12.2. A nukleinsavak örökítő szerepének bizonyítása

A kutatók számára a huszadik század első felében már ismertté vált, hogy az élő szervezetben a legkülönbözőbb funkciókat fehérjék töltik be. Már a monomer egységek diverzitása tekintetében is világos volt, hogy a fehérjék kémiailag sokkal változatosabbak, mint a nukleinsavak. Az elsőként megismert enzimeknek ráadásul mindegyike fehérje volt. Mindezek alapján nem tűnt kétségesnek, hogy az a vélhetőleg rendkívül komplex rendszer, amely képes a szervezetre vonatkozó biológiai információ tárolására, és generációról generációra történő átadására, fehérjéken alapul. Ráadásul a negyvenes évek közepéig elfogadott volt Levene hibás tetranukleotid hipotézise, amely kizárta, hogy a DNS információhordozó legyen. Az alábbiakban három olyan kísérletet tekintünk át, amelyek az örökletes információ átadásának mikéntjét kutatták.

12.2.1. A Griffith-kísérlet

Frederick Griffith angol bakteriológus a bakteriális tüdőgyulladás egyik kórokozójával, a Streptococcus pneumoniae-val kísérletezett. Az említett baktériumot ki lehetett tenyészteni tüdőgyulladásos betegek szervezetéből. Több eltérő törzset is kitenyésztettek, amelyeket úgynevezett szerológiai tesztekkel, illetve az agar lemezen szaporodó baktériumok által létrehozott telepek eltérő morfológiája alapján lehetett azonosítani. A törzsek között volt betegséget okozó (virulens) úgynevezett S-törzs, ami sima felszínű (smooth) telepeket képezett, és betegséget nem okozó (nem-virulens) R-törzs, ami durva felszínű (rough) telepeket képzett. Ismeretes volt, hogy az S-törzs egy poliszacharid-alapú tokot hoz létre, míg az R-törzs nem rendelkezik ilyen tokkal. A két törzs természetesen generációról generációra örökítette ezt a tulajdonságát. Az akkori ismeretek szerint ezek a tulajdonságok megváltoztathatatlan sajátjai voltak ezeknek a törzseknek. Griffith azt vizsgálta, hogy ez valóban így van-e, vagy esetleg a két törzs egymásba alakulhat.

Amikor Griffith az S-törzzsel fertőzött egereket, az egerek elpusztultak (lásd 12.18. ábra). Ma már tudjuk, hogy a tok jelenléte akadályozta az egér immunrendszerének hatékony védekező reakcióját. Amikor R-törzzsel fertőzte az egereket, az egerek nem betegedtek meg (mivel az immunrendszerük sikerrel elpusztította a tok nélküli sejteket).

Amikor hővel elölt S-törzset juttatott az egerekbe, az egerek túléltek, tehát nem valamilyen hőstabil toxin okozta a megbetegedést. Amikor azonban hővel elölt S-törzs és kezeletlen R-törzs keverékét juttatta be az egerekbe, az egerek egy része elpusztult. Az elpusztult egerekből Griffith ki tudta tenyészteni mind az R-törzset, mind pedig az S-törzset.

Griffith azt a következtetést vonta le a kísérletekből, hogy az elölt S-törzsből valamilyen örökletes információt hordozó anyag átjut az élő R-törzs sejtjeibe, és a sejtek egy részét stabilan S-törzzsé alakítja, mintegy áttranszformálja. A jelenséget transzformációnak nevezte el. Mivel akkoriban már ismert volt a fehérjék hődenaturációja, Griffith feltételezte, hogy a transzformáló anyag nem fehérje, de az anyag kémiai mibenlétéről ennél többet nem állapított meg.

12.18. ábra: A Griffith-kísérlet

12.18. ábra: A Griffith-kísérlet

12.2.2. Az Avery-MacLeod-McCarty kísérlet

Oswald T. Avery, Colin MacLeod és Maclyn McCarty1944-ben a Griffith kísérlet alapján igyekeztek kideríteni, hogy milyen anyag kerül át a hővel elölt virulens baktériumból a nem-virulens baktériumba, tehát mi okozza a Griffith által transzformációnak nevezett jelenséget. A vizsgálat idején még nem álltak rendelkezésre mindazok a technikák, amelyekkel rendkívül nagy tisztaságban, homogén formában elő lehetett volna állítani nukleinsav-mentes fehérjepreparátumot, illetve fehérje-mentes nukleinsav-preparátumot. Avery és munkatársai a kor lehetőségei szerint elválasztották a hővel elölt virulens baktérium anyagait, és sikerült viszonylag nagytisztaságú, elsősorban DNS-t tartalmazó frakciót készíteniük. Ez a DNS-frakció kiváló transzformáló hatásúnak bizonyult, de ki kellett zárniuk, hogy nem a frakcióban szennyezésként jelenlévő fehérje illetve RNS komponensek okozzák a valódi hatást.

Mivel további tisztítást nem tudtak végezni, a homogén formában történő izolálás helyett egy rendkívül ötletes, ellentétes megközelítést alkalmaztak. Akkoriban már különböző élőlényekből elő lehetett állítani – ha nem is homogén, de kellően nagy tisztaságú formában – fehérjebontó enzimeket (proteázokat), RNS-bontó enzimeket (RN-ázokat) és DNS-bontó enzimeket (DN-ázokat).

Amikor a transzformálásra képes frakciót proteázokkal, vagy RN-ázzal kezelték, a frakció transzformáló képessége nem változott (lásd 12.19. ábra).

A transzformációt tehát nem fehérje, vagy RNS okozta. A DN-áz hatására azonban a frakció inaktív lett. Ezzel Avery, MacLeod és McCarty elsőként igazolták, hogy egy örökletes tulajdonság hátterében a DNS áll. Bár az elkövetkező években a közleményt sokan idézték, az eredmények nem győzték meg a kutatók többségét arról, hogy a DNS lenne az univerzális örökítő anyag. Ennek széleskörű elfogadásához az kellett, hogy egy teljesen független, eltérő folyamattal kapcsolatban is a DNS bizonyuljon örökítő anyagnak. 

12.19. ábra: Avery, MacLeod és McCarty igazolják, hogy a Griffith kísérletben szereplő örökítőanyag DNS

12.19. ábra: Avery, MacLeod és McCarty igazolják, hogy a Griffith kísérletben szereplő örökítőanyag DNS

12.2.3. A Hershey-Chase kísérlet

Az örökítéssel kapcsolatos kutatások egy virágzó ágává vált az 1940-es évektől kezdve a baktériumokat fertőző vírusok, vagyis a bakteriofágok működése. Az egyik kedvelt kísérleti objektum a T2 bakteriofág volt. A T2 bakteriofág, mint minden vírus, a gazdasejtet megfertőzve úgy programozza azt át, hogy a sejt új, az eredetivel azonos vírusokat termeljen. A Griffith kísérletben megjelenő transzformáló anyaghoz hasonlóan tehát itt is valamilyen örökítő anyag jut be a sejtbe, csak most éppenséggel egy vírusból. Ez az örökítő anyag hordozza a vírusok keletkezésére vonatkozó információt. Az új fágok termeléséhez szükséges információt tehát a fág hordozza, és juttatja be a sejtbe. Ismert volt, hogy a fágok fehérjéből és DNS-ből állnak. Akkoriban az volt az általános nézet, hogy a fág fehérje komponensei rendelkeznek örökítő funkcióval.

Ahhoz, hogy eldöntsék, valójában a fág fehérje, vagy DNS komponense örökít-e, azt kellett volna kideríteni, hogy a fágfertőzés során milyen anyagot juttat a fág a baktériumsejtbe: fehérjét, vagy DNS-t.

Alfred Hershey és laboránsa Martha Chase 1952-ben ennek járt utána egy rendkívül szellemes, egyesek szerint a molekuláris biológia megszületését jelentő kísérletben (lásd 12.20. ábra).

A következő gondolatmenet mentén haladtak. A DNS tartalmaz foszfort, de nem tartalmaz ként, a fehérjék pedig tartalmaznak ként, de (általában) nem tartalmaznak foszfort. Mind a foszfor, mind a kén esetében rendelkezésre állt radioaktív izotóp forma. A kísérletben két külön baktériumtenyészetet hoztak létre. Az egyik tenyészetet radioaktív foszfort tartalmazó, a másikat radioaktív ként tartalmazó tápoldatban szaporították.

A két különbözőképpen jelölt tenyészetet fágokkal fertőzték. A radioaktív foszfort tartalmazó baktériumok olyan fágokat termeltek, amelyek DNS-e radioaktívan jelölt lett, míg a fehérjéik jelöletlenek maradtak. A radioaktív ként tartalmazó táptalajon növesztett baktériumok olyan fágokat termeltek, amelyek fehérjéi voltak radioaktívan jelöltek, míg a DNS-ük nem.

A fágokat a sejtektől centrifugálással választották el, a két tenyészetből a kétféle fágot külön-külön izolálták. Ezután következett a kísérlet érdemi része. A kétféle fág izolátummal külön-külön kísérletben radioaktívan nem jelölt baktériumokat fertőztek. A fertőzés nagyon gyors folyamat, a sejteken másodpercek alatt megtapadnak a fágok, és bejuttatják a sejtbe az örökítő anyagot.

12.20. ábra: A Hershey-Chase kísérlet: a T2 fág DNS-t juttat a kóli sejtbe, ezáltal azt T2 fágok gyártására kényszeríti

12.20. ábra: A Hershey-Chase kísérlet: a T2 fág DNS-t juttat a kóli sejtbe, ezáltal azt T2 fágok gyártására kényszeríti

A kísérlet kritikus eleme az volt, hogy a rövididejű fertőzést követően valahogyan leszedjék a baktériumok felszínéről a fágokat, hiszen azt kellett megállapítaniuk, hogy a fágtól megszabadított baktérium sejtek melyik esetben mutatnak radioaktivitást: amikor radioaktív kénnel jelölt fággal lettek fertőzve, vagy amikor radioaktív foszforral jelölt fággal.

A sejtekről a fágokat rendkívül gyors keveréssel (amelyhez egy botmixer-szerű készüléket használtak) távolították el. A nyíróerők lesodorták a fágokat a baktériumokról, majd a baktériumokat és a fágokat centrifugálással választották el egymástól.

Kiderült, hogy a baktériumsejtbe csak a foszfor-jelölt fágból jutott be radioaktív anyag. Ezek alapján a Hershey-Chase kísérlet is arra az eredményre jutott, hogy a genetikai információt a DNS hordozza. A fágok genetikájával kapcsolatos eredményeikért Alfred Hershey Max Delbrück-kel és Salvador Luria-val megosztva 1969-ben orvosi Nobel-díjat kapott

Az 1952-es kísérlet után már széles körben elfogadottá vált az a megállapítás, hogy a DNS az örökítő anyag. Ennek megfelelően hatalmas versenyfutás indult el a DNS szerkezetének megfejtéséért.

A szerkezet megfejtése nem váratott magára sokáig, James Watson és Francis Crick egy évvel később megalkották a DNS térszerkezetének kettősspirál modelljét. A modell mindenben megerősítette a DNS örökítő szerepével kapcsolatos korábbi állításokat, ugyanis azonnal fényt derített arra, miként képes a DNS az örökletes információt tárolni, és azt generációról generációra változatlan formában továbbadni.

12.2.4. A Chargaff szabályok

Edwin Chargaff csoportja a 40-es évek végére kidolgozta a DNS-alkotó nukleotidok izolálásának, elválasztásának és mennyiségi meghatározásának módszereit, és az alábbi megfigyeléseket tette.

A DNS bázisok aránya fajra jellemző érték.

Rendszertanilag közeli fajok esetén az arányok hasonlóbbak, mint távoli fajoknál.

Egy adott faj egyedeinél minden sejt azonos arányban tartalmazza a DNS bázisokat.

 

A bázisok aránya nem függ az egyed életkorától, fiziológiás állapotától, vagy a környezettől.

Ezekkel a megfigyelésekkel kapcsolatban figyelemreméltó, hogy azok tökéletesen megfelelnek egy örökítő anyaggal szembeni elvárásoknak.

Ezen felül egy további, rendkívül érdekes, misztikusnak tűnő tényt is feltártak: bármilyen sejtből izolált DNS mintára igaz, hogy az adenin mennyisége megegyezik a timinével, és a guanin mennyisége a citozinéval, tehát: A=T és G=C (ebből következően A+G=T+C, illetve A+C=G+T).

Ezeket a megállapításokat összefoglalva Chargaff szabályoknak nevezték el.