13.3. A Meselson-Stahl kísérlet: a DNS replikáció szemikonzervatív

Watson és Crick a DNS-szerkezeti modelljük megalkotásakor azonnal a legelegánsabb replikációs mechanizmust feltételezték. A szemikonzervatív modellt, amelyben a DNS két eredeti szála, tehát a szülői szálak teljes hosszukban elválnak egymástól, mindkettő templátként szolgál, és az új komplementer utódszálakkal összetapadva képezik a következő generáció két duplaszálú DNS-ét.

A szemikonzervatív modellben tehát a replikáció eredménye két olyan duplaszálú DNS, amelyben az egyik szál teljes egészében az előző generációból származik, míg a másik szál újonnan keletkezik.

A konzervatív modell szerint ennek éppen az ellenkezője lett volna igaz: a szülői szálak csak ideiglenesen váltak volna el egymástól, a komplementer szálak szintézisét követően a két szülői szál újra összeállt volna, az újonnan szintetizált szálak pedig egymással alkottak volna egy új párt. Ebben a modellben tehát megőrződne az eredeti szülői DNS-t, és keletkezne egy teljesen újonnan szintetizált utód DNS.

A mozaikos modell, amit Max Delbrück javasolt, meglehetősen komplikált, de egy jogos probléma látszólag egyetlen lehetséges megoldását kínálta. Delbrück arra az abban az időben joggal súlyosnak vélt technikai problémára hívta fel a figyelmet, hogy vajon miként lenne képes két egymás köré tekeredett DNS szál teljes mértékben széttekeredni. Ezt energetikailag és geometriai (topológiai) szempontból lehetetlennek tartották. Ha ezek a szálak nem tekerednének szét, akkor a keletkező két duplaszálú DNS tekeredne annyiszor egymás köré, ahányszor az eredeti DNS két szála tekeredett egymás köré. Ekkor pedig felmerül a kérdés, hogy ezt a két duplaszálú DNS-t hogyan lehetne elválasztani egymástól.

Delbrück a probléma megoldására a következő mechanizmust javasolta: mindkét szál egy időben templátként szolgál új szál szintéziséhez, de amint egy-egy 5-monomernyi (fél hélix-nyi) új szál szintetizálódik, a régi szálak elhasadnak, és az azonos irányultságú új szál és régi szál között jön létre kovalens kötés. Ennek eredményeként a replikáció után mindkét duplaszálú DNS mindkét szála 5-5 monomerként vegyesen eredeti, és újonnan szintetizált szálat tartalmazott volna, a két duplaszálú DNS hélix nem egymás köré tekeredve, hanem egymás mellett keletkezett volna.

Ezt a modellt elnevezte diszperzív modellnek, amire magyarul a mozaikos kifejezést alkalmazzuk. A három modellt a 13.2. ábra illusztrálja.

13.2. ábra: A replikáció elméletileg lehetséges modelljei

13.2. ábra: A replikáció elméletileg lehetséges modelljei

Számos kutatócsoport igyekezett kísérletesen alapon megfejteni, hogy a három közül melyik modell a helytálló. Ezt elsőként Matthew Meselson és Franklin Stahl derítette ki egy 1957-es kísérletben, amelyet sokan a molekuláris biológia legelegánsabb kísérletének tartanak (lásd 13.3. ábra).

A három említett modellt az különbözteti meg egymástól, hogy az első, illetve a második generációban alapvetően eltérő az egyes keletkező DNS-ekben a régi és az új DNS aránya. Olyan kísérletre volt szükség, amely valahogyan különbözővé tudja tenni a régi és az új szálakat, mégpedig olyan módon, hogy azután ez a különbség fizikai elválasztásra is módot adjon.

Meselson és Stahl az akkori időszak legmodernebb eljárásait kombinálta teljesen újszerű módon. A DNS-ben nagy arányban van nitrogén. A nitrogén leggyakoribb izotópja az 14N, vagyis a 14-es tömegszámú izotóp, amely atommagjában 7 proton és 7 neutron van. Egy jóval ritkább, nem radioaktív izotóp az 15N, amelyben 7 proton és 8 neutron van. Ez az izotóp, amely kémiai tulajdonságaiban természetesen tökéletesen megegyezik az 14N izotóppal, akkor már elérhető volt tisztított formában.

Az előkísérlet során kólibaktériumokat tenyésztettek 15N, tehát nehéz nitrogén-tartalmú tápoldatban több generáción át. A baktérium minden N-tartalmú molekulájába bekerült a 15N izotóp, így a DNS-ébe is, vagyis a sejtek „nehéz DNS-t” tartalmaztak.

Egy párhuzamos kísérletben normál 14N-tartalmú tápoldatban is tenyésztettek kólibaktériumot, amely így „normál DNS-t” tartalmazott, amit a különbséget kihangsúlyozandó, könnyű DNS-nek fogunk nevezni.

Az így előállított nehéz és könnyű DNS tömege, és ezáltal sűrűsége, csak 1%-ban tért el egymástól, ezt az apró különbséget kellett detektálni!

Mindkét esetben izolálták a baktériumból a DNS-t. Ezek után egy akkoriban újonnan kifejlesztett technikát vetettek be, a sűrűséggradiens centrifugálást, amelyben egy nagy tömeg/térfogat sűrűségű anyagnak, esetükben a cézium-kloridnak az oldatát használták. Ebből a centrifugacsőben gradienst hoztak létre, a cső alja felé fokozatosan nőtt a cézium klorid koncentrációja, és emiatt a közeg sűrűsége.

Amikor ezzel a technikával centrifugálták az oldat tetejére rétegzett DNS mintát, a DNS molekulák csak addig ülepedtek, amíg a környezetük sűrűsége éppen megegyezett a saját sűrűségükkel. Ezen a ponton megálltak, mintegy „lebegtek”. Meselson és Stahl kimutatták, hogy a kétféle tenyésztésből származó DNS sűrűsége közötti eltérés elegendően nagy ahhoz, hogy a centrifugálás végére eltérő sávba rétegződjenek a centrifugacsőben. Ha tehát a két eltérő sűrűségű DNS oldatát összekeverték, akkor ezek után ezzel a speciális centrifugálással a két formát el tudták választani egymástól.

Felmerülhet az olvasóban, hogy a sűrűség különbség helyett a „nehéz-DNS” és a „könnyű-DNS” tömegét is vizsgálhatták volna. Csakhogy ezzel kapcsolatban fontos tudnunk, hogy a DNS az izolálás során fizikai behatások miatt összetöredezik, és egy olyan keveréket kapunk, amelyben a legkülönbözőbb tömegű töredékek vannak. Az egy mintából származó, legkülönbözőbb tömegű darabok sűrűsége azonban azonos, így a kizárólag sűrűség alapján szeparáló technika ezeket egy rétegbe gyűjti!

Miután világossá vált, hogy a két minta sűrűség alapján elválasztható egymástól, elindulhatott a kísérlet érdemi része (lásd 13.3. ábra).

A kísérlet során ismét kólibaktériumokat tenyésztettek 15N tápoldatban több generáción át, majd átoltották a baktériumok egy részét normál, 14N-es tápoldatba. Az osztódó baktériumsejtek számát spektroszkópiai módszerrel (fényszóráson keresztül) mérték. Egy sejtosztódás után (tehát amikor a sejtszám a kezdeti érték duplájára nőtt) mintát vettek, a sejteket elölték, izolálták a DNS-t, és sűrűséggradiens centrifugálással meghatározták a sűrűségét. Ugyanezt megtették a második osztódást követően is.

Az eredmény a következő volt. Az első osztódás után csak közepes sűrűségű DNS-t kaptak. Ez kizárta a konzervatív modellt, amely szerint 50-50%-ban nehéz-DNS-t és normál-DNS-t kellett volna kapniuk. Az eredmény azonban mind a szemikonzervatív, mind a mozaikos modellel összhangban volt.

A második sejtosztódást követő eredmény szerint a mintában 50-50%-ban volt jelen közepes sűrűségű, és könnyű, azaz normális sűrűségű DNS. Ez az eredmény a szemikonzervatív modellel összhangban volt, azonban a mozaikos modellt kizárta, hiszen 50%-ban megjelent az a forma, amelyben két, tisztán 14N-es izotópot tartalmazó lánc alkotott egy közös duplaszálú DNS-t.

A mozaikos modell alapján mindig homogén sűrűségű DNS-t kellett volna izolálniuk, de annak sűrűsége generációról generációra haladva egyre jobban közelítette volna a könnyű DNS normális sűrűségét.

A kísérletnek később elvégezték egy még könnyebben értelmezhető változatát. Lúgos pH-n a DNS denaturálható, a két szál elválasztható egymástól. Magas pH-n végrehajtva a sűrűséggradiens centrifugálást nem duplaszálú DNS-eket, hanem egyszálú DNS-eket kellett megkülönböztetniük.

13.3. ábra: A Meselson-Stahl kísérlet bizonyítja, hogy a replikáció szemikonzervatív

13.3. ábra: A Meselson-Stahl kísérlet bizonyítja, hogy a replikáció szemikonzervatív

Így már az első sejtosztódás után ki lehetett mutatni, hogy kétféle DNS szál van jelen, egy olyan, ami csak nehéz láncból áll, és egy olyan, ami csak normál láncból áll. Így a mozaikos modell kizárható volt.

A semleges és lúgos közegben végrehajtott kísérletek eredményét a 13.4. ábra illusztrálja.

13.4. ábra: A Meselson-Stahl kísérlet kétszálú (pH 7,0) és egyszálú (pH 12,0) DNS-sel elvégezve.A DNS koncentrációját a centrifugacső tetejétől az aljáig fotometriás módszerrel határozták meg. Az ábrán a vízszintes tengely a sűrűséget, a függőleges tengely a DNS koncentrációt jelenti.

13.4. ábra: A Meselson-Stahl kísérlet kétszálú (pH 7,0) és egyszálú (pH 12,0) DNS-sel elvégezve. A DNS koncentrációját a centrifugacső tetejétől az aljáig fotometriás módszerrel határozták meg. Az ábrán a vízszintes tengely a sűrűséget, a függőleges tengely a DNS koncentrációt jelenti.