12. fejezet - Nukleinsavak

Tartalom

12.1. A nukleinsavak kémiai felépítése
12.2. A nukleinsavak örökítő szerepének bizonyítása
12.2.1. A Griffith-kísérlet
12.2.2. Az Avery-MacLeod-McCarty kísérlet
12.2.3. A Hershey-Chase kísérlet
12.2.4. A Chargaff szabályok
12.3. A DNS térszerkezetének Watson-Crick modellje
12.3.1. A Watson-Crick modell megalkotásának rövid története
12.3.2.  A Watson-Crick modell részletes ismertetése
12.3.3. A komplementaritás következménye
12.3.4.  A Watson-Crick modellt igazoló biofizikai mérések
12.3.5. A DNS magasabbrendű szerkezeti formái

(szerző: Pál Gábor)

A fehérjék mellett a nukleinsavak jelentik az élő szervezet másik alapvető makromolekula típusát. A nukleinsavak központi szerepet játszanak az öröklődő biológiai információ tárolásában és fehérjékbe történő kifejezésében. Hosszú, rögös, buktatókkal nehezített út vezetett odáig, hogy a kutatók végül felismerjék a nukleinsavaknak ezt a meghatározó szerepét. Ebben a fejezetben három fő kérdéskört tekintünk át. Megismerkedünk azzal, hogyan sikerült feltárni a nukleinsavak alapvető kémiai felépítését, felidézünk néhány meghatározó kísérletet, amelyek igazolták, hogy a DNS az örökítő anyag, és megismerkedünk a DNS térszerkezetével.

12.1. A nukleinsavak kémiai felépítése

A nukleinsavak felépítésével kapcsolatos első eredmények Friedrich Miescher német orvos-kémikus nevéhez fűződnek, aki 1868 körül igyekezett meghatározni a sejtmag kémiai összetételét. Vizsgálatához fehérvérsejteket akart használni, mivel ezek magja a sejt méretéhez képest nagy. Sejtizoláló módszerek híján a szervezetre bízta a fehérvérsejtek dúsítását: mintának gennyet használt, mivel abban nagyon sok az elpusztult fehérvérsejt. Kimutatta, hogy a mintában egy savas, foszfor-tartalmú anyag van. Ezt később nukleinsavnak nevezték el. Később lazac hímivarsejtekből ugyanilyen anyagot izolált.

A nukleinsavak kémiai összetételének megbízható azonosítása azonban csak az 1950-es évek elejére fejeződött be elsősorban Phoebus Levene és Alexander Todd munkája nyomán.

Levene azonosította a nukleinsavakban szereplő ribózt, illetve dezoxiribózt, valamint a bázisokat, és tisztázta ezek egymáshoz kapcsolódásának módját is. Ugyanakkor bevezetett egy olyan téves elképzelést, a tetranukleotid hipotézist, amely sokáig visszavetette a nukleinsavak valós szerepének kiderítését. A tetranukleotid hipotézis szerint a nukleinsavak négy monomerből álló egységekben léteznek. Minden ilyen tetranukleotidban négyféle monomer van jelen. A nukleinsavak valós, lineáris polimer szerkezetét végül Levene munkájára támaszkodva Todd tárta fel.

A fehérjék kémiai felépítésének felderítésénél az Emil Fischer által alkalmazott savas hidrolízis volt a kulcstechnika. A nukleinsavaknál is ugyanezzel próbálkoztak a kutatók, de a fehérjéknél tapasztaltakhoz képest a nukleinsavak esetében nehezebben értelmezhető eredményt kaptak. A fehérjéknél a savas hidrolízis oligopeptideket, és végső soron aminosavakat eredményezett, és viszonylag egyszerű volt bebizonyítani, hogy a fehérjék aminosavak polimerei. A nukleinsavak esetében azonban a hidrolízis körülményeitől függően hol ilyen, hol olyan egyszerűbb-összetettebb építőegységeket kaptak az alábbiak szerint.

„Durva” körülményeket (erősen savas pH, magas hőmérséklet, hosszú idő) alkalmazva teljes savas hidrolízist tudtak elérni, amelynek végeredménye foszforsav, egy öt-szénatomos cukor, és egy nitrogén tartalmú gyenge bázis volt 1:1:1 mólarányban (lásd 12.1. ábra, felső panel). Ezekből a vizsgálatokból kiderült, hogy kétféle nukleinsav van. Az egyikben a pentóz ribóz, ezért ezt ribonukleinsavnak (RNS) nevezték el, a másikban dezoxiribóz, ezért ezt dezoxiribonukleinsavnak (DNS) nevezték el.

Amennyiben a hidrolízist az előzőnél kevésbé durva, de azért „erélyes” körülmények között hajtották végre, 1:1 arányban foszforsavat, és egy összetett vegyület típust, nukleozidot kaptak, amelyben egy cukor és egy bázis volt kovalens kötéssel összekötve (lásd 12.1. ábra, középső panel).

12.1. ábra: A nukleinsavak összetétel-analízise különböző intenzitású savas hidrolízissel

12.1. ábra: A nukleinsavak összetétel-analízise különböző intenzitású savas hidrolízissel

Végül „enyhe” savas hidrolízis esetében különböző összetételű nukleozid-foszfátokat, vagyis nukleotidokat kaptak, amelyekben a 3-féle vegyülettípus, tehát a pentóz, a bázis és a foszforsav kovalensen kapcsolódott egymáshoz.

A modellt, ami a három eltérő intenzitású hidrolízis eredményeiből következett, a 12.2. ábra mutatja.

12.2. ábra: A hidrolízisek eredményéből levont legegyszerűbb modell a nukleinsavak kémiai szerkezetére

12.2. ábra: A hidrolízisek eredményéből levont legegyszerűbb modell a nukleinsavak kémiai szerkezetére

A legegyszerűbb modell szerint tehát a nukleinsavak lineáris polimerek, amelyekben egy monoton cukorfoszfát gerinc minden cukor részletéhez 1-1 bázis kapcsolódik.

A legegyszerűbb modellben foszfodiészter kötések tartják össze a szomszédos cukor részeket. A modell igazolásában döntő szerepe volt annak, hogy a savas hidrolízis helyett nukleinsav bontó enzimek, tehát nukleázok hidrolízisének eredményét is vizsgálták. Az enzimek specifikus módon képesek kémiai reakciókat katalizálni, így vélhető volt, hogy a savas hidrolízisnél szelektívebb hasításokat lehet velük elérni.

Valóban, így is történt. Amikor ugyanannak a DNS mintának egyik részét kígyóméregből származó foszfodiészteráz enzimmel kezelték, akkor a termékek olyan nukleotidok voltak, amelyeken a foszfátcsoportok rendre a cukor 5’-hidroxiljával voltak észter kötésben. Amikor azonban szarvasmarha lépből izolált foszfodiészterázt alkalmaztak, akkor olyan nukleotidok keletkeztek, amelyekben a cukor 3’ hidroxiljét észteresítette a foszforsav (lásd 12.3. ábra).

12.3. ábra: Enzimkatalizált hidrolízis igazolja a nukleinsavak lineáris, el nem ágazó szerkezetét

12.3. ábra: Enzimkatalizált hidrolízis igazolja a nukleinsavak lineáris, el nem ágazó szerkezetét

Nézzük meg részletesebben a nukleinsavak egyes alkotóvegyületeit. A nukleinsavak cukor része egy öt-szénatomos aldóz. Az aldehid csoport csak a nyíltláncú formán van jelen. A nukleinsavban a gyűrűs, furanóz forma van jelen. A csak a gyűrűs forma C1’ szénatomjához kapcsolódó glikozidos-OHβ-helyzetű, vagyis a gyűrű síkjához képest azonos irányban áll, mint a C4’ szénatomhoz kapcsolódó –CH2-OH csoport (lásd 12.4. ábra).

12.4. ábra: A nukleinsavak cukorrésze egy 5-szénatomos aldóz (a képen a ribóz szerepel)

12.4. ábra: A nukleinsavak cukorrésze egy 5-szénatomos aldóz (a képen a ribóz szerepel)

A bázis a csak a gyűrűs formában meglévő glikozidos hidroxilcsoport lecserélésével kapcsolódik a cukorhoz. Emiatt a cukor stabilan gyűrűs formában rögzül, hiszen a hidroxil hiányában nem tud reverzibilisen felnyílni (lásd 12.5. ábra).

A nukleinsavak monomer egysége, amelynek ismételt beépülésével jön létre a polimer, a nukleotid (lásd 12.5. ábra). A nukleinsavakban lévő cukorrész szénatomjainak számozása a cukrok általános számozását követi, de a pozíció egy vesszőjelet is kap, ami megkülönbözteti a cukorban lévő szénatomokat a bázisban lévőktől (mely utóbbiaknál nem alkalmazzák a vesszős jelölést).

12.5. ábra: A polimer nukleinsavak alapegysége a nukleotid

12.5. ábra: A polimer nukleinsavak alapegysége a nukleotid

Az RNS-ben szereplő cukorrész, a ribóz mind a 3’, mind a 2’ szénatomján hidroxilcsoportot hordoz. A DNS-ben szereplő 2’-dezoxiribóz azonban a nevéhez híven a 2’ szénatomján nem hordoz hidroxilt, azt egy hidrogénatom helyettesíti (lásd 12.6. ábra).

12.6. ábra: Az RNS-alkotó ribóz és a DNS-alkotó dezoxiribóz

12.6. ábra: Az RNS-alkotó ribóz és a DNS-alkotó dezoxiribóz

A kötést, amivel a nukleinsavakban a bázis a cukorhoz kapcsolódik, N-glikozidos kötésnek nevezzük. A bázis örökli az eredeti glikozidos hidroxil β-helyzetét, ezért ez egy β-N-glikozidos kötés (lásd 12.7. ábra).

12.7. ábra: A cukor és a bázis között β-N-glikozidos kötés van

12.7. ábra: A cukor és a bázis között β-N-glikozidos kötés van

A nukleinsavak kémiai felépítésének felderítésében a lúgos hidrolízist is megpróbálták. Meglepetésre kiderült, hogy az RNS bázis-katalizált hidrolízissel gyorsan lebomlott, míg a DNS ellenállónak bizonyult (lásd 12.8. ábra).

12.8. ábra: Az RNS lúgos hidrolízise

12.8. ábra: Az RNS lúgos hidrolízise

Az RNS kémiai felépítésének felderítését hátráltatta, hogy lúgos hidrolízis után a keletkezett nukleotid termékekben a foszfátcsoport vegyesen a 3’ és a 2’ hidroxilt észteresítette, tehát nem volt világos, hogy a kiindulási anyagban milyen volt a foszfodiészter kötések elrendeződése.

Ma már ismert tény, hogy az RNS – a DNS-sel szemben – azért érzékeny báziskatalizált hidrolízisre, mert rendelkezik 2’-OH csoporttal. Lúgos közegben az oldatban lévő hidroxidionok protont vonnak el a 2’-OH csoporttól, amely így erős nukleofil csoporttá válik, és molekulán belüli támadást intéz a mellette lévő, a 3’-hidroxilt észteresítő foszfát foszforatomján (lásd 12.8. ábra). A reakció köztes terméke egy olyan vegyület, amelynek ribóz csoportját egyetlen foszforsav észteresíti egyszerre a 2’-, és a 3’-hidroxilcsoporton. Ez a 2’,3’-ciklikus monofoszfát származék bomlik fel vegyesen 2’-monofoszfát, illetve 3’-monofoszfát formára.

Az RNS esetében is enzimes hasítások termékeinek vizsgálata igazolta, hogy a foszforsav a ribóz 3’- és 5’-hidroxiljait észteresíti, és az egyes nukleotid egységeket szabályos sorrendben, 3’-5’ foszfodiészter kötések kapcsolják össze. A 12.9. ábra mutatja a DNS és az RNS láncot, kihangsúlyozva a 2’-szénatom eltérő szubsztitúcióját. Látható, hogy mindkét vegyület lineáris polimer, amelyben a cukorfoszfát gerinc azonos kapcsolódási rendszerben alakul ki. Mindkét molekula egyedi tulajdonságát a bázisok sorrendje jelenti.

Mindkét el nem ágazó polimernek irányultsága van. Az egyik végen a ribóz 5’-, a másikon a 3’-hidroxilcsoportja található. A láncnak tehát van egy 5’-vége, és egy 3’-vége.

12.9. ábra: A nukleinsavak információt hordozó molekulák, az információt a bázisok sorrendje jelenti

12.9. ábra: A nukleinsavak információt hordozó molekulák, az információt a bázisok sorrendje jelenti

Ezek után térjünk rá a bázisok ismertetésére. A DNS-ben és az RNS-ben előforduló bázisok kémiai felépítése kétféle heterociklusos szerves bázis szerkezetéből vezethető le, az egyik a pirimidin, a másik a purin (lásd 12.10. ábra). A pirimidin és a purin a nukleinsavak bázisainál erősebb bázisok. Míg ezek a bázisok semleges kémhatáson képesek protont felvenni, a nukleinsavak bázisai fiziológiás pH-n nem vesznek fel protont. A purin váz egyes atomjainak pirimidinétől eltérő számozási logikáját Emil Fischer vezette be. Ez a számozás öröklődik a nukleinsavak bázisainál is.

12.10. ábra: A nukleinsavakban található bázisok pirimidin illetve purin származékok

12.10. ábra: A nukleinsavakban található bázisok pirimidin illetve purin származékok

A heterociklusos vegyületek esetében a molekula eltérő tautomer állapotokban fordulhat elő. Az egyes tautomer formák termodinamikai egyensúlyban állnak egymással, rendszerint csak az egyik forma dominál. Ezt a 12.11. ábra az RNS-alkotó uracil bázis példáján mutatja be. 

12.11. ábra: Az uracil tautomer állapotai

12.11. ábra: Az uracil tautomer állapotai

Amikor a nukleinsavak kémiai felépítését feltárták, még nem volt megbízható ismeret arra vonatkozóan, hogy mely tautomer formák a stabilabbak, tehát ennek megfelelően melyek fordulnak elő a legnagyobb arányban. Mint később látni fogjuk, a DNS kettősspirál szerkezeti modelljének megalkotása csak a helyes tautomer állapotok alkalmazásával volt lehetséges.

A 12.12. ábra mutatja be az RNS-ben illetve a DNS-ben előforduló bázisokat azok stabil tautomer formájában. Az ábra jelzi, hogy ebben a formában a bázis egyes funkciós csoportjai milyen szerepet játszanak hidrogénhíd kötés kialakítása során. Az ábrán szereplőtől eltérő tautomer állapotok eltérő hidrogénhíd mintázatokat jelentenének.

12.12. ábra: A nukleinsav bázisok egyes csoportjai H-hidas kölcsönhatásban küldő, vagy fogadó szerepet játszhatnak

12.12. ábra: A nukleinsav bázisok egyes csoportjai H-hidas kölcsönhatásban küldő, vagy fogadó szerepet játszhatnak

A 12.1. táblázat összefoglalva ismerteti a bázisok, nukleozidok és nukleotidok nevezéktanát mind az RNS, mind a DNS tekintetében.

12.1. táblázat: Bázisok, nukleotidok, nukleozidok nevezéktana

12.1. táblázat: Bázisok, nukleotidok, nukleozidok nevezéktana

Az elnevezések önkényesek, ugyanis a bázisok neve izolálásukkal kapcsolatos. A guanint például először madárürülékből (guanó), a timint pedig a csecsemőmirigyből (timusz) izolálták.

 A nevezéktan elsajátításában ügyelni kell arra, hogy a citozin bázis nevének alakja hasonlít a guanozin és adenozin nukleozidok nevének alakjára.

A két purin bázis és a citozin egyaránt RNS- és DNS-alkotó, míg az uracil csak RNS-ben, a timin pedig csakDNS-ben fordul elő. (Pontosabban bizonyos RNS-ek esetében az RNS-láncban lehet jelen timin, de az csak az RNS szintézisét követően, tehát utólagos kémiai módosítás eredményeként jelenhet meg.)

Emiatt a nukleozidoknál a timidinnél sokszor lehagyják a dezoxi előtagot. A timidin abban a ritkább esetben kap új nevet, amikor RNS alkotóként szerepel, mint különlegesen módosult nukleozid, illetve nukleotid. Ilyenkor a ribotimidin nevet kapja.

A nukleotidok, lévén savas molekulák, régies néven savként is nevezhetők. Pl. az adenozin 5’-monofoszfát az adenilsav. Az 5’-monofoszfát nukleotidok elnevezéseit DNS illetve RNS tekintetében a 12.13. ábra illetve a 12.14. ábra foglalják össze. A szerkezetek a semleges kémhatású közegben előforduló szabad nukleotidokat mutatják be, melyeken a foszfát két negatív töltést hordoz. A bázisok a legstabilabb tautomer szerkezetben szerepelnek. A rózsaszínnel kiemelt részletek a megfelelő nukleozidokat mutatják. Az ábrákon szereplő, számozást nem mutató rövidítések mindig feltételezik, hogy a foszfát az 5’ szénen van.

12.13. ábra: DNS-alkotó nukleotidok és nukleozidok

12.13. ábra: DNS-alkotó nukleotidok és nukleozidok

12.14. ábra: RNS-alkotó nukleotidok és nukleozidok

12.14. ábra: RNS-alkotó nukleotidok és nukleozidok

A nukleotidoknál meg kell nevezni a foszfátok számát és kapcsolódási helyét. Ha például a foszfát az adenozinon az 5’ pozícióban van, akkor az elnevezés adenozin 5’-monofoszfát, 5’-AMP.

Mivel a szabadon előforduló nukleotidoknál a foszfát leggyakrabban az 5’ helyen található, ilyenkor ezt sokszor elhagyják (5’AMP helyett csak AMP-t írnak) és csak akkor jelzik a foszfátcsoport helyét, ha az nem az 5’-hidroxilt észteresíti (lásd 12.15. ábra).

12.15. ábra: A nukleotidok számos pozícióján lehet foszfátcsoport

12.15. ábra: A nukleotidok számos pozícióján lehet foszfátcsoport

Mind a DNS, mind pedig az RNS láncának irányultsága van, mely annak köszönhető, hogy a ribóz, illetve a dezoxiribóz egy aszimmetrikus molekula. A lánc irányát a ribóz szubsztituált hidroxiljai szerint jellemezzük. A lánc felírásánál az irányt jelölni kell! Ha nincs jelölve, akkor megegyezés szerint a felírás 5’→3irányt jelent. A cukorfoszfát gerinc mindkét nukleinsav esetében monoton jellegű. A változatosságot, az információt a különböző bázisok egymás utáni sorrendje jelenti (lásd 12.16. ábra). Vegyük észre, hogy a fehérjéknél a főláncon az egymást követő aminosav oldalláncok jelentik a specifikus információt.

12.16. ábra: A nukleinsavaknak 5’-3’ irányultságuk van

12.16. ábra: A nukleinsavaknak 5’-3’ irányultságuk van

A bázissorend jelölése történhet a cukorfoszfát gerinc részleteinek bemutatása nélkül is, például a 12.17. ábrán bemutatott módon.

12.17. ábra: A nukleinsav lánc sematikus ábrázolása

12.17. ábra: A nukleinsav lánc sematikus ábrázolása

A cukorfoszfát gerinc lineáris és monoton szerkezete miatt ugyanakkor egy nukleinsav jellemezhető pusztán a bázisok egymás utáni sorrendjével, tehát az úgynevezett szekvenciával is. Az alábbi egyszerűsítéseket vezették be lépésekben ahhoz, hogy szövegesen is egyszerű legyen a szekvenciát rögzíteni. Az egyszerűsítés három lépésben történhet.

5’-pApCpGpTpA-3’

Ebben az esetben még jelezzük a foszfát-észtereket. A következő egyszerűsítési lépésben elhagyhatjuk a nyilvánvalóan jelenlévő köztes foszfodiészter kötések jelölését:

5’-pACGTA-3’

További egyszerűsítésként, ha egyetlen lánc van, akkor azt megegyezés szerint 5’-végtől 3’-vég felé haladva írjuk fel, így a terminálisokat sem kell feltüntetni, és elérjük a lehető legegyszerűbb formát:

pACGTA

A terminális foszfátcsoportot (ha van) természetesen ilyenkor is jelezni kell.