13.7. DNS-polimerázok

A most bemutatásra kerülő DNS-polimerázokat szabatosabban DNS-függő DNS-polimerázoknak nevezzük. Ez a kifejezés azt jelenti, hogy az enzim DNS-templát alapján katalizálja a komplementer DNS szál szintézisét. (Mint azt a centrális dogma kapcsán már említettük, és később részletesen is látni fogjuk, léteznek RNS-függő DNS-polimerázok is).

Nézzük meg, hogy általánosságban mi a szerepe egy DNS-polimeráznak, majd ezek után ismerkedünk meg a kólibaktérium két fő DNS-polimeráz enzimével.

A DNS szintézisét katalizáló enzimnek mind a négyféle DNS nukleotidot fel kell ismernie, és valahogyan le kell ellenőriznie, hogy vajon a Watson-Crick bázispárosodásnak eleget tévő nukleotid épül-e be az újonnan szintetizálódó DNS szálba. Az enzimnek részben a bázispárosodás ellenőrzésén keresztül meg kell akadályoznia a nem oda illő monomer beépülését, és elő kell segítenie a megfelelő monomer beépülését.

A bázispárok megfelelőségénél az egyik fontos, de nem elégséges feltétel az, hogy legalább 2 stabil hidrogénhíd alakuljon ki a bázisok között.

A másik kritérium, hogy miközben a beépítésre váró monomer és a templát szálon lévő egység között kialakulnak a hidrogénhidak, a B-DNS szerkezet megőrződjön, ne torzuljon.

A harmadik kritérium az, hogy a kialakuló bázispár beférjen az enzim kötőzsebébe (lásd 13.10. ábra).

13.10. ábra: Csak Watson-Crick bázispárok (bal oldal) alakítanak úgy ki legalább 2 H-hidat, hogy közben elférnek az enzim kötőzsebében

13.10. ábra: Csak Watson-Crick bázispárok (bal oldal) alakítanak úgy ki legalább 2 H-hidat, hogy közben elférnek az enzim kötőzsebében

A 13.10. ábra bal oldalán szerepelnek a korrekt bázispárok. A háttér téglalap illusztrálja sematikusan az enzim kötőzsebének a méretét. Az ábra jobb oldalán három olyan bázispárt mutatunk be, melyeknél ugyan megfelelő számú hidrogénhíd alakulna ki, mégsem épülnek be, mert nem férnének be az enzim kötőhelyére.

Mint már említettük, Arthur Kornberg izolálta az első DNS-polimeráz aktivitással rendelkező fehérjét. Ennek megfelelően az egy alegységes fehérjének a DNS-polimeráz I nevet adta. Kimutatta, hogy az enzim egyszálú DNS templát, primer, és 5’-dNTP jelenlétében katalizálja a templáttal komplementer új DNS szál szintézisét.

A DNS-polimeráz I enzim háromféle aktivitással rendelkezik, melyeket elkülönült domének látnak el. Az egyik a polimeráz aktivitás, amellyel az enzim az új nukleotidok beépítését katalizálja. A másik a 3’5’ exonukleáz aktivitás, ami lehetővé teszi a hibásan beépített nukleotid azonnali eltávolítását (lásd 13.11. ábra).

A 3’→5’ exonukleáz aktivitást hibajavító vagy „korrektor” (proofreading) funkciónak is nevezzük, hiszen ez javítja az „elírást” a DNS szintézise nyomán. Ez a korrektor funkció nagyságrendekkel csökkenti az enzim hibagyakoriságát.

A 13.11. ábra egy olyan esetet mutat be, amikor az enzim azért épít be a polimeráz aktivitásán keresztül egy hibás monomert, mert a monomer bázisa éppen egy ritka tautomer állapotban van, ami a normálistól eltérő hidrogénhidas kapcsolat mintázatot tesz lehetővé. Amennyiben a hibásan beépített monomer bázisa még az előtt visszanyeri stabilabb, normál tautomer állapotát hogy egy újabb monomer beépülne, úgy az enzim korrektor funkciója aktivizálódhat.

A DNS-polimeráz I harmadik aktivitása szintén egy exonukleáz aktivitás, amely azonban eltér a korrektor funkciótól. Ez az 5’3’ exonukleáz aktivitás, ami egyrészt részt vesz egy a replikációtól független, másik típusú hibajavításban, másrészt az RNS primerek eltávolításában játszik szerepet.

Az 5’3’ exonukleáz aktivitást hordozó domén az enzimről eltávolítható. Így jön létre az ún. Klenow fragmentum, amelyet a mai napig előszeretettel használnak különféle in vitro kísérletekben.

13.11. ábra: A DNS-polimeráz I 3’→5’ exonukleáz aktivitása hibajavító (proofreading) aktivitása

13.11. ábra: A DNS-polimeráz I 3’5’ exonukleáz aktivitása hibajavító (proofreading) aktivitása

A DNS-polimeráz I enzim polimeráz és 5’3’ irányú exonukleáz aktivitásának kombinációja egy jellegzetes jelenséget eredményez, aminek angol neve: nick translation, magyarul „bevágás-elmozdulás” vagy nick-transzláció (lásd 13.12. ábra).

13.12. ábra: Az úgynevezett nick-transzláció sémája

13.12. ábra: Az úgynevezett nick-transzláció sémája

Nick”-nek a DNS vonatkozásában azt nevezzük, amikor a kettősszálú DNS egyik szálán az egyik foszfodiészter kötés elhasad, egy bevágás keletkezik, de a két DNS láncot stabilizáló másodlagos kötőerők miatt a két szálvég továbbra is egymás közelében marad.

A DNS-polimeráz I egy olyan DNS-függő DNS-polimeráz, amelynek 5’"3’ exonukleáz aktivitása egyaránt képes DNS, és RNS nukleotidok eltávolítására. Az 5’ végről eltávolított RNS illetve DNS

nukleotidokat az enzim NMP illetve dNMP formájában hasítja le, majd dNTP jelenlétében a polimeráz aktivitás ezeket új DNS nukleotidokkal helyettesíti. Ez a jelenség felelős az RNS primerek eltávolításáért és DNS szakaszra cseréléséért.

Ugyanakkor az is kiderült, hogy a DNS-polimeráz I enzim nem lehet a replikáció fő enzime. Enzimológiai vizsgálatok kimutatták, hogy az enzim ehhez túl lassú, tehát időegység alatt kevés monomer beépítését katalizálja. A DNS-polimeráz I felfedezésekor a kóli genommérete már ismert volt, Cairns kísérlete nyomán kiderült, hogy a replikáció egyetlen pontból kiindulva két irányba halad, és az is ismert volt, hogy a replikáció mintegy 20 perc alatt végbemegy. A DNS-polimeráz I in vitro adatai alapján – hacsak a sejtben valami nem aktiválta volna – a replikáció nem mehetett volna ilyen gyorsan végbe. Ráadásul kiderült, hogy az enzim kis processzivitású is, ami azt jelenti, hogy egy huzamban csak kevés nukleotidot épít be, majd leválik a templátról. A végső bizonyítékot az adta, amikor Cairns 1969-ben izolált egy olyan kóli törzset, amelyben a DNS-polimeráz I polimeráz aktivitása nem volt kimutatható. A sejtben ennek ellenére normálisan zajlott a replikáció.

A DNS-polimeráz I deficiens kóli sejtben az enzim termelődött, csak éppen a polimeráz aktivitása volt egy aminosav csere miatt sérült. Az 5’"3’ exonukleáz aktivitása azonban megmaradt, így az RNS primerek normálisan eltávolításra kerültek, csak éppen a hiányzó DNS darabokat kellett más polimeráznak pótolnia.

Ugyanakkor figyelemreméltó volt, hogy a sejtben magasabb volt a mutációs ráta, különösen akkor, ha UV fénynek tették ki. Mint később kiderült, a DNS-polimeráz I aktivitás fontos az ultraibolya fény miatt kialakuló mutációk javításában.

Amint az 1970-ben kiderült, a replikáció központi enzim-komplexe a DNS-polimeráz III (lásd 13.13. ábra). Tudománytörténeti érdekesség, hogy ezt az enzimet Arthur Kornberg egyik fia, Thomas Kornberg izolálta. Másik fia Roger Kornberg apja nyomdokán haladva szintén Nobel-díjas kutató lett, Ő az RNS-polimeráz működési mechanizmusának feltárásáért kapta a díjat.

13.13. ábra: A DNS-polimeráz III alegységszerkezete

13.13. ábra: A DNS-polimeráz III alegységszerkezete

A DNS-polimeráz III enzim egyes alegységeinek nevét és funkcióját a 13.1. táblázat foglalja össze.

Mint azt a 13.13. ábra illusztrálja a DNS-polimeráz III egy hatalmas fehérje komplex, amelyben több mint 10 különböző alegység működik együtt. Ez az enzim mintegy százszor gyorsabban szintetizál, mint a fő hibajavító enzim, a DNS-polimeráz I. A DNS-polimeráz III beépített hibajavító aktivitással és nagy processzivitással rendelkezik. Mintegy félmillió nukleotidot épít be, mielőtt leválna a DNS-ről (a kóli genom kb. 4,6 millió nukleotid).

A kólibaktériumnak összesen öt DNS-polimeráza van. A többi három, köztük a DNS-polimeráz II különböző hibajavításokban vesz részt.

13.1. táblázat: A DNS-polimeráz III alegységszerkezete

13.1. táblázat: A DNS-polimeráz III alegységszerkezete

A DNS-polimeráz I; II és III tulajdonságait a 13.2. táblázat foglalja össze.

13.2. táblázat: E. coli DNS-polierázok összehasonlítása

13.2. táblázat:E. coliDNS-polierázok összehasonlítása