9.3. A kezdeti sebesség értékek és a fő kinetikai paraméterek meghatározása.

A kinetikai mérések során rendkívül fontos, hogy a hőmérsékletet állandó értéken tartsuk, és ez az érték lehetőleg legyen közel a vizsgált enzim hőmérséklet optimumához. A reakció során a pH értékét is állandóan kell tartani megfelelő pufferek alkalmazásával. Minden enzimreakcióhoz tartozik egy optimális pH érték, érdemes az ennek megfelelő pH értéket beállítani. Olyan puffert kell választani, amely önmagában nem befolyásolja a vizsgált kémiai reakciót, illetve a detektálást. Az ATP-ázok aktivitását például gyakran a keletkező foszfát mérésén keresztül vizsgálják. Ilyen esetben természetesen nem lehet foszfát puffert alkalmazni (a biológiai pufferekről lásd 2.5.7. fejezet).

Amint az a fejezetben már többször említésre került, egy általánosan „P”-vel jelzett terméket eredményező (enzimkatalizált) kémiai reakció sebessége (V0) definíció szerint nem más, mint a P anyag koncentrációjának időbeni változása: V0 = d[P]/dt. Egy általánosan felírt S → P reakció esetén az előzővel egyenértékű sebesség definíció az, amely a szubsztrát koncentráció ([S]) csökkenését veszi figyelembe: V0 =  −d[S]/dt. A V0 méréséhez tehát vagy a termék, vagy a szubsztrát koncentrációját kell mérnünk.

A kémiai átalakulás minden esetben elektronszerkezet-változással jár. A megváltozott elektronszerkezet megváltozott fény általi gerjeszthetőséget is jelent, ami az esetek egy részében spektroszkópiai módszerekkel jól mérhető. Legegyszerűbb esetben a termék optikai tulajdonságai, fényelnyelési, esetleg fluoreszcencia spektruma mérhetően eltérnek a szubsztrát (és minden más oldatkomponens) említett paramétereitől. Ilyen esetben a termék keletkezése, illetve a szubsztrát fogyása folyamatában követhető. Megfelelő koncentrációtartományban a fényelnyelés (abszorbancia) mértéke, fluoreszcencia esetén pedig a kibocsájtott fény intenzitása egyenesen arányos annak a molekulának a koncentrációjával, amely a fényt elnyeli, illetve kibocsájtja. Ennek alapján a spektroszkópiai méréssel a termék (vagy a szubsztrát) koncentrációjának időbeli változása pontosan mérhető.

Amennyiben sem a termék, sem a szubsztrát nem rendelkezik jól mérhető optikai tulajdonságokkal, akkor is lehetőség nyílhat spektroszkópiai mérésre, amennyiben a keletkezett terméket egy specifikus, pillanatszerűen lejátszódó kémiai reakcióba lehet vinni (kapcsolt reakció), amelynek eredményeként optikailag aktív (fényelnyelő, illetve fluoreszkáló) molekula keletkezik. Ha ez a második reakció olyan körülmények között zajlik, amely összeegyeztethető az enzimatikus reakció során alkalmazandó oldatkörülményekkel (pH, hőmérséklet) akkor az ilyen típusú mérés is lehet folyamatos.

Ha azonban ez a második reakció csak az enzimreakcióval össze nem egyeztethető körülmények között megy végbe (például extrém pH értéken, vagy magas hőmérsékleten), akkor a kinetikai mérést csak szakaszosan lehet elvégezni. Ilyenkor abból az oldatból, amelyben az enzimreakciót elindítottuk, különböző időpillanatokban mintát veszünk, az enzimet az oldatösszetétel megfelelő, gyors megváltoztatásával inaktiváljuk, és elvégezzük az optikai jelet generáló második reakciót. Érdemes megjegyezni, hogy olyan kémiai reakciókat, amelyek proton felszabadulással, vagy proton felvétellel járnak, a pH-változáson keresztül is követni lehet. Pontosabban, az ilyen esetekben egy automata készülék, az úgynevezett pH-stat alkalmazásával a pH-t állandóan tartják. A reakciót annak a meghatározásán keresztül követik, hogy az idő függvényében a készüléknek mennyi savat vagy bázist kell a reakciótérbe adagolnia ahhoz, hogy a pH állandó maradjon.

A kezdeti sebesség folyamatos méréssel történő meghatározásának elvét a 9.1. ábra baloldalon lévő grafikonja illusztrálja. A reakciót vagy az enzim, vagy a szubsztrát bemérésével indítjuk, és az oldat gyors összekeverését követően haladéktalanul elkezdjük a mérést. A mérés során természetesen csökken a szubsztrát koncentrációja. Ezzel kapcsolatban arra kel törekedni, hogy ez a csökkenés elhanyagolható mértékű legyen, hiszen a csökkenő szubsztrát koncentráció csökkenő sebességet eredményez, ahogy azt a 9.1. ábra baloldalán lévő grafikonok is mutatják. Ennek a nem kívánt effektusnak a mértéke ráadásul függ a szubsztrát koncentrációjától, ami a 9.1. ábra jobboldalán szereplő, telítési görbéről is leolvasható. Jóval a KM érték alatti szubsztrát koncentráció esetén az [S]-V0 függvény jó közelítéssel lineáris, míg jóval a KM érték feletti szubsztrát koncentráció tartományban a V0 csaknem független az [S] értékétől.

Ebből következik, hogy minél alacsonyabb szubsztrát koncentráción dolgozunk, arányaiban annál nagyobb sebességcsökkenést okoz azonos arányú (pl. 10%-nyi) szubsztrát koncentráció csökkenés. Jóval a KM érték alatti szubsztrát koncentráció tartományban 10 %-os [S] csökkenés ~ 10%-os V0 csökkenést eredményez, míg jóval a KM érték feletti tartományban ennél lényegesen kisebb mértékű a V0 csökkenés. Általánosan elfogadott javaslat, hogy a kezdeti sebességet olyan módon kell megmérni, hogy a mérés időtartama alatt a szubsztrát koncentrációja 10%-nál kisebb mértékben csökkenjen. Ilyen feltétel mellett a mért kezdeti sebesség értéke 10 % alatti hibával lesz meghatározva.

A fő kinetikai paraméterek, tehát a Vmax és a KM értékek, meghatározásához különböző kezdeti szubsztrát koncentrációkon ([S]) mérjük meg a kezdeti sebesség értékeket. Amennyiben megfelelően választottuk meg a szubsztrát koncentráció tartományt, úgy a kezdeti sebesség értékeket a szubsztrát koncentráció függvényében ábrázolva a mérési pontok egy telítési görbére illeszkednek, ahogy azt a 9.1. ábra jobboldalon szereplő grafikonja illusztrálja.

A kinetikai paraméterek minél pontosabb meghatározásához a kezdeti szubsztrát koncentrációt széles határok között érdemes változtatni. Az [S] értékével érdemes a ~ 0,2 KM – 5 KM tartományt legalább 8 mérési ponttal lefedni. Azt, hogy pontosan milyen koncentráció tartományban kell mérni, természetesen csak előzetes próbálkozások alapján lehet kideríteni, amelyek során becslést adhatunk a KM értékére.

Miután a fent említett összefüggések figyelembevételével meghatároztunk egy sereg [S] értékhez tartozó V0 értéket, minden információ rendelkezésünkre áll ahhoz, hogy ezeknek az elsődleges mérési adatoknak az alapján meghatározzuk a fő kinetikai paramétereket, azaz a Vmax, akcat, és a KM értékét.

Az első kinetikai vizsgálatokra még olyan korszakban került sor, amikor nem léteztek számítógépek, így az adatsorok kiértékelése lényegesen nagyobb problémát jelentett. A 9.1. ábra jobboldalán látható grafikon esetében az [S] - V0 függvény egy telítési görbe. Pusztán vizuális kiértékeléssel természetesen nem lehet megállapítani, hogy ez az érték milyen maximális, tehát Vmax értékhez tart. Ugyanilyen okból azt sem lehet ilyen módon megállapítani, hogy a Vmax/2 értékhez tartozó szubsztrát koncentráció, amely megegyezik a KM értékével, mekkora. Számítógépek hiányában a hiperbolához való illesztés igen nehézkes volt.

Az ilyen nem lineáris összefüggések kiértékelésére, tipikus megoldásként a következő eljárást vezették be. A mért adatokra vonatkozó összefüggés egyenletét úgy alakították (transzformálták) át, hogy annak formája lineáris legyen, vagyis a származtatott adatok grafikus ábrázolásakor a pontok egyenesre essenek. Így a probléma leegyszerűsödött egy egyenes illesztési feladatra, amelyet számítógép nélkül is el lehetett végezni. A kinetikai paraméterek meghatározására ma már nem ezt a módszert alkalmazzák (hanem számítógépes programokkal nem-lineáris regresszióval illesztenek, lásd később), mégis fennmaradt ez az eljárás, mert mint a későbbiekben látni fogjuk, enzim gátlások esetén a linearizált egyenletek grafikonjai világosan megmutatják, hogy a vizsgált inhibitor milyen mechanizmussal gátolja az enzimet.

A Michaelis-Menten kinetikát leíró 9.27. egyenlet legelterjedtebb linearizálását Hans Lineweaver és Dean Burk vezette be. Az általuk javasolt transzformálás a róluk elnevezett Lineweaver-Burk egyenlethez vezet (lásd 9.35. egyenlet). A transzformálás a következőképpen történik.

Vesszük a 9.27. egyenlet mindkét oldalának reciprokát, ami a 9.33. egyenlethez vezet.

9.33. egyenlet

A 9.34. egyenletet úgy kapjuk, hogy felbontjuk a 9.33. egyenlet jobboldalán szereplő tört számlálóját.

9.34. egyenlet

Ekkor a 9.34. egyenlet jobboldalán lévő második tagban szereplő törtet egyszerűsíteni lehet, ami a 9.35. egyenlethez vezet.

9.35. egyenlet

Az ehhez az egyenlethez tartozó grafikon nem más, mint a 9.1. ábra jobboldali részén található grafikon „kettősreciprok” formája. Míg ott a V0 értékeket ábrázoltuk az [S] függvényében, itt az 1/V0 értékeket ábrázoljuk a 1/[S] függvényében. Mint ahogy azt a 9.3. ábra is illusztrálja, a 9.35. egyenlet grafikonja egy egyenes.

9.3. ábra: A Lineweaver-Burk féle kettősreciprok ábrázolás.

9.3. ábra: A Lineweaver-Burk féle kettősreciprok ábrázolás.

 

Az egyenes általános egyenlete, Y=a*X+b szerint itt Y=1/V0; X=1/[S]; a=KM/Vmax és b=1/Vmax. Az egyenes meredeksége, „a” (ami nem más, mint az egyenes X-tengellyel bezárt szögének tangense) tehát megadja a KM/Vmax értéket, az Y tengely metszete (ahol X, tehát 1/[S] értéke 0) megadja az 1/Vmax értéket, míg az X-tengely metszete, (ahol Y, tehát 1/V0 értéke 0) megadja a −1/KM értéket.

A meredekség, és bármelyik tengelymetszet alapján tehát mind a Vmax, mind a KM érték meghatározható. Ez a megoldás ugyan elegánsan egyszerű, de az ezzel az eljárással történő kiértékelés komoly hibákhoz vezethet. A kettősreciprok ábrázolásban a legkisebb szubsztrát koncentrációkhoz tartozó legkisebb, ezért óhatatlanul a legnagyobb mérési hibával meghatározott, kezdeti sebességadatok reciprokai lesznek a legnagyobb számértékű mérési adatok. Így ezek befolyásolják legnagyobb mértékben az illesztett egyenes paramétereit.             Emiatt mind a KM, mind pedig a Vmax így meghatározott értéke pontatlan lehet.

A számítógépek elterjedésével új megoldás született az adatok kiértékelésére. Ez a nem-lineáris regresszió. Ennek során az elsődleges, [S] - V0 adatsorhoz illesztünk megfelelő szoftver alkalmazásával a 9.27. egyenletnek megfelelően derékszögű hiperbolát. A program egy algoritmus alapján, iteratív módon megkeresi azt a Vmax; KM adatpárt, amelyek 9.27. egyenletbe történő behelyettesítésével kapott függvényre a mérési pontok a legkisebb eltéréssel illeszkednek.

A legtöbb kiértékelő program igényli, hogy megadjunk egy-egy Vmax illetve KM értéket, amellyel elindítja az iteratív optimumkeresést. Amennyiben tudjuk, hogy a mérés során mekkora volt a bemért enzim [E]T koncentrációja, úgy a kiértékelés során kapott Vmax érték ismeretében a 9.26. egyenlet alapján a Vmax értéket az [E]T értékével elosztva megkapjuk az átviteli számot, vagyis a kcat értékét is.

Érdemes megjegyezni, hogy amennyiben csak a kcat/KM hányadost, tehát a katalitikus hatékonyságot kívánjuk megmérni, úgy az közvetlenül, akár egyetlen méréssel is meghatározható. A 9.31. egyenlethez vezető gondolatmenet alapján amennyiben a V0 értéket a KM értékénél nagyságrendekkel alacsonyabb szubsztrát koncentráción határozzuk meg ismert [E]T bemérési enzim koncentráción, úgy a 9.31. egyenlet alapján a kcat/KM hányados közvetlenül meghatározható. Ezt a fajta mérést azonban csak olyan enzim-szubsztrát pároknál lehet elvégezni, amelyeknél a keletkező termék nagyon nagy érzékenységgel mérhető, hiszen nagyon alacsony szubsztrát koncentráción mérve nagyon alacsony termék koncentrációkat kell pontosan meghatároznunk az idő függvényében.