12.3. A DNS térszerkezetének Watson-Crick modellje

12.3.1. A Watson-Crick modell megalkotásának rövid története

Az ötvenes évek elejére ismertté vált a DNS lánc kémiai összetétele, az egyes alkotók kapcsolódási módja, és az, hogy a DNS egy lineáris, el nem ágazó polimer. Mindez ugyanakkor nem adott magyarázatot sem a DNS akkoriban már elfogadott örökítő szerepének mibenlétére, sem olyan furcsa összefüggésekre, mint a Chargaff szabályok.

A világban számos kutatóhely egymással versengve próbálta megfejteni a DNS térszerkezetét. Ismert volt, hogy Amerikában Linus Pauling dolgozik a problémán, és mint híres, Nobel díjas vegyész, a molekulaszerkezetek szakértője, nagy esélyesnek számított.

Angliában két kutatócsoport is versenybe szállt. Az egyik a Cambridge-i Egyetem Cavendish Laboratóriumában működött, amelyet Sir Lawrence Bragg vezetett, aki 1915-ben Nobel díjat kapott a röntgenkrisztallográfiát megalapozó kutatási eredményeiért. Ebben az intézetben dolgozott John Kendrew és Max Perutz is, akik a mioglobin és a hemoglobin térszerkezetének megoldásán dolgoztak. Ugyanitt dolgozott James Watson és Francis Crick a DNS szerkezeti modelljének megalkotásán. Linus Pauling annak idején megelőzte a cambridge-i intézetet a polipeptidlánc α-hélix szerkezetének megfejtésében, így Lawrence Bragg különösen motivált volt abban, hogy ezt a versenyt most ők nyerjék meg.

A másik angliai kutatóhely a londoni King’s College egyetemen működött, ahol John Randall kutatócsoportot szervezett a DNS térszerkezetének megfejtésére. Ebben a csoportban Maurice Wilkins egyfajta helyettes vezetőnek számított, ő indította el az első kísérleteket, melyekben DNS-rostok röntgenszórását vizsgálta. Randall felvette a kutatócsoportba Rosalind Franklint is, aki ugyanezen a problémán kezdett el dolgozni Wilkinstől függetlenül.

A szerkezeti modellt végül Watson és Crick alkották meg, de ebben nagy segítséget jelentettek számukra azok a szerkezeti ismeretek, amelyeket a King’s College kutatói tártak fel, és amelyek számos csatornán keresztül jutottak el hozzájuk. Rosalind Franklin készítette el azt a világhírűvé vált röntgendiffrakciós képet, amely talán a legnagyobb hozzájárulást jelentette Watson és Crick számára. Ezt a képet Wilkins mutatta meg a laboratóriumába látogató Watsonnak, mégpedig Franklin előzetes hozzájárulása nélkül.

Crick fizikus végzettségű volt, és Cambridge-ben eleinte ő is fehérjeszerkezetek röntgendiffrakciós vizsgálatán dolgozott Max Perutz témavezetésével. A fehérjékben lévő helikális struktúrák okán Crick többekkel együtt a helikális szerkezetek röntgenszórásának matematikai leírásán dolgozott. Számára a londoni kutatóhelyről származó információk alapján gyorsan egyértelművé vált, hogy a DNS helikális szerkezetű kell, hogy legyen. A szerkezeti adatokból az is kiderült, hogy a DNS molekulában valamilyen komponensek szabályos, periodikusan ismétlődő rend szerint 3,4 Å távolságra vannak egymástól.

A helyes modell létrehozásához azonban számos egyéb információra is szükség volt.

Watson és Crick első, 1951-ben megalkotott helikális DNS modellje alapvetően hibás volt. Első modelljükben, amit nem publikáltak, a cukorfoszfát gerincet helyezték belülre, a bázisok a víz felé fordultak. Ezt a modellt többek között Rosalind Franklin jogos kritikái nyomán hamar el is vetették. Érdekes módon tőlük függetlenül Pauling is egy hasonlóan hibás modellt épített, amelyben ráadásul három lánc alkotott egyetlen közös hélixet. Ezt a modellt Pauling 1953-ban publikálta is, mielőtt Watson és Crick a saját, immár helyes modelljüket közölték volna.

A korrekt modell megalkotásában Watson és Crick számára sokat segített Erwin Chargaff angliai látogatása 1952-ben, amelynek során világossá vált Watson és Crick számára, hogy az A=T és C=G szabályt mindenképpen tükröznie kell a helyes modellnek. Chargaff arra is felhívta Watson figyelmét, hogy vizes oldatban mi az egyes bázisok valós tautomer szerkezete.

Mindezek alapján Watson volt az, aki felfigyelt arra, hogy egy megfelelő orientációban egymás felé fordított A-T pár illetve C-G pár geometriai adatai szinte azonosak, és a bázisok között lehetőség nyílik hidrogénhíd kötésekre. Ezek után már egyértelmű volt a megoldás: a DNS helikális szerkezete két láncból áll. A modellépítés során arra is rájöttek, hogy a bázisok közötti kapcsolat akkor lesz megfelelő geometriájú, ha a két lánc egymással ellentétes irányban fut, tehát a két lánc egymáshoz képest antiparallel.

James Watson és Francis Crick 1953-ban megalkotta a világ azóta talán legismertebb molekulaszerkezeti modelljét, a kettős spirált. Sokan ezt az eredményt tekintik a molekuláris biológia születési pillanatának. Az óriási koncepcionális áttörés annak felismerése volt, hogy a DNS molekulát két, egymást kiegészítő lánc együttese alkotja. Modelljük azonnal rávilágított a DNS örökítő szerepének mibenlétére is. Eredményüket a Nature folyóiratban közölték, és egy intézmények közötti megállapodás keretében ugyanabban a számban folytatólagosan Wilkins csoportja és Franklin csoportja is leírta a DNS-szerkezettel kapcsolatos saját eredményeit. Watson és Crick cikkükben megemlítették, hogy a modell megalkotásában stimulálták őket Wilkins és Franklin nem publikált eredményei. Arra is felhívták a figyelmet, hogy a modelljük képes magyarázatot adni arra, hogy miként másolódhat a DNS-ben tárolt genetikai információ. Watson, Crick és Wilkins 1962-ben a DNS szerkezetével kapcsolatos felfedezéseikért orvosi Nobel díjat kaptak. Bizonyára Rosalind Franklin is joggal szerepelhetett volna a díjazottak között, de ő tragikusan korán, 1958-ban rákbetegségben elhunyt.

12.3.2.  A Watson-Crick modell részletes ismertetése

Első lépésben vizsgáljuk meg a modell síkban kiterített formáját (lásd 12.21. ábra).

12.21. ábra: A DNS kétláncú szerkezete síkban ábrázolva és a bázispárok szerkezete

12.21. ábra: A DNS kétláncú szerkezete síkban ábrázolva és a bázispárok szerkezete

A modellben két DNS lánc szerepel, amelyek egymással ellentétes irányban futnak, tehát antiparallel elrendeződésűek. A rendkívül poláros, és negatívan töltött cukorfoszfát gerinc a molekula külső, oldat felé néző részén fut, a részben apoláros jellegű bázisok a molekula belseje, és ezáltal egymás felé fordulnak.

A 12.21. ábra jól illusztrálja a megfelelően párba állított DNS láncok közötti összeköttetés lényegét. A valóságnak megfelelő tautomer formákban ábrázolt bázisok közül az adenin és a timin egymással két, míg a guanin és a citozin egymással három hidrogénhíd kötést tud létesíteni. A bázis és a cukor kapcsolódási pontját a dezoxiribóz C1’ szénatomja jelenti. A bázispárok tekintetében a két érintett C1’ atom egymástól mért távolsága megadja a két lánc távolságát. Az A-T párban ez a távolság a 11,1 Å, míg a G-C pár esetében 10,8 Å, vagyis a két távolsági érték praktikusan megegyezik egymással.

A szerkezetből két rendkívül fontos következtetést vontak le. Az egyik, hogy a láncban bármilyen sorrendben követhetik egymást az egyes nukleotid egységek, tehát bármilyen bázissorrend létrejöhet. A másik, hogy a két lánc szekvenciája kölcsönösen determinálja egymást (komplementerek), tehát ha az egyik lánc bázissorrendje ismert, abból egyértelműen következik a másik lánc bázissorrendje (és fordítva).

Nézzük meg térben is Watson és Crick eredeti modelljét (lásd 12.22. ábra).

12.22. ábra: Watson és Crick modellje, a DNS kettősspirál szerkezete

12.22. ábra: Watson és Crick modellje, a DNS kettősspirál szerkezete

A Watson-Crick modellben a DNS nagyvonalakban az ún. B-DNS konformációban van. A mai ismeretek szerint ez a konformáció kis különbségekkel azonos a sejtekben lévő DNS leggyakoribb térszerkezeti típusával. A DNS két szála egy közös képzeletbeli tengely mentén tekeredik spirális alakban.  A spirál, vagyis a hélix jobbmenetes, felülről nézve az óramutató járásával egyező irányba forogva távolodik. Ez a megállapítás mindkét szálra igaz, és az is mindegy, hogy egy-egy szálat melyik vége felől nézzük.

A cukorfoszfát gerinc kívül fut, a bázisok befelé állnak, síkjuk majdnem merőleges a hélix tengelyére. Az egymást követő bázisok távolsága 3,4 Å, ez adja a röntgenszóródási kép fő periodikusságát. A hélix egy teljes fordulatára 10 nukleotid rész esik (a később meghatározott kristályszerkezeti modell alapján ez az érték 10,4 nukleotid), ami egy másik, 34 Å-ös periódust eredményez. Ez azt is jelenti, hogy a lánc a tengelye mentén nukleotidonként 36 fokot fordul.

Az azonos láncban egymást követő bázisok aromás gyűrűi egymásra lapolódnak, átfednek, közöttük vonzó, apoláros-apoláros van der Waals kölcsönhatás van. A térkitöltés tökéletes, nincsenek üregek. A molekula átmérője 20 Å (lásd 12.23. ábra). A két lánc egymással szemközti bázisai hidrogénhidas kölcsönhatásban vannak.

12.23. ábra: A jobbmenetes DNS kettősspirál felülnézeti képe.

12.23. ábra: A jobbmenetes DNS kettősspirál felülnézeti képe.

A cukor síkja nagyjából párhuzamos a tengellyel, a gyűrűben lévő oxigének tengelytől való távolsága minden cukornál azonos. A glikozidos kötésben lévő C1’ szénatomok tengelytől való távolsága is azonos.

Szabályos, periodikus menetemelkedés esetén az egymással hidrogénhidas kölcsönhatással párt alkotó bázisokat a cukorhoz kapcsoló C1’ glikozidos szénatomok egymástól való távolsága is azonos kell, hogy legyen. Ez az állandó távolság tehát a szabályos stabil kettős-spirál létrejöttének feltétele. A térkitöltés kényszere miatt ez az azonos távolság csak akkor jöhet létre, ha a bázisok egyike purin, a másik pirimidin vázas.

A stabil tautomer szerkezetek ismeretében az is belátható, hogy az adott geometriai kényszerek mellett stabilizáló hidrogénhíd kötéseket kizárólag A-T (T-A) és G-C (C-G) bázispárok alkothatnak. Minden ettől eltérő bázispárosodás torzítaná, és destabilizálná a szerkezetet.

Oldalnézetben jól látható, hogy a kettősspirál külsején két árok húzódik végig csigavonalban (lásd 12.22. ábra). Az egyik keskeny, ezt kisároknak hívjuk, a másik szélesebb, ennek nagyárok a neve. Vajon miért jön létre két eltérő méretű árok?

Először a DNS-től elvonatkoztatva, általánosságban vizsgáljuk meg, hogy egy kettőshélix szerkezet esetén mi befolyásolja a két árok relatív méretét. Készítsünk a kettőshélix tengelyére merőlegesen egy metszetet. Ebben vizsgáljuk meg, hogyan helyezkednek el egymáshoz képest az egyes hélixekhez tartozó metszet-pontok, és a hélixek közös tengelyének megfelelő metszet-pont.

Egyetlen olyan speciális eset van, amikor a közös tengelyhez tartozó pont a két hélixhez tartozó 1-1 pont által meghatározott (a két hélix adott síkban értelmezett távolságát definiáló) szakasz felező pontja. Más szóval, ebben a speciális esetben a két hélix 1-1 pontja a tengelyponthoz képest diagonálisan helyezkedik el. Ebben a kitüntetett esetben a fent említett szakasz hossza, vagyis a két hélix távolsága, megegyezik a hélixek átmérőjével. Ebben a speciális elrendeződésben a kettőshélix esetén kialakuló két árok mérete megegyezik, vagyis nem különböztethető meg egy kisebb és egy nagyobb árok.

Az általános esetben azonban az említett szakasz nem esik egybe az átmérővel, a három említett pont elrendeződése nem diagonális, és emiatt megjelenik egy kisebb, és egy nagyobb árok (lásd 12.24. ábra) .

12.24. ábra: A hélix távolság, az átmérő, és a hélix árkok kapcsolata

12.24. ábra: A hélix távolság, az átmérő, és a hélix árkok kapcsolata

A DNS-re ez az általános eset vonatkozik. A két C1’ szénatomot összekötő szakasz nem megy át a közös tengelyen, a szakasz távolsága alig több mint a fele a hélix átmérőjének. A DNS-ben emiatt a kialakuló két árok mérete eltér, létrejön egy folytonos kisárok, és egy folytonos nagyárok (lásd 12.22. ábra) .

A bázispárokat, valamint a két árok kettősspirál tengelyére merőleges sík-vetületét a 12.25. ábra mutatja.

12.25. ábra: A DNS kettőspirál külsején végighúzódó nagyárok és kisárok elhelyezkedése

12.25. ábra: A DNS kettőspirál külsején végighúzódó nagyárok és kisárok elhelyezkedése

A kétféle árok létének fontos funkcionális jelentősége van. A DNS-kötő fehérjék általában a nagyárok felől lépnek a DNS-sel kölcsönhatásba (lásd pl. 18.1.1. fejezet)

12.3.3. A komplementaritás következménye

A DNS kettős spirál két lánca a bázisokon keresztül szigorú, és egyértelmű szabályok szerint kapcsolódik egymással. Ennek az az eredménye, hogy az egyik szál bázissorrendje (szekvenciája) egyértelműen megszabja a vele párban álló másik szál bázissorrendjét. A két szál egymást mintegy kiegészíti, egymással komplementer. Az egyik szál szekvenciáját ismerve a másiké automatikusan adódik a szabályok ismeretében. Ez nemcsak DNS-DNS, de DNS-RNS és RNS-RNS kapcsolatra is vonatkoztatható, ugyanis az RNS-ben szereplő uracil bázispárosodás tekintetében csereszabatos a timinnel.

A DNS kettős-spirál szerkezete azonnal logikus hipotézist kínált arra, hogy miként lehet a DNS egyfajta generációról generációra átadódó, tehát öröklődő információ hordozója (lásd 12.26. ábra).

12.26. ábra: A DNS egymással komplementer szálai elegáns másolási módot tesznek lehetővé

12.26. ábra: A DNS egymással komplementer szálai elegáns másolási módot tesznek lehetővé

Az információt a bázisok sorrendje kell, hogy hordozza, így annak hű átadásához egy olyan új kettős spirált kell létrehozni, melynek bázissorrendje pontosan megegyezik az eredetiével.

Mivel a DNS két szálának bázissorrendje egymás által kölcsönösen meghatározott, a két szálat felnyitva, és mindkettő mellé új komplementer bázissorrendű szálakat létrehozva az eredeti kettős spirál helyett két új, az eredetivel azonos bázissorrendű kettős spirál jön létre, lásd replika (másolat) készítés, vagy replikáció.

A komplementer DNS-RNS hibridek lehetősége azt is megmutatta, hogy a DNS-ben lévő információ RNS molekulákra is átírható. A DNS-ről RNS másolat készítése az átírás, a transzkripció.

12.3.4.  A Watson-Crick modellt igazoló biofizikai mérések

A Watson-Crick modell megalkotásakor rendelkezésre álló röntgendiffrakciós adatok ugyan nagyban segítették a modell létrehozását, de nem voltak olyan minőségűek, hogy közvetlen bizonyítékul szolgálhattak volna a modell kizárólagosságát illetően. Nem lehetett egyértelműen kijelenteni, hogy másfajta szerkezet ne eredményezhetné a kapott röntgenszórási adatokat.

Éppen ezért még jó ideig élénk tudományos vita zajlott a modell érvényességét illetően. Az elkövetkező években biofizikai mérések is a modell helyességét támasztották alá.

Az aromás szerkezetű nukleinsav bázisok delokalizált elektronszerkezetük miatt ultraibolya tartományú fénnyel könnyen gerjeszthetők, 260 nm-es hullámhossz körül fényabszorpciós (extinkciós) maximumuk van (lásd 12.27. ábra).

12.27. ábra: Az egyes nukleinsav bázisok ultraibolya tartományban fényt nyelnek el

12.27. ábra: Az egyes nukleinsav bázisok ultraibolya tartományban fényt nyelnek el

Ismert jelenség volt, hogy a hőmérséklet emelésének hatására a DNS oldat fényelnyelése jelentősen, mintegy 50%-kal megnő. Ezt a jelenséget hiperkróm effektusnak nevezték. A jelenség reverzibilisnek bizonyult, az eredeti hőmérsékletre visszahűtve a DNS oldat fényelnyelése az eredeti értékre csökkent, amit hipokróm effektusnak neveztek el.

A hiperkróm-hipokróm effektust a Watson-Crick modell kiválóan magyarázza. A hőmérséklet emelésének hatására az eredetileg kétszálú, natív DNS denaturálódik, a DNS két szála elválik egymástól. A bázisok az egyszálú nukleinsavban hatékonyabban nyelik el a fényt, tehát nagyobb a moláris extinkciós együtthatójuk, mint duplaszálú DNS-ben, ahol a bázisok egymással másodlagos erőkkel kölcsönhatásban vannak. Az effektus felhasználható a DNS hődenaturációjának kísérletes mérésére (lásd 12.28. ábra).

12.28. ábra: A natív kétláncú DNS szerkezet hőmérséklet emelésére denaturálódik, a láncok elválnak egymástól

12.28. ábra: A natív kétláncú DNS szerkezet hőmérséklet emelésére denaturálódik, a láncok elválnak egymástól

A hőmérséklet emelésével a két szál elválik, a szerkezet mintegy „megolvad”. Az eredmény jól jellemezhető azzal a hőmérséklettel, ahol a duplaszálú szerkezetnek éppen a fele denaturálódott (a hiperkróm effektus a maximális effektusnak éppen a fele). Azt a pontot, ahol a fényelnyelés alapján az oldatban lévő DNS molekulák 50%-a került egyszálú, tehát denaturált állapotba, olvadási hőmérsékletnek (pontnak) nevezték el, rövidítése Tm (melting temperature). Különböző DNS molekulák különböző görbéket eredményeztek eltérő olvadásponttal. Ami a görbékben közös volt, az a szigmoid alak, és a meredek emelkedés egy szűk hőmérséklet tartományban. A görbék rendkívül hasonlítanak a globuláris fehérjék hődenaturációjára jellemző görbékre. Ahogy ott is, a szigmoid alak itt is arra utal, hogy a natív szerkezetet kooperatív kölcsönhatások stabilizálják. Ha egy-egy kölcsönhatás felbomlik, az destabilizálja a maradék kölcsönhatásokat.

Mérésekkel sikerült igazolni, hogy minél magasabb a nukleinsavban a G:C bázisok összes bázishoz viszonyított aránya, annál magasabb a DNS olvadási pontja (lásd 12.29. ábra).

12.29. ábra: A DNS-denaturációhoz tartozó olvadási hőmérséklet arányos a DNS G:C tartalmával. A betétábrán egy DNS elektronmikroszkópos képe látható, pirossal jelölve az alacsonyabb hőmérsékleten megolvadt AT gazdag részletet.

12.29. ábra: A DNS-denaturációhoz tartozó olvadási hőmérséklet arányos a DNS G:C tartalmával. A betétábrán egy DNS elektronmikroszkópos képe látható, pirossal jelölve az alacsonyabb hőmérsékleten megolvadt AT gazdag részletet.

Ezt ismét jól magyarázta a Watson-Crick modell, hiszen a modell szerint G:C párban három, míg az A:T párban csak két hidrogénhíd létesül a bázisok között.

Egy nagyméretű DNS-ben ezért először az AT bázisokban gazdag részletek „olvadnak” meg, ami elektronmikroszkóppal demonstrálható (lásd 12.29. ábra).

A reverzibilis renaturáció miatt eltérő eredetű, pl. eltérő fajokból származó denaturált DNS-ek egymással összekeverve és renaturálva vegyes hibrideket képeznek. A hibridizáció mértéke a hipokróm effektuson keresztül követhető. Minél hasonlóbb két élőlény genetikailag, annál nagyobb mértékű a hipokróm effektus (lásd 12.30. ábra).

12.30. ábra: Hasonló szekvenciájú denaturált DNS-ek renaturálásakor vegyes heteroduplexek jöhetnek létre

12.30. ábra: Hasonló szekvenciájú denaturált DNS-ek renaturálásakor vegyes heteroduplexek jöhetnek létre

A DNS reverzibilis renaturációján alapszanak a géntechnológiában igen hasznos, sokféle célra használható hibridizációs technikák is (lásd 19.3. fejezet)

12.3.5. A DNS magasabbrendű szerkezeti formái

Az egyes genomok ismert méretéből, a B-DNS szerkezetet feltételezve, kiszámítható az adott DNS fizikai mérete, az ún. kontúrhossz. A kontúrhossz minden esetben jóval nagyobb, mint a DNS-t befogadó objektum átmérője, legyen ez az objektum akár vírusrészecske, baktériumsejt, vagy egy eukarióta sejt sejtmagja. Nyilvánvaló, hogy a lineáris tengelyű kettős spirál, vagyis a klasszikus B-DNS modell önmagában nem magyarázza meg, hogyan férhet el a DNS a „tartóedényében”.

In vitro vizsgálatok alapján kiderült, hogy a teljesen hidratált, minimum szabadentalpia-szinten lévő (relaxált) B-DNS egy hélixmenetére 10,4 bázis jut.

Mint kiderült, in vivo, tehát a sejtekben, a DNS ennél kissé kitekertebb, nyitottabb, abban kb. 11 bázispár jut egy fordulatra. Ez az előzővel összevetve egyben azt is jelzi, hogy a sejtekben lévő DNS magasabb szabadentalpia-szinten van, „feszítettebb”, mint a normál B-DNS.

Amikor a DNS molekula működik, a két szálának rendszeresen fel kell nyílnia ahhoz, hogy akár az egyik (lásd transzkripció), akár mindkét szála (lásd replikáció) templátként működhessen, a rajta lévő bázissorrend „kiolvasható” legyen. A kitekertebb, feszített alapszerkezet éppenséggel elősegíti a két szál elválását.

Ebben a fejezetben megismerkedünk azokkal a modellekkel, amelyek magyarázatot adnak a feszítettebb szerkezet létrejöttére (szuperhelikalizáció) prokariótákban és eukariótákban, és a DNS szoros pakolására (kromatin struktúra) eukariótákban.

Az 1940-es évek végén elsősorban Joshua Lederberg és Edward Tatum eredményei nyomán kiderült, hogy a baktériumok is képesek egyfajta ivaros folyamatra: képesek egymásnak genetikai információt átadni a konjugációnak elnevezett folyamat révén. Edward Tatum és George Beadle emellett Neurospora crassa (kenyérpenész) modellen végrehajtott vizsgálataikkal kiderítették, hogy az egyes enzimek mögött jól definiálható gének állnak, felállították az „egy gén egy enzim” hipotézist. Lederberg, Beadle és Tatum 1958-ban orvosi Nobel-díjat kaptak.

Visszatérve a konjugációra: elsőként ennek a folyamatnak a felismerése tette lehetővé a bakteriális gének egymáshoz képesti sorrendjének meghatározását. A gének sorrendjének vizsgálata arra a meglepő eredményre vezetett, hogy a bakteriális genom egyetlen hatalmas köralakú (cirkuláris) DNS kell, hogy legyen. Az Escherichia coli genomjának mérete kb. 4,6 millió bázispár, így a 2 nm átmérőjű B DNS teljes hossza kb. 1,7 mm. Ez valahogy bele van pakolva a kb. 850-szer kisebb átmérőjű, 2 μm-es kóli sejtbe. A kóli elektronmikroszkópos vizsgálata során kiderült, hogy az óriási DNS molekulán kívül, ahhoz képest kicsi, köralakú, extrakromoszómális DNS-ek is lehetnek a sejtben. Ezeket plazmid DNS-nek nevezték el. (Egy baktérium genomja ezek szerint egy milliós nagyságrendű bázispár alkotta cirkuláris DNS-ből, amit kissé pongyola kifejezéssel „bakteriális kromoszómának” nevezünk, és maximum 100 ezer bázispár méretű, szintén cirkuláris, plazmid DNS-ekből állnak. A genetikai információ nagy részét hordozó DNS pontos elnevezése kromofór, hogy megkülönböztessük a DNS és hisztonok komplexéből szerveződő kromatintól – aminek a legkondenzáltabb, fénymikroszkóppal is látható formája a kromoszóma.)

A kétszálú, köralakú plazmid DNS-ek nem csak a legegyszerűbb köralakot vehetik fel, hanem önmagukra többszörösen feltekert szuperhelikális formákat is (lásd 12.31. ábra).

12.31. ábra: Relaxált és szuperhelikalizált plazmid DNS-ek elektronmikroszkópos képe

12.31. ábra: Relaxált és szuperhelikalizált plazmid DNS-ek elektronmikroszkópos képe

Mint kiderült, az ilyen feltekeredés közvetlen kapcsolatban áll a plazmidon belüli DNS kettős-spirál szerkezetének bizonyos geometriai jellemzőivel. A jelenség leírásához és lényegi megértéséhez a matematika egyik ága, a topológia nyújtott segítséget, sőt, a biológusok által a köralakú DNS-nél felismert jelenség a topológia új ágát indította el. Először nézzünk két hétköznapi példát, ami közelebb vihet majd a DNS-sel kapcsolatos problémakör megértéséhez.

Mindenki találkozott a következő jelenséggel: ha egy fonalat (pl. cérnát) egyik végén rögzítünk, a másikon pedig sodrunk, akkor a fonal önmaga köré fog tekeredni, mégpedig a sodrás irányától függő irányban. A fonal kezdetben relaxált, energiaminimumon lévő szerkezetben van. A sodrás ebben a szerkezetben feszültséget okoz. A fonalban keletkező feszültséget a tapasztalt feltekeredés részben csökkenteni képes, éppen ezért megy végbe. A DNS esetéhez egy lépéssel közelebb haladva vegyünk egy spirált, tehát hélixet, ami lehet egy klasszikus telefonzsinór. Ennél jobban látható a feszültség kialakulásának oka, és a relaxáció módja. A zsinór úgy készült, hogy feszítetlen állapotában eleve spirális. Ennyiben a relaxált B-DNS jó modellje (bár ezt csak egy lánc alkotja). A feszítetlen spirál jellemezhető a menetek sűrűségével: menetek száma / spirált alkotó szál hossza. Ezt a menetsűrűséget növelhetjük a spirál „betekerésével”, illetve csökkentjük a spirál „kitekerésével” (lásd 12.32. ábra).  A zsinórban mindkét esetben feszültség keletkezik, aminek hatására a zsinór önmaga körül tekeredni fog. Miközben a zsinór saját tengelye önmaga körül tekeredik, a tengely körül tekeredő spirálban az egyes menetek egymástól való távolsága alig változik az eredetihez képest! Tehát a zsinór azáltal, hogy szuperhélixet képez, nagyjából megőrzi az eredeti, relaxált geometriára jellemző menetsűrűségi állapotát.

12.32. ábra: Egy relaxált állapotban spirális fonal saját tengelye menti pödrése szuperhelikális szerkezetet eredményez

12.32. ábra: Egy relaxált állapotban spirális fonal saját tengelye menti pödrése szuperhelikális szerkezetet eredményez

Végül a DNS modelljeként vegyünk két fonalat egy jobbmenetes kettősspirálban  (lásd 12.33. ábra).

12.33. ábra: Egy duplaszálú hélix két szálának szétnyitása menetsűrűség növekedést okoz, ami szuperhélixekhez vezet

12.33. ábra: Egy duplaszálú hélix két szálának szétnyitása menetsűrűség növekedést okoz, ami szuperhélixekhez vezet

Ezzel a példával egy, az előzőektől kissé eltérő jelenséget is szemléltethetünk. Rögzítsük a duplaszálú szerkezet egyik végét. A másik végen a két szálat kezdjük szétnyitni. A szétnyitás a még szét nem nyílt részen menetsűrűség növekedéssel jár. Az eredeti számú egymás köré tekeredés egyre rövidebb szakaszon valósul meg (lásd 12.33. ábra).

DNS esetén az analóg esetben a még szét nem nyílt részen növekedne az egységnyi monomerszámra jutó menetek száma, vagy fordítva szemlélve csökkenne az egy menetre jutó bázisok száma. Ez, ahogy az ábra mutatja, balmenetes szuperhélix képződéséhez vezet. Balmenetes a szuperhélix akkor, ha a szuperhélixet a tengelye irányából szemlélve, és gondolatban a hélixen távolodva haladván a hélix tengelyét az óramutató járásával ellenkező irányban kerüljük meg. A balmenetes szuperhélixet pozitív, a jobbmeneteset negatív szuperhélixnek is nevezik.

A sejtben a DNS-nek működése során gyakran fel kell nyílnia, ami energetikailag kedvezőtlen a fenti torlódás miatt. A felnyílást segítené, ha a DNS a torlódás miatt kialakuló balmenetes szuperhélix-szel ellenkező irányú, jobbmenetes szuperhélixben lenne. Egy ilyen szerkezetű DNS ugyanis a kinyílásakor relaxálódna. A jobbmenetes szuperhélixű DNS egy menetére több bázispár jutna, mint az energia-minimumon lévő B DNS-re jellemző 10,4 bp. Tehát a jobbmenetes szuperhélixben lévő DNS szerkezet is feszített lenne, ami miatt könnyebb lenne elválasztani a két szálát, mint a normál, relaxált DNS esetében.

A prokariótákban és az eukariótákban is működik olyan mechanizmus, ami ilyen nyitottabb DNS-t eredményez, de a két alapvető sejttípusnál a nyitottabb forma előállítása eltérő módon zajlik.

Nézzük meg először a prokarióta esetet (lásd 12.34. ábra).

12.34. ábra: Egy köralakú duplaszálú DNS két hélixmenetét megszüntetve kétmenetnyi szuperhélixet kapunk

12.34. ábra: Egy köralakú duplaszálú DNS két hélixmenetét megszüntetve kétmenetnyi szuperhélixet kapunk

A prokarióta genom és az extra-kromoszómális plazmid DNS egyaránt köralakú, cirkuláris. A következő gondolatkísérletben vegyünk egy 25-menetet tartalmazó, 10,4 bp-menetes lineáris B DNS-t, ami tehát 25x10,4=260 bázispárt tartalmaz. A két véget kovalensen összekötve egy síkban kiteríthető, relaxált köralakú DNS-t kapunk.

A körben a két DNS szál 25-ször kerüli meg egymást, ennyiszer van egymás köré fonva. Ezt az angol „linking number” (összekapcsolódási szám) kifejezés alapján az Lk érték fejezi ki, tehát Lk = 25. A két szál a közös tengelyt is éppen 25-ször kerüli meg, ezért a csavarodás érték,T = 25 (T: twist). A közös tengely nem tekeredik önmaga köré, ezért a tekeredési érték, W = 0 (W: writhe). A W értéke adja meg tehát a szuperhelikális csavarok számát.

Az Lk érték egy topológiai fogalom. Két láncból álló kör esetében azt fejezi ki, hogy a két lánc hányszor van egymáshoz kapcsolva (lásd 12.35. ábra).

12.35. ábra: Az Lk (linking number) érték azt mutatja meg, hogy két kör hányszor van egymáshoz kapcsolva

12.35. ábra: Az Lk (linking number) érték azt mutatja meg, hogy két kör hányszor van egymáshoz kapcsolva

Látható, hogy ez a szám pusztán a két kör gyűrésével, hajtogatásával, forgatásával stb. nem változhat, mindaddig, amíg a két szál intakt. Az Lk érték megváltozásához legalább az egyik szálnak átmenetileg fel kell nyílnia, ami DNS esetén kovalens kötés hasadásával kell, hogy járjon. Ez tehát mutatja, hogy az Lk egy konfigurációval kapcsolatos szám. A csak az Lk értékükben különböző köralakú DNS-ek egymásnak topológiai izomerjei, röviden topoizomerei.

Most nyissuk ki a kört, szüntessünk meg két menetet, és zárjuk újra össze a kört. Ekkor két extrém végállapot lehetséges. 1. A DNS kör síkban marad, mindenhol megtartja a B DNS konformációt, kivéve kétmenetnyi szakaszon, ahol teljesen nyitott lesz. 2. A DNS teljes hosszában összezáródik, mindenhol egyformán, majdnem tökéletes B DNS konformációban marad, de ekkor kétmenetnyi jobbmenetes szuperhélix jelenik meg rajta (lásd 12.35. ábra).

A két említett forma termodinamikai egyensúlyban van, de a szuperhelikális van alacsonyabb szabadentalpia szinten, ezért ez lesz a gyakoribb állapot.

A kísérlet elején egy Lk = 25, T = 25, W = 0 állapotú relaxált körből indultunk ki, a végén legstabilabb formaként egy Lk = 23, T = 25, W = -2 állapotú, két negatív szuperhélixet tartalmazó formát kaptunk. Vegyük észre, hogy a három paraméter között az alábbi összefüggés áll fenn: Lk = T + W.

A T=25 jelzi, hogy mindkét forma B-DNS konformációban van, a W érték jelzi a szuperhélixek számát, és irányát, az Lk pedig azt, hogy a láncok hányszor kerülik meg egymást.

A fenti gondolatkísérletben láttuk, hogy két menet kitekerésével egy 2 Lk értékkel kisebb topoizomer DNS jön létre, ami kétmenetnyi jobbmenetes szuperhélixet indukál. A 12.36. ábra azt mutatja be, hogy ugyanezt a végállapotot máshogy is elérhetjük.

12.36. ábra: Két szuperhélix menet létrehozása a szál ideiglenes elvágásával, és egy másik szakasz átfűzésével

12.36. ábra: Két szuperhélix menet létrehozása a szál ideiglenes elvágásával, és egy másik szakasz átfűzésével

Ehhez a DNS két szálát elvágjuk, és a résen a másik (duplaszálú) DNS-szakaszt megfelelő irányban átfűzzük. A prokarióta topoizomeráz II enzim éppen ezt teszi, így képes jobbmenetes, negatív szuperhélixeket létrehozni köralakú DNS-ekben. Az enzim egy relaxált, alacsony szabadentalpia-szintű állapotból egy feszített, magasabb szabadentalpia-szintű formát hoz létre. Ez a folyamat önmagában tehát szabadentalpia növekedéssel járna, tehát endergonikus lenne, nem menne végbe spontán. A reakció azért megy mégis végbe, mert egy kapcsolt reakcióban egy nagy negatív szabadentalpia változással járó másik folyamat is lezajlik. Az enzim a működése során ATP-t is hidrolizál ADP-re. Az enzim felépítését és a folyamatot a 12.37. ábra, illetve a 12.38. ábra mutatja be.

A topoizomeráz II egy kétfogású cirkuláris szimmetriával rendelkező homodimer enzim. Az alegységek kétdoménesek. Az „A” domének két Tyr oldalláncon keresztül hasítja a DNS egy-egy foszfodiészter kötését.

A „B” doménnek ATP-áz aktivitása van, az ATP hidrolízise hajtja termodinamikai értelemben a reakciót. Az ATP-ben rejlő kémiai energia mechanikai feszültség létrehozásához használódik fel, tehát a topoizomeráz II egy motorfehérje. (Minden fehérje molekuláris motornak tekinthető, ha az ATP kémiai energiáját mechanikai feszülésre vagy elmozdulásra konvertálja.)

12.37. ábra: Egy prokarióta topoizomeráz II enzim szerkezete duplaszálú DNS-sel komplexben (PDB: 1BGW)

12.37. ábra: Egy prokarióta topoizomeráz II enzim szerkezete duplaszálú DNS-sel komplexben (PDB: 1BGW)

12.38. ábra: A topoizomeráz II enzim működési mechanizmusa

12.38. ábra: A topoizomeráz II enzim működési mechanizmusa

Alapállapotban a topoizomeráz II enzim nem köt ATP-t, és olyan konformációban van, amelyben képes egy duplaszálú DNS szakasz kötésére. Ezt a DNS-t „G” (gate) DNS-nek hívjuk, mert ez lesz mintegy kapuként kinyitva ahhoz, hogy egy másik duplaszálú DNS át legyen szállítva rajta. Az enzim térszerkezete a G DNS-sel alkotott komplexben kissé módosul, ezáltal képessé válik egy másik DNS szakasz, majd ezt követően ATP kötésére. Ez a másik DNS szakasz a „T”, vagyis transzportált DNS. Az ATP kötés hatására az ATP-áz domének egymás felé mozdulnak, a G DNS mindkét szálon elhasad, de kovalensen kötve marad az enzimhez, és az A domén konformációváltozása miatt a G DNS-ben megjelenik a „kapu”. A T DNS átszállítódik ezen a kapun, majd egy újabb A-domén konformációváltozás keretében , leválik az enzimről, miközben az enzim az elvágott szálakat újra összekapcsolja. Ezt követően az enzim katalizálja az ATP hidrolízisét, ADP és foszfát keletkezik, amelyek leválnak az enzimről, így az enzim visszatér az alapállapotába.

Az ATP átalakulásakor felszabaduló kémiai energia értéke megszabja, hogy mekkora maximális feszültséget lehet általa a DNS-ben létrehozni, tehát megszabja a „bepumpálható” szuperhélixek maximális számát.

A mechanikai feszültséget hordozó, negatív szuperhelikális DNS szerkezetet természetesen ATP felhasználása nélkül is lehet relaxálni, de ehhez is kémiai kötést kell bontani a DNS láncon belül. Elegendő a DNS-nek csak az egyik szálát elvágni, az elvágott szál az ép szál körül forogva kipöröghet. A sejtben ezt a folyamatot is enzim katalizálja, mégpedig a topoizomeráz I enzim.

Az enzim működési mechanizmusát a 12.39. ábra illusztrálja.

12.39. ábra: A topoizomeráz I enzim működési mechanizmusa

12.39. ábra: A topoizomeráz I enzim működési mechanizmusa

A topoizomeráz I relaxálja a feltekert DNS molekulákat, egyenként kipörgetve egy-egy negatív szuperhélixet. A reakció során csak egyetlen szálat hasít, és azt egy ütemben csak egyszer hagyja a másik szál körül körbefordulni. A két szálat újra összekapcsolja.

A 12.40. ábra egy olyan kísérletet demonstrál, amelyben egy topoizomeráz II enzimmel korábban sokszorosan feltekert, negatív szuperhélixeket tartalmazó, köralakú, kétszálú DNS-t kezelünk topoizomeráz I enzimmel. A folyamatot a topoizomeráz I hozzáadásával indítjuk, majd különböző időegységekben mintát veszünk, a mintában az enzimet denaturáljuk, majd a különböző időtartamokhoz tartozó mintákat agaróz gélelektroforézissel elemezzük.

12.40. ábra: A topoizomeráz II által készített szuperhelikalizált DNS topoizomeráz I által relaxálható.A különböző számú szuperhélixet tartalmazó formák látszólagos mérete eltérő, ezért agaróz elektroforézissel elválaszthatók egymástól. Az ábra egy ilyen gélkép rajza. A topoizomeráz egyenként szűnteti meg a szuperhélixeket, ezért diszkrét intermediereket kapunk.

12.40. ábra: A topoizomeráz II által készített szuperhelikalizált DNS topoizomeráz I által relaxálható. A különböző számú szuperhélixet tartalmazó formák látszólagos mérete eltérő, ezért agaróz elektroforézissel elválaszthatók egymástól. Az ábra egy ilyen gélkép rajza. A topoizomeráz egyenként szűnteti meg a szuperhélixeket, ezért diszkrét intermediereket kapunk.

A maximálisan szuperhelikalizált DNS a kísérletben a legkompaktabb molekula, amely a gélben a leggyorsabban vándorol (legalul helyezkedik el). Kontrollként a relaxált körnek megfelelő topoizomert is belekeverték a mintába. A szuperhélixek számának csökkenésével a molekula Stokes-sugara egyre növekszik, így minél kevesebb szuperhélixet tartalmaz a DNS, annál lassabban vándorol a gélben. Jól látható, hogy diszkrét számú eltérő forma létezik.

Az eukarióták is nyitottabb DNS-t hoznak létre, de ezt merőben eltérő módon teszik. Ráadásul az eukariótáknál ennek a megoldásnak a funkciója csak részben a nyitottabb szerkezet létrehozása. Másik fő funkcióként az eukarióta DNS szuperhelikalizációja egyben a DNS tömörebb összepakolásának (kondenzációjának) első lépését is jelenti.

A prokariótáknál látott jobbmenetes, negatív szuperhélix (amit plektonémának is neveznek) topológiailag egyenértékű egy balmenetes, úgynevezett szolenoid szerkezettel (lásd 12.41. ábra).

12.41. ábra: A szolenoid szerkezet egyenrangú a szuperhélixes plektonéma szerkezettel

12.41. ábra: A szolenoid szerkezet egyenrangú a szuperhélixes plektonéma szerkezettel

A szolenoid szerkezet csak akkor jöhet létre, ha az abban szereplő fonál, ami ebben az esetben a kettősszálú DNS, valami köré tekeredik. Ez az eukariótáknál úgy valósul meg, hogy a DNS egy hiszton fehérjékből álló komplex köré tekeredik. Az „orsót”, amire a DNS kettősspirál tekeredik nyolc polipeptidlánc alakítja ki a következő összetételben: (H2A, H2B, H3, H4)2. A hiszton magra tekeredő DNS szerkezeti egysége az először elektronmikroszkóppal detektált nukleoszóma. A nukleoszómára kb. 200 bp DNS jut. Ebből 146 bp vesz részt a hisztonmag körüli kb. 1,8 menetnyi feltekeredésben, a maradék pedig egy rövid összekötő részt alkot, ami a H1 hisztonfehérjéhez és más, nem-hiszton fehérjékhez kötődik (lásd 12.42. ábra)

12.42. ábra: Az elektronmikroszkópos gyöngysorszerkezet, és az annak megfelelő nukleoszómás modell

12.42. ábra: Az elektronmikroszkópos gyöngysorszerkezet, és az annak megfelelő nukleoszómás modell

A balmenetes szolenoid létrehozása topológiailag egyenértékű azzal, mintha egy jobbmenetes, negatív szuperhélixet hoznánk létre. A 12.43. ábra egy köralakú DNS-en mutatja be, hogy egy köralakú relaxált B-DNS esetén a hiszton mag körül kialakuló szolenoid miatt a maradék, nemkötődő részen egy pozitív szuperhélix szerkezet jönne létre.

12.43. ábra: A nukleoszóma szolenoid szerkezetének létrehozása szerkezeti feszültséget, és emiatt pozitív szuperhélixeket generálna, amiket az eukarióta topoizomeráz I szüntet meg

12.43. ábra: A nukleoszóma szolenoid szerkezetének létrehozása szerkezeti feszültséget, és emiatt pozitív szuperhélixeket generálna, amiket az eukarióta topoizomeráz I szüntet meg

A „végtelenül hosszú” lineáris eukarióta DNS-re is igaz, hogy a nukleoszómás szerkezet kialakulásakor a még nem szolenoid szerkezetben lévő részen a szerkezeti feszültség miatt pozitív szuperhélixek jelennének meg. Az eukarióta topoizomeráz I enzim a prokarióta enzimhez hasonlóan képes szuperhélix szerkezetet relaxálni, azzal a fontos különbséggel, hogy az eukarióta enzimek egy része képes pozitív szuperhélixen dolgozni (mely esetén ellenkező irányban kell megkerülnie az elvágott DNS szálnak az ép szálat).

Amikor az eukarióta topoizomeráz I a nukleoszóma szerkezet kialakulása során relaxálja a még nem nukleoszómás szerkezetben lévő részt, akkor végső soron a prokarióták negatív szuperhélix szerkezetével analóg DNS szerkezet jön létre úgy, hogy ehhez nem szükséges topoizomeráz II működés. A feszített szerkezetet a DNS és a nukleoszóma mag közötti kötési energia biztosítja.

Az eukarióta kromoszómákban a DNS egy, részben fehérjékből, részben RNS-ből álló vázhoz kapcsolódik, és ahhoz hosszú hurkokat képezve kötődik (lásd 12.44. ábra).

12.44. ábra: Az eukarióta DNS magasabbrendű szerkezeti szintjei eredményezik a kromoszóma szerkezetet

12.44. ábra: Az eukarióta DNS magasabbrendű szerkezeti szintjei eredményezik a kromoszóma szerkezetet

A nukleoszómás szerkezet csak az első szintje a DNS-fehérje komplexekből létrejövő kromatin szerkezetek kialakulásának. A legmagasabb szerkezeti szint, ami a legnagyobb szerkezeti tömörítést, kondenzációt jelenti, a fénymikroszkóppal is látható kromoszómákat eredményezi. A kromoszóma szerkezet felé haladva a nukleoszómás szerkezetből kiindulva további, magasabb szerkezeti szintek jönnek létre, így a DNS egyre kisebb térfogatrészbe zsúfolható.

Az egyik ilyen szint az úgynevezett 30 nm-es fibrillum lehet, ami elektronmikroszkóppal megfigyelhető. A 30 nm-es fibrillumból hurkok képződnek, amelyek egy-egy teljes gént hordozhatnak, és a kromoszóma vázszerkezete körül rendeződnek el.

A jelenlegi modell szerint 6 hurok alkot egy korongszerű rozettát, 30 rozetta hozhat létre egy csavart, és nagyjából 10 csavar tesz ki egy teljes kromatidát (a replikációt követően a sejtosztódás egy bizonyos szakaszáig minden kromoszóma két duplaszálú DNS-t tartalmaz, ezeket a duplaszálú DNS-eket hívjuk kromatidának).

Mint a következő fejezetekben látni fogjuk, a topoizomerázok fontos szerepet játszanak a DNS replikációban és a transzkripcióban.

Összefogalásképpen a DNS kémiai és térszerkezetét, valamint a Chargaff-szabályokat a 5. animáció, a DNS magasabbrendű szerkezeti szintjeinek kialakulását pedig 6. animáció mutatja be.