13.5. A DNS szintézis kémiája

A DNS szintézis kémiai mechanizmusának feltárása elsősorban Arthur Kornberg nevéhez köthető. Kornberg az ötvenes évek elejéig elsősorban a koenzimek in vivo szintézisének a problémáján dolgozott. A dinukleotid szerkezetű koenzimek szintézisét megismerve arra jutott, hogy bizonyára a nukleinsavak sem közvetlenül az egyszerűbb építőegységekből (cukor, foszforsav, bázis) szerelődnek össze, hanem a már előre összeállított nukleotid egységekből. Szerette volna izolálni azt az enzimet, ami nukleotid szubsztrátokat használva felépíti a nukleinsavakat, de az enzim izolálásához szüksége volt ezekre a nukleotid szubsztrátokra. Ezért mintegy 5-6 év kutatómunkája során csoportjával feltárta a nukleotidok szintézisének módját, izolálva az ehhez szükséges enzimeket. Miután elő tudta állítani az összes nukleinsav alkotó nukleotidot, belevágott a DNS-szintézist katalizáló enzim izolálásába. Ehhez kóli sejtkivonatot, és radioaktívan jelölt nukleotidokat használt. A kivonathoz DNS-t adott, és az újonnan keletkező radioaktív DNS-t keresve igyekezett azonosítani a folyamatot katalizáló enzimet. Végül 1957-ben sikerrel járt, izolálta az elsőként megismert DNS-szintézist katalizáló enzimet, amit DNS-polimeráz I enzimnek nevezett el.

Ezért a sikerért, valamint az in vivo DNS-szintézis kémiai alapjainak feltárásáért 1959-ben orvosi Nobel-díjat kapott Severo Ochoa-val megosztva. (Severo Ochoa egy RNS-szintetizáló enzimet azonosított, nevével még találkozunk a genetikai kód megfejtése kapcsán).

Amint az Arthur Kornberg kísérletei nyomán kiderült, az enzimkatalizált DNS szintézishez az enzimen kívül három alapvető dolog szükséges:

·      Templát DNS szál, aminek a komplementer szála szintetizálódik.

·       Szabad 3’-OH vég, amit a templát szálhoz hibridizált DNS, vagy RNS, a „primer” biztosít.

·       5'-dNTP, vagyis dezoxiribonukleotid-trifoszfátok (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).

A szintézis mechanizmusát a 13.8. ábra mutatja be.

13.8. ábra: A DNS szintézis kémiája

13.8. ábra: A DNS szintézis kémiája

Az új lánc szintéziséhez tehát mindenképpen szükség van egy templát DNS-re. Ennek komoly jelentősége van. DNS nem keletkezik a sejtben monomerek random összeépítésével. Egy ilyen értelmetlen DNS megjelenése jobb esetben felesleges energiapazarlást jelentene, rosszabb esetben komoly zavart okozhatna a sejt működésében. A sejtekben a DNS szintézise szigorúan a már meglévő információ másolására korlátozódik.

A másik érdekes információ a primer igénye. Ez, a részletek ismerete nélkül egy komoly tyúk-tojás problémát sejtet. Ha kell egy primer, akkor azt a primert valaminek, egy polimeráznak elő kell állítania. De hogy állíthatná elő, ha a DNS szintézishez eleve kell, hogy legyen egy primer? A megoldás a részletekben rejlik. Mint később kiderült, a sejtekben primerként egy rövid RNS darab szolgál, amit egy RNS-polimeráz (primáz) készít el. Az RNS-polimerázok nem igényelnek primert az RNS szintézishez. A DNS-polimerázok DNS primert is elfogadnak. Amikor egy DNS szintézise ideiglenesen megszakad, és a DNS-polimeráz leválik, akkor a befejezetlen DNS 3’-OH vége teszi majd lehetővé, hogy egy másik DNS-polimeráz folytassa a szintézist. Ilyenkor tehát DNS a primer.

A dNTP vegyületek mind 5’-nukleozid-trifoszfátok.

A primer 3’-OH végénél az alábbi lépésekben zajlik a beépülés: a dNTP vegyületek közül az enzim random válogat. Amikor olyan dNTP köt a kötőzsebébe, amely komplementer a templát szál soron következő nukleotid egységével, tehát amikor Watson-Crick bázispárosodás jöhet létre a templát és az újonnan beépítendő monomer között, az enzim precízen koordinált Mg2+ ionok segítségével aktiválja (jobb nukleofillá teszi) a primer 3’-OH csoportját, és támadhatóbbá teszi a dNTP α-helyzetű foszforatomját. A primer 3’-OH csoportja ezáltal nukleofil támadást végez a dNTP α-helyzetű foszforatomján. Az α-β foszfátcsoportok közötti foszforsavanhidrid kötés felbomlik, felszabadul egy pirofoszfát, miközben kialakul egy új foszfátészter kötés a primer és a beépülő monomer között. A primer (vagy a DNS-lánc) tehát egy egységgel hosszabb lesz.

A felszabaduló pirofoszfát hidrolízisét a pirofoszfatáz enzim katalizálja, ezáltal válik irreverzibilissé a folyamat. Az új szál tehát szigorú rendben a régi szál komplementereként keletkezik. A szál 5’3’ irányban szintetizálódik, tehát az 5’-vég a „legöregebb”, a 3’-vég a „legfiatalabb”.

Ez a rögzített irány egy különleges topológiai problémát vet fel.

A Cairns-féle autoradiográfiák alapján láthatóvá váló replikációs villák azt mutatták (lásd 13.5. ábra), hogy az antiparallel elrendeződésű szülői DNS mindkét szála mellett, egyidőben zajlik a DNS szintézise. A reakció kémiai mechanizmusa viszont azt mutatja, hogy az mindig 5’→3’ irányban zajlik, más szóval mindig ebben az irányban hosszabbodik a szintetizálódó szál. Hogyan folyhat tehát folytonos láncszintézis az antiparallel szálakból álló replikációs villa mindkét templát szála mellett? A válasz: sehogyan. Pontosabban lesz egy folyamatosan és egy szakaszosan szintetizálódó szál. Ennek megértéséhez nézzük meg, hogyan fedezték fel az ún. Okazaki-fragmentumokat.