13.4. A Cairns-kísérlete: az origó és a replikációs villa kimutatása

Miután a replikáció szemikonzervatív mechanizmusa bizonyítottá vált, újabb kérdések sora merült fel:

A másolandó szálak a replikáció előtt teljesen elválnak egymástól, és csak ezek után szintetizálódik melléjük az új szál, vagy a szülői szálak egyszerre mindig csak egy kis szakaszon nyílnak szét, és mellettük folyamatosan zajlik az új szál szintézise?

A replikáció véletlenszerű helyeken indul el, vagy előre rögzített kezdőpontokon? Az elindulás (szál szétnyílás) helyétől számítva csak az egyik irányban, vagy mindkét irányban zajlik az új szálak szintézise?

Folyamatosan, tehát egyetlen darabban másolódik a DNS, vagy kisebb darabokban?

Ezekre a kérdésekre John Cairns rendkívül fontos kísérlete adta meg a válaszokat. Kóli sejteket növesztett radioaktív, triciált (3H) timidint tartalmazó táptalajon. A baktériumok felvették a radioaktív nukleozidot, és beépítették a DNS-ükbe. A bakteriális genom így radioaktívvá vált. Cairns rendkívül körültekintő eljárásokkal óvatosan feltárva a sejteket úgy tudott DNS-t izolálni, hogy az az esetek egy részében nem töredezett össze. A DNS-t tartalmazó oldatot óvatosan szétterítette egy sík felületen. A trícium bomlásából származó elektronok béta-sugárzás formájában bocsájtódnak ki, amit az autoradiográfiának nevezett módszer keretében a mintára helyezett röntgenfilmen lehetett detektálni. A viszonylag alacsony szintű radioaktivitás miatt mintegy 2 hónapos expozíciós időre volt szükség ahhoz, hogy a röntgenfilmen megjelenjen a DNS molekulák képe (lásd 13.5. ábra).

13.5. ábra: Cairns radioaktív kísérlete láthatóvá teszi a DNS szintézis topológiáját

13.5. ábra: Cairns radioaktív kísérlete láthatóvá teszi a DNS szintézis topológiáját

A ~ 1,7 milliméteres hosszúságú DNS képe már kis nagyítás mellett is jól vizsgálható volt, de további nehézséget jelentett, hogy viszonylag ritkán sikerült szuperhélix-mentes, teljesen kiterített DNS-t találni. Amikor azonban ez sikerült, Cairns egyértelműen ki tudta mutatni, amit a bakteriális genetika korábban javasolt. A kóli genomja valóban egyetlen, köralakú DNS molekula.

A DNS molekulákat különböző replikációs fázisban rögzítve kiderítette, hogy a replikáció egyetlen ponton indul el. Később, más eljárásokkal kombinálva azt is kiderítették, hogy az egyetlen helyen elinduló replikáció nem akárhol kezdődhet, ez az egyetlen hely a bakteriális „kromoszómának” (kromofórnak) egy szigorúan meghatározott helye, amit replikációs origónak neveztek el.

A különböző fázisban „lefényképezett” állapotokat sorba lehetett rendezni, és így egy logikus modellt lehetett felállítani a bakteriális kromoszóma másolásának mechanizmusára. Az origónál a két szülői szál felnyílik, egy kis szakaszon szabaddá válnak a szülői szálak. Az autoradiográfiás képek tanulsága szerint mindkét szülői szál mentén zajlik az új szálak szintézise. A szülői szálak folyamatosan nyílnak szét, és ezzel lépést tartva keletkezik az új DNS. Először egy kis „szem” jelenik meg, majd a képződmény „buborék”-ra emlékeztet, ami egyre nagyobbá válik. Amikor a DNS-nek mintegy a fele lemásolódott, a szerkezet a görög teta betűre (θ) emlékeztet.

A DNS szerkezetének ismeretében, valamint a Cairns kísérletek alapján megjósolható volt a replikációs villának nevezett struktúra, ami a Cairns kísérletben a buborék két „szegletében” van (lásd 13.6. ábra).

13.6. ábra: A replikációs villa egyszerűsített sémája

13.6. ábra: A replikációs villa egyszerűsített sémája

A replikációs villát annak a pontnak a környezete jelöli ki, ahol a szülői DNS szálak éppen felnyíltak, hogy templátként szolgálhassanak az új szálak szintéziséhez. Mivel mindkét szál egyaránt szabaddá válik, elvileg mindkettő mellett egy időben mehet az új szál szintézise.

Cairns az eredeti kísérletét továbbfejlesztve további ismeretekhez jutott. Az eredeti kísérletben folyamatos volt a radioaktív jelölés, tehát a régi és az új szálak egyaránt jelölve voltak.

A továbbfejlesztett módszerben Cairns az alábbiak szerint járt el. A baktériumot olyan táptalajon tartotta, ami nem jelölt, és radioaktívan jelölt timidin keverékét tartalmazta, de csak alacsony százalékban tartalmazta a jelölést biztosító tríciált timidint. Ennek eredményeként a DNS, beleértve a szülői DNS-t, gyengén jelölődött, de detektálható volt. A 13.6. ábra és 13.7. ábra ezeket a szakaszokat kék vonallal ábrázolja.

Ezek után a baktériumot olyan tápoldatba oltotta át, amelyben nagy százalékban volt tríciált timidin, ami ezért intenzív radioaktív jelölést eredményezett.  Ezt a második jelölést csak pár másodpercig alkalmazta, és a sejtet elölve leállította a replikációt. Az erősebb jelölést a 13.6. ábra és 13.7. ábra piros szakaszokkal mutatja.

A nagy koncentrációjú, rövid pulzusban adott radioaktív timidin az éppen újonnan szintetizálódó helyekre beépülve ezeket a helyeket intenzívebb jellel látta el. Kiderült, hogy a 13.7. ábrán szereplő replikációs villa mindkét szára mellett van új szál szintézis. Tehát a két régi szál szétnyílásának ütemében mindkét régi szál mellett egyidejűleg jelennek meg az új szálak. A folyamatot időben követve a jelölés a 13.6. ábra szereplő nyilak irányában halad, miközben maga a replikációs villa is erre halad. Figyelem! Csak a jelölés megjelenése ilyen irányú, a láncépítés kémiai iránya, mint látni fogjuk, ettől az egyik lánc esetében eltér.

A replikációs buboréknak két szeglete van, így nem csak egy, hanem egyszerre két replikációs villa is lehet. A pulzusban alkalmazott jelöléssel Cairns azt is kimutatta, hogy a kóli replikációja során a buborék mindkét szegletében aktív replikációs villa működik. Mivel a kóli kromoszóma köralakú, ezért a két replikációs villa a teljes kromoszóma szempontjából egymás felé halad (lásd 13.7. ábra).

Számos egyéb organizmust megvizsgálva kiderült, hogy a kétirányú (bidirekcionális) replikáció az általános, tehát az, amikor a replikációs buborék mindkét szegletében működik 1-1 replikációs villa. Létezik kivétel is, a mitokondriális genomban, plazmidok és egyes vírusok replikációjakor például a buborékban csak egy replikációs villa működik.

13.7. ábra: A replikáció a legtöbb genom esetében kétirányú, de egyes speciális esetekben egyirányú

13.7. ábra: A replikáció a legtöbb genom esetében kétirányú, de egyes speciális esetekben egyirányú