten kinetikának, és az abból fakadó egyenletet Michaelis-Menten egyenletnek hívjuk. Az egyenletben k1[E][S] sebességgel keletkezik az ES komplex, amely visszafelé k-1[ES] sebességgel, termék irányban pedig k2[ES] sebességgel bomlik. A keletkezés és a kétirányú elbomlás eredő sebessége, vagyis az ES komplex koncentrációjának változása nulla.

A következőkben a 9.15. egyenletet rendezzük át több lépésben úgy, hogy ismét a mérhető, illetve kísérletesen megszabott [E] és [S] koncentrációk szerepeljenek a végső egyenletben. Ez a továbbfejlesztett modell is alapfeltételként szabja meg, hogy a szubsztrát koncentrációja nagyságrendekkel haladja meg az enzimkoncentrációt. A termékkeletkezés üteme itt is egyszerűen megadható a 9.16. egyenlet szerint, amely analóg az első modell 9.3. egyenletével.

9.16. egyenlet

A korábbi modellben kcat néven jelzett sebességi állandó helyett a továbbfejlesztett sémából származó k2 megnevezést alkalmazzuk.

A 9.15. egyenletet átrendezve kapjuk a 9.17. egyenletet.

9.17. egyenlet

A korábban már látott módon, a szabad enzim koncentrációját a teljes enzimkoncentráció és az ES koncentráció különbségeként fejezzük ki a 9.18. egyenlet szerint.

9.18. egyenlet

Az egyenletben egyszerű algebrai átalakítással felbontjuk a zárójeles tagot, így a 9.19. egyenletet kapjuk.

9.19. egyenlet

Ezután az [ES] tagot tartalmazó részeket azonos oldalra rendezve adódik a 9.20. egyenlet.

9.20. egyenlet

Ebből az egyenletből kiemeljük az [ES] szorzót, így a 9.21. egyenlethez jutunk.

9.21. egyenlet

A 9.22. egyenletben az [ES] tagot baloldalra rendezzük.

9.22. egyenlet

A jobb oldalon a számlálót és a nevezőt is elosztjuk a k1 sebességi állandóval, ami a 9.23. egyenlethez vezet.

9.23. egyenlet

A nevezőben megjelenő törtre a 9.24. egyenletben definícióként bevezetjük a Michaelis-állandó (Michaelis-konstans) elnevezést, amelynek rövidítése KM.

9.24. egyenlet

Mint látható a KM azt mutatja meg, hogy milyen arányban van az ES komplex kétirányú elbomlásának és egyirányú keletkezésének az üteme. Más szóval azt jelzi, hogy mennyire bomlékony az ES komplex. A 9.1. táblázat néhány enzim-szubsztrát pár jellemző KM értékét foglalja össze.

9.1. táblázat: Néhány enzim Michaelis-konstans értéke

9.1. táblázat: Néhány enzim Michaelis-konstans értéke

A 9.24. egyenletet a 9.23. egyenletbe építve a 9.25. egyenletet kapjuk.

9.25. egyenlet

A 9.16. egyenlet és a 9.25. egyenlet kombinálása a 9.26. egyenlethez vezet.

9.26. egyenlet

Ahogy az egyszerűbb modell 9.10. egyenlete nyomán már jeleztük, az elérhető legmagasabb, Vmax sebességi értéket akkor kapjuk, ha az összes enzim ES komplexben van, vagyis [ES] = [E]T. A 9.26. egyenletben szereplő k2ET szorzat tehát nem más, mint a Vmax. Ennek figyelembevételével kapjuk a 9.27. egyenlet a kiemelten fontos Michaelis-Menten egyenletet, ami a továbbfejlesztett enzimkinetikai modell végső egyenlete:

9.27. egyenlet

Vegyük észre, hogy ez az egyenlet formailag megegyezik a korábbi modell 9.11. egyenletével, ezért a 9.12. és 9.14. egyenletben ismertetettek szerint ez az egyenlet is összhangban van a tapasztalattal. Abban a szubsztrát koncentráció tartományban, ahol [S]<<KM, a V0 lineárisan függ [S] értékétől, míg abban a tartományban, ahol [S]>>KM, a reakció már nem függ az [S] értékétől, és a maximális, Vmax sebességgel zajlik.

Amennyiben az [S] értéke éppen megegyezik a KM számértékével, akkor a reakció a Vmax felének megfelelő sebességgel zajlik.

Formailag tehát sok a hasonlóság, de az értelmezésben lényegi különbségek vannak. Vegyük észre, hogy az egyszerű modell KS állandója, és a továbbfejlesztett modell KM állandója nem ugyanazt fejezik ki. A 9.28. egyenlet mutatja, hogy a disszociációs állandó jellegű KS egyensúlyi állandó hogyan származtatható a k1 és k-1 sebességi állandókból.

9.28. egyenlet

Mint azt már írtuk, a KS egyfajta affinitási jellemző, amely jelzi, hogy az enzim milyen erősen köti a szubsztrátot. A 9.28. és a 9.24. egyenlet összehasonlításából látható, hogy a KM csak akkor lenne egyenértékű a KS állandóval, ha igaz lenne, hogy k2 << k-1, azaz ha az ES komplex termék irányú átalakulásának az üteme sokkal alacsonyabb lenne, mint a szubsztrát irányú visszabomlásának az üteme. Márpedig minél hatékonyabb egy enzim, annál inkább fordított a helyzet, annál inkább igaz, hogy k2 >> k-1.

Tehát minél hatékonyabb az enzim, annál kevésbé tekinthető a KM egyfajta enzim-szubsztrát affinitási jellemzőnek. Ez a fajta értelmezés, mint már említettük, amúgy is ellentmondana az enzimkatalízis termodinamikai leírásának.

Míg a KM és a KS nem feleltethető meg egymásnak, a továbbfejlesztett modellben szereplő k2 sebességi állandó, amennyiben az ES komplex valóban egyetlen lépésben bomlik enzimre és termékre, megfelel az egyszerűbb modellben bevezetett kcat sebességi állandónak. (Több átmeneti állapoton keresztül zajló, összetettebb katalízis mechanizmus esetén a kcat sebességi állandót olyan egyenlet adja meg, amelyben minden egyes lépés sebességi állandója szerepel). A kcat tulajdonképpen az enzimnek, mint kémiai katalizátornak a hatékonyságát jellemzi attól az állapottól kezdve, amikor az ES komplex már kialakult.

Vizsgáljuk meg, hogy a 9.29. egyenlet és 9.30. egyenletek szerint mi a kcat sebességi állandó fizikai jelentése.

9.29. egyenlet

9.30. egyenlet

Mint láttuk, a maximális sebesség a kcat és a teljes enzimkoncentráció szorzata. A 9.30. egyenlethez úgy jutunk, hogy elosztjuk a termék koncentrációváltozásának 9.29. egyenletben kifejtett sebességét a teljes enzim koncentrációval. Mivel a termék és az enzim azonos oldattérfogatban vannak, az arány mennyiségek hányadosa lesz. Azt adja meg, hogy egyetlen enzimmolekula időegységenként hány termék molekula keletkezését katalizálja. A kcat sebességi állandót emiatt átviteli számnak is nevezik, dimenziója 1/t, ahol t az időt jelöli. A 9.2. táblázat néhány reprezentatív enzim-szubsztrát párra vonatkozó kcat értéket mutat be.

9.2. táblázat: Néhány enzim átviteli száma

9.2. táblázat: Néhány enzim átviteli száma

Természetesen minél magasabb a kcat értéke, annál hatékonyabb az enzimreakció. Vegyük észre, hogy a továbbfejlesztett modellben, amennyiben a kcat = k2, ez a sebességi állandó a KM állandót definiáló törtben is szerepel, mégpedig a számlálóban. A magas kcat érték tehát növeli a KM állandót. Ugyanakkor az is belátható, hogy minél alacsonyabb a KM értéke, annál hatékonyabb az enzim, annál alacsonyabb szubsztrát koncentráción éri el a fél-maximális sebességet a reakció. Mindezek alapján kérdés, hogyan jellemezhető legjobban az enzim hatékonysága?

A leghatékonyabb enzimtől azt várjuk, hogy már nagyon alacsony szubsztrát koncentráción is magas sebességgel dolgozik, és magas az átviteli száma is. Mint már kifejtettük, olyan alacsony szubsztrát koncentráció tartományban, ahol [S]<<KM, a reakciósebesség lineárisan függ a szubsztrát koncentrációjától. Ezt mutatja a 9.31. egyenlet.

9.31. egyenlet

Az egyenletben szereplő kcat/KM hányados egy másodrendű reakció sebességi állandója. Ez a hányados mutatja meg, hogy a „legnehezebb” szituációban, amikor a szubsztrát koncentrációja nagyon alacsony, mennyire hatékony az enzim. A kcat/KM hányadost emiatt „katalitikus hatékonyságnak” is szokták nevezni. Ugyanez a hányados azt is megmutatja, hogy az enzim milyen mértékben szelektív egy szubsztráton. Egy olyan oldatban, ahol azonos, alacsony koncentrációban többféle szubsztrát is jelen van, az enzim ezeket a rájuk vonatkozó kcat/KM értékek arányában fogja átalakítani. A kcat/KM hányadost ezért „specifitási állandónak” is szokták nevezni.

Nézzük meg, hogy a modellünk szerint mi szab határt a katalitikus hatékonyságnak, mi jellemző a lehető leghatékonyabb enzimekre. A 9.32. egyenletsorban 9.31. egyenletben szereplő kcat illetve KM állandókba helyettesítsük be a modellből, illetve a definícióból adódó sebességi állandókat.

9.32. egyenlet

Az egyenletrendszer jobboldali része szerint akkor, és csak akkor, ha a k2 >> k-1, a nevezőben a k-1 tag elhanyagolható lesz, és a k2 taggal egyszerűsíteni lehet. A k2 >> k-1körülmény azt jelenti, hogy az ES komplex szinte kizárólag termék irányba bomlik, a fordított irányban nem. A reakció kcat/KM értéke ekkor jó közelítéssel megegyezik k1 értékével. Ez tehát azt jelenti, hogy ekkor kizárólag az enzim és szubsztrát ES komplexhez vezető találkozásának üteme szabja meg a reakció sebességét. Magától értetődő, hogy ennél gyorsabb a reakció nem is lehet, hiszen nem keletkezhet nagyobb ütemben termék, mint amilyen ütemben ES komplex keletkezik az enzimből és a szubsztrátból.

Első megközelítésben a leghatékonyabb enzimek működésének tehát a diffúzió szab határt, amely megszabja, hogy milyen gyakran találkozhat az enzim és a szubsztrát. A diffúzió sebessége jól számolható a diffundáló molekulák méretének és az oldat viszkozitásának ismeretében. A 9.3. táblázat néhány „tökéletes enzim” természetes szubsztrátokon meghatározott kcat/KM értékét foglalja össze. A táblázat adatai arra utalnak, hogy az adott enzimatikus reakciók sebességét a diffúzió határozza meg.

9.3. táblázat: Néhány enzim katalitikus hatékonysága

9.3. táblázat: Néhány enzim katalitikus hatékonysága

Egyes enzimreakciók esetében azonban kiderült, hogy azok nagyobb sebességgel zajlanak, mint a számolt diffúzió sebessége. Legalább két olyan körülmény ismert, amely ilyen jelenséget eredményezhet. Egyes szubsztrátok jelentős töltéssel bírnak. Amennyiben az enzim szubsztrátkötő felszíne szintén jelentős, a szubsztrátéval ellentétes töltéssel bír, úgy a viszonylag távolra ható elektrosztatikus kölcsönhatás, és annak orientáló jellege miatt az enzim szubsztrátkötő helye és a szubsztrát hatékonyabban talál egymásra, mint azt az egyszerű diffúzió lehetővé tenné.

A másik lehetőséget arra, hogy a szubsztrát ne egyszerű diffúzióval találkozzon az enzimmel, a multienzim komplexek szolgáltatják. Az anyagcsere folyamatok során rendszerint számos köztes terméken keresztül alakul át egy-egy kiindulási anyag végső termékké. Az egyik lépést katalizáló enzim terméke ilyenkor a soron következő lépést katalizáló enzim szubsztrátja. Amennyiben ezek az enzimek egy nagyobb multi-enzim komplex alegységei, úgy a keletkező köztes termékek enzimről enzimre „adogatódhatnak” anélkül, hogy az oldatba kerülve diffúzióval jutnának a soron következő enzimhez.