13.9. A replikáció elongációs fázisa

Az elongáció egyszerűsített sémáját a 13.15. ábra mutatja.

Az elongáció során a két szál közötti Watson-Crick bázispárok megszűntetését és a szálak kinyílását a DNS-helikáz enzim katalizálja, miközben ATP-t bont. Az eközben keletkező szerkezeti feszültséget a DNS topoizomeráz II előzi meg azáltal, hogy negatív szuperhélixeket „pumpál” a még fel nem nyílt szülői DNS-be. Az SSB (Single-Strand Binding protein) fehérje egy egyszálú DNS-t kötő fehérje, amely megakadályozza, a helikáz hatására egyszálúvá vált szülői szálak összezáródását.

A vezető szál egy, még az origónál szintetizált primertől indulva folytonosan szintetizálódik a DNS-polimeráz III által az egyszálú DNS templát mellett. A másik szál mellett Okazaki-fragmentumok szintézise zajlik, amit – bár az egyszerűsített ábra ezt nem mutatja - a dimer polimeráz III enzimkomplex másik fele katalizál. A vezető és követő szálak szintézisének ütemét éppen az teszi egyenlővé, hogy ugyannak a DNS-polimeráz III holoenzimnek eltérő két fele szintetizálja őket.

A DNS-polimeráz III holoenzim szerkezete (lásd 13.13. ábra) a replikációs villánál alakul ki. A replikációhoz ezen az összetett szerkezeten kívül még mintegy húsz egyéb fehérjére, zömükben enzimekre van szükség ahhoz, hogy a replikáció elinduljon, és nagy pontossággal végbemenjen. Ilyen fehérjék a helikázok, egyszálú DNS-t kötő fehérjék, topoizomerázok, primázok, ligázok, és így tovább, amelyek a holoenzimmel együtt a replikaszómát (röviden repliszóma) alkotják.

13.15. ábra: A replikáció elongációs fázisának történései sematikusan

13.15. ábra: A replikáció elongációs fázisának történései sematikusan

A 13.16. ábra mutatja be a DNS-polimeráz III működését. A replikáció folyamatának megértését segíti a 7. animáció is, amelyen egy kóli replikációs villa működésének részleteit látjuk közel valós időben.

Az enzimben a két polimeráz egység azonos irányban áll, párhuzamosak. Az egyik polimeráz egység a vezető szálat készíti, és annak templátját fogadja be. Mivel a másolandó két templát DNS szál egymással antiparallel, ezért a követő szálat készítő polimeráz egységbe a másik templát szálat fordított irányban kell befűzni. A vezető szál templátját praktikusan csak egyszer kell befűzni, a replikáció elején, hiszen az folyamatosan haladhat, és a β-alegységekből álló, gyűrű alakú DNS-kapocs (clamp) úgy működik, mint egy csúszóbilincs, és így hatalmas processzivitást tesz lehetővé . A polimeráz egyhuzamban nagyon hosszú DNS-t tud szintetizálni anélkül, hogy leválna a templátról, mert a bilincs a templáton tartja, anélkül, hogy akadályozná a templát mentén történő elmozdulást.

Amíg a vezető szálat készítő polimeráz egység mindig egy általa még „nem látott” templát szakasz felé halad, addig a követő szálat készítő polimeráz egység újra meg újra egy olyan templát szakasz felé halad, amelyet egy, eggyel korábbi templát befűzésnél már lemásolt. Minden egyes Okazaki-fragmentum befejezésekor, tehát amikor a követő szálat szintetizáló polimeráz egység elérte az általa korábban elkészített Okazaki-fragmentum 5’-végét, a templátot újra be kell fűzni a polimerázba. Ez a DNS-kapocs cseréjét igényli. A polimeráz legösszetettebb funkcionális egysége a DNS-kapocs felhelyező egység (clamp loader), amely elősegíti a régi kapocs leválását, és felszereli az újat. A kapocs felhelyezése ATP-t igényel.

A DNS-polimerázok csak már meglévő 3’-OH véget képesek hosszabbítani (primert igényelnek), és többségük ellenőrzi, hogy a 3’-vég megfelelően bázispárosodik-e. A primáz egy specifikus RNS-polimeráz, ami nem igényel 3’-véget a szintézishez, de nem is biztosítja a másolat nagy hűségét. A primáz készíti el a vezető szál első primerét, illetve az Okazaki-fragmentumok 5’-végére kerülő primereket.

13.16. ábra: A replikáció elongációs fázisának történései részletesebben

13.16. ábra: A replikáció elongációs fázisának történései részletesebben

A primáz által szintetizált, alacsony másolati pontosságú RNS-primer azért nem jelent problémát az új szál minőségét illetően, mert a DNS-től kémiailag eltér. Az RNS-primer nem kerül be véglegesen a DNS szerkezetébe. A primert a DNS-polimeráz I távolítja el hasadás-áthelyezéssel (lásd 13.17. ábra).

13.17. ábra: Az Okazaki fragmentumok RNS részének eltávolítása és a DNS szálak összekapcsolása

13.17. ábra: Az Okazaki fragmentumok RNS részének eltávolítása és a DNS szálak összekapcsolása

A DNS-ligáz enzim felismeri, és összeköti a szabad 3’-OH és a szomszédos 5’-foszfát csoportot amennyiben mindkettő DNS (és nem RNS) része. A nick transzláció egy ilyen, DNS-ligáz által elfogadott részlet kialakulásához vezet. A ligáz reakció energiaigényes, amihez vagy ATP (eukarióták, bakteriofágok) vagyNAD+ hasadása szükséges (lásd 13.18. ábra).

13.18. ábra: A DNS-ligáz enzim működése

13.18. ábra: A DNS-ligáz enzim működése

A reakció nagyenergiájú kötések átalakulásának sorozatán keresztül zajlik. Először az enzim egyik lizin aminocsoportja, majd a DNS 5’-foszfátja aktiválódik, végül a foszforsavanhidrid kötés bomlik.