9.4. Enzimgátlás típusok

Az enzimek központi szerepet játszanak az életfolyamatokban. A legtöbb enzim esetében igaz, hogy annak működésére csak bizonyos körülmények között van szükség, és amikor ezek a körülmények megszűnnek az enzim aktivitása felesleges, vagy akár káros is lehet. Ennek megfelelően a legtöbb enzim aktivitása szabályozás alatt áll. Ez a szabályozás rendkívül sok szinten megtörténhet, kezdve az enzim génjének transzkripciós szabályozásától egészen az enzim szabályozott lebontásáig (lásd 17. fejezet). Ebben a fejezetben kizárólag olyan reverzibilis, nem kovalensen kötődő inhibitorok eseteit vesszük sorra, amelyek az enzimnek a szubsztrát kötését és/vagy katalitikus apparátusának működését gátolják. Az ilyen gátlószerek mechanizmusa három fő csoportba osztható: kompetitív, unkompetitív és kevert típus. A kevert típus további két altípusra, a nonkompetitív és vegyes típusú gátlásokra osztható.

Azt, hogy egy adott gátlószer melyik típusba tartozik, kinetikai mérésekkel meg lehet határozni.

Az ilyen méréseknél a leggyakrabban úgy járunk el, hogy különböző, egy-egy kísérletben állandóan tartott bemérési inhibitor koncentráció mellett a 9.3. fejezetben leírt módon meghatározzuk a Vmax és KM kinetikai paramétereket. Amennyiben a mérési adatokat a Lineweaver-Burk féle kettősreciprok ábrázolásban értékeljük ki, a kapott egyeneseknek a gátolatlan reakcióra vonatkozó egyenestől való eltérése fényt derít arra, hogy az inhibitor melyik gátlási típus szerint működik.

9.4.1. Kompetitív gátlás

A kompetitív (versengő) inhibitorok versengenek a szubsztráttal az enzim szubsztrátkötő helyéért, mivel az inhibitor és a szubsztrát egymással átfedő (részben, vagy egészben megegyező) kötőhelyre kötődnek. Hármas komplex, tehát olyan, amelyben az enzimhez egyidejűleg a gátlószer és a szubsztrát is kötődne, nem jöhet létre. A kompetitív inhibitorral komplexet alkotó enzim tehát tökéletesen inaktív.

Egyfajta köznyelvi kifejezéssel élve a kompetitív inhibitorok esetében gyakran úgy fogalmaznak, hogy azok mintegy „leszorítják”, vagy „kiszorítják” a szubsztrátot az enzim kötőhelyéről. Ezek a szemléletesnek szánt kifejezések sajnos éppenséggel félrevezetőek. Szó sincs ugyanis arról, hogy az inhibitor az ES komplexhez kötődve valamilyen módon aktívan „kitúrná” a szubsztrátot az enzim kötőzsebéből. Ez már csak azért sem lehetséges, mert hármas komplex, mint említettük, itt nem alakul ki. Pusztán arról van szó, hogy két kötési egyensúly alakul ki párhuzamosan. A koncentrációviszonyoknak megfelelően az oldatban kialakul egy enzim – inhibitor kötődésre vonatkozó egyensúly, valamint egy enzim – szubsztrát kötődésre vonatkozó egyensúly. (Ez utóbbi a szubsztrát átalakítása miatt nem valódi egyensúly, hanem helyesebben megnevezve egy stacionárius állapot, lásd 9.2. ábra).

Az enzim és az inhibitor között kialakuló egyensúlyt a 9.36. egyenlet írja le, ahol a KI egy disszociációs állandónak felel meg.

9.36. egyenlet

A két egyensúly egymástól nem független, hiszen az azokban kialakuló ES és EI komplexek ugyanazzal a szabad E enzimmel tartanak egyensúlyt. Az inhibitor koncentráció növelésével az EI koncentráció növekedése csak az ES koncentráció csökkenésével valósulhat meg, és fordítva, a szubsztrát koncentráció növelése csak az EI komplex koncentrációjának rovására növelheti az ES komplex koncentrációját. A kompetitív gátlás a 9.4. ábra szemlélteti.

9.4. ábra: A kompetitív gátlás sémája

9.4. ábra: A kompetitív gátlás sémája

A Michaelis – Menten egyenlet levezetésénél felhasználtuk azt a tényt, hogy a teljes enzimkoncentráció felírható a szabad enzim koncentrációjának és a szubsztráttal alkotott komplexben lévő enzim koncentrációjának az összegeként: [E]T=[E]+[ES]. Kompetitív inhibitor jelenlétében azonban [E]T=[E]+[ES]+[EI]. Amennyiben ennek az eltérésnek a figyelembevételével vezetjük le a Michaelis - Menten egyenletet, úgy egy itt részleteiben nem bemutatott levezetés végén a 9.37. egyenlethez jutunk.

9.37. egyenlet

A 9.37 egyenletben szereplő α jelentését a 9.38. egyenlet tartalmazza.

9.38. egyenlet

Jól látható, hogy inhibitor hiányában az α értéke 1, tehát visszakapjuk az eredeti egyenletet, míg inhibitor jelenlétében az α értéke egy egynél nagyobb szám. Minél nagyobb mértékben haladja meg az inhibitor koncentrációja a KI disszociációs állandó értékét, annál nagyobb az α értéke. A 9.37 egyenlet világosan jelzi, hogy amennyiben a kinetikai paramétereket kompetitív inhibitor jelenlétében határozzuk meg, úgy az így kapott Vmax érték megegyezik majd az inhibitor távollétében zajló kísérletekből kapott értékkel, míg a KM értéke magasabb lesz, mint inhibitor hiányában. Mivel ennél a gátlási típusnál az inhibitor verseng a szubsztráttal, intuitíven belátható, hogy kellően magas, „végtelen” szubsztrát koncentráción az inhibitor jelenléte elhanyagolható lesz, tehát a Vmax érték nem módosul, ugyanakkor a fél-maximális sebességhez tartozó szubsztrát koncentráció, amely megadja a KM számértékét, magasabb lesz, mint inhibitor hiányában. A 9.37. egyenlet éppen ezt fejezi ki.

Amennyiben a kettős reciprok ábrázoláshoz átrendezzük a 9.37 egyenletet, a 9.35 egyenlet párjaként a 9.39. egyenlethez jutunk.

9.39. egyenlet

Az ehhez tartozó, a 9.5. ábrán bemutatott grafikon világosan mutatja, hogy inhibitor jelenlétében a kettős reciprok ábrázolásban a gátolatlan esethez képest nagyobb meredekségű egyeneseket kapunk, de az Y-tengely metszete nem változik. A grafikon jól mutatja a kettős reciprok ábrázolás előnyét abban, hogy látványosan jelzi, milyen gátlási mechanizmusba tartozik az inhibitor.

9.5. ábra: A kompetitív gátlás Lineweaver-Burk féle kettős reciprok ábrázolása

9.5. ábra: A kompetitív gátlás Lineweaver-Burk féle kettős reciprok ábrázolása

Mivel azonos kötőhelyért versenyeznek, nem meglepő, hogy a kompetitív inhibitorok szerkezetükben, polaritás mintázatukban rendszerint hasonlítanak a szubsztráthoz. Ezen tulajdonságuk miatt kiválóan alkalmasak az enzim szubsztrátkötő mechanizmusának vizsgálatára. Számos kompetitív inhibitor és a szubsztrát szerkezetének összehasonlításával gyakran kikövetkeztethető, hogy az enzim a szubsztrátnak mely csoportjain keresztül létesít az ES komplexben kapcsolatot. Ez az indirekt megközelítés azért releváns, mert míg a csak rövid ideig létező, átmeneti jellegű ES komplex térszerkezetét igen nehéz közvetlenül meghatározni, addig az enzim-inhibitor komplexek röntgendiffrakciós szerkezete könnyebb meghatározni.

(Érdekességként megemlítendő, hogy metanol mérgezés esetén azért adnak a páciensnek etanolt, mert az etanol egyfajta kompetitív inhibitorként, pontosabban versengő szubsztrátként működik. Az alkohol dehidrogenáz enzimnek mindkét alkohol a szubsztrátja. Az enzimreakció során a metanolból formaldehid keletkezik, ami a metanolnál lényegesen mérgezőbb. Az etanol jobb szubsztrátja az enzimnek, így etanol beadásával az érhető el, hogy időegység alatt kevesebb metanol alakuljon formaldehiddé. A szervezet így időt nyer arra, hogy a metanol egy részét még annak átalakulása előtt kiválaszthassa.)

9.4.2. Unkompetitív gátlás

Az ún. unkompetitív inhibitorok kizárólag az ES komplexhez kötődnek, a szabad enzimhez nem. Ezt a kölcsönhatási sémát a 9.6. ábra mutatja.

9.6. ábra: Az unkompetitív gátlás sémája

9.6. ábra: Az unkompetitív gátlás sémája

Ennél a gátlási típusnál a kinetikai egyenlet a 9.40. egyenlet szerint módosul.

9.40. egyenlet

A kölcsönhatási sémában jelzett KI’ jelentését a 9.41. egyenlet mutatja.

9.41. egyenlet

A 9.40 egyenletben szereplő α’ jelentése a 9.38 egyenletben szereplővel analóg, és a 9.42. egyenlet mutatja.

9.42. egyenlet

A 9.40 egyenlet kettős reciprok átalakítása a 9.43. egyenletet eredményezi.

9.43. egyenlet

A 9.43 egyenlethez tartozó grafikon a 9.7. ábrán szerepel.

9.7. ábra: Az unkompetitív gátlás Lineweaver-Burk féle kettős reciprok ábrázolása

9.7. ábra: Az unkompetitív gátlás Lineweaver-Burk féle kettős reciprok ábrázolása

A grafikon elemzéséből látható, hogy mind a KM, mind a Vmax értékek el vannak osztva α’ értékével (tehát a reciprokok meg van szorozva α’ értékével). Ez azt jelenti, hogy az inhibitor jelenlétében – szemben a kompetitív inhibitorokkal -, az eredetinél alacsonyabb maximális sebesség érhető el, és amilyen arányban csökken ez a Vmax érték, ugyanolyan arányban csökken a fél-maximális sebességhez tartozó szubsztrát koncentráció, azaz a KM értéke is. Mivel mindkét kinetikai paraméter azonos arányban csökken, a hányadosuk értéke, tehát az egyenesek meredeksége nem változik. Megemlítendő, hogy, bár ez a gátlás is reverzibilis, az unkompetitív gátlószer hatása nem függeszthető fel a szubsztrát-koncentráció növelésével!

9.4.3. Kevert típusú gátlás

A két fentebb említett gátlási típus kombinációjaként olyan gátlószerek is léteznek, amelyek mind a szabad enzimhez, mind pedig az ES komplexhez képesek kötődni. Ennek a kevert típusú gátlásnak az általánosabb alesete a vegyes típusú gátlás. Ennek sémáját a 9.8. ábra mutatja.

Ahogy azt a kölcsönhatási séma mutatja, a gátlószer nem azonos affinitással kötődik a szabad, illetve az ES komplexben lévő enzimhez.

9.8. ábra: A vegyes típusú gátlás sémája

9.8. ábra: A vegyes típusú gátlás sémája

Az ebből a sémából eredő kinetikai egyenletet a 9.44. egyenlet mutatja.

9.44. egyenlet

Ennek kettős reciprok átalakítása a 9.45. egyenletet eredményezi.

9.45. egyenlet

Az α és α’ jelentése megegyezik azzal, amit a kompetitív illetve az unkompetitív inhibitoroknál láttunk.

A kettős reciprok függvényhez tartozó grafikus ábrázolást a 9.9. ábra illusztrálja.

9.9. ábra: A vegyes típusú gátlás Lineweaver-Burk féle kettős reciprok ábrázolása

9.9. ábra: A vegyes típusú gátlás Lineweaver-Burk féle kettős reciprok ábrázolása

Kettősreciprok ábrázolásban tehát mindhárom gátlási típushoz jellegzetesen eltérő grafikon tartozik. Ezeknek a grafikonoknak a gátolatlan reakció grafikonjától való eltérése diagnosztikus értékkel bír, elárulja, hogy milyen típusú az inhibitor.

Megjegyzendő, hogy a vegyes gátlás mellett a kevert típusú gátlás másik – inkább csak elméletben létező – variánsa a non-kompetitív gátlás. Ez egy olyan eset, amikor az inhibitor azonos affinitással kötődik a szabad enzimhez és az ES komplexhez. Ekkor kétféle α érték helyett is csak egyetlen szerepel, így belátható, hogy a 9.9. ábrán szereplő grafikon úgy módosul, hogy a különböző inhibitor koncentrációkhoz tartozó egyenesek az X-tengelyt mind egy pontban metszik (hiszen a −1/KM szorzója α / α=1), míg az Y-tengely metszetek rendre az α / Vmax értékekre esnek.

Az egyes típusok esetében az α, illetve α’ értékek természetesen az egyenletek, illetve grafikonok alapján meghatározhatók, és ezeken keresztül a megfelelő gátlási állandók is kiszámíthatóak.