13.12. DNS hibajavítás

Ebben a fejezetben azt tárgyaljuk meg részletesebben, hogy miként kerülnek hibák, mutációk a DNS-be, és milyen mechanizmusokkal kerülnek ezek kijavításra.

Mielőtt azonban erre rátérnénk, tisztáznunk kell a mutáció pontos definícióját. A mutáció a DNS szerkezetének olyan változása, ami a kódolt genetikai információ maradandó megváltozását okozza. Az információ maradandó megváltozása alatt azt értjük, hogy a mutáció következtében a következő generációban megváltozik az utód DNS-ek szekvenciája. A kódolt genetikai információ alatt tehát nem pusztán az aminosavsorrendre vonatkozó kódolt információt értjük. Ennek értelmében például mutációnak minősül egy olyan báziscsere is, ami maradandóan megváltoztatja a DNS szekvenciáját, de egy adott kodont egy azonos jelentésű másik kodonra változtat, ezért nem okoz változást a kódolt fehérje szekvenciájában. Az ilyen mutációt „csendesmutációnak, angolul same-sense (azonos jelentésű) mutációnak hívják.

Ugyanakkor viszont nem számítanak mutációnak azok a bázismódosítások, amelyek nem érintik a bázispárosodás specifitását. Számos olyan metiláció ismert, amely nem változtatja meg a bázis „párválasztását”. Egy ilyen módosítás esetén a replikációban a metilált bázis és a nem metilált eredeti formája tökéletesen egyenértékű, ugyanaz a komplementer bázis épül be a velük szemben szintetizálódó új szálba. Az ilyen DNS módosítások tehát nem okoznak az DNS szekvenciájában maradandó változást. Ezek a módosítások ugyanakkor fontos szabályozó jelekként működnek a DNS-en, és speciális módon át is kerülhetnek az utódgenerációba, tehát végső soron öröklődhetnek. Ezeket a jeleket epigenetikai jeleknek hívjuk, amelyek epigenetikai módon öröklődhetnek (lásd röviden a 18.3.2.2. fejezetben.).

Mint látni fogjuk, egyes esetekben a metiláció azonban mutációkat okoz. Ebben a könyvben kifejezetten a báziscserés mutációkkal foglalkozunk, nem érintjük a nagyobb DNS régiókat érintő kromoszómatöréseket, inverziókat, áthelyeződéseket stb.

A mutációk közismerten komoly egészségügyi kockázatot jelentenek és az is közismert, hogy összefüggenek a rákos betegségek kialakulásával.

A többsejtűek sejtosztódása rendkívül összetett módon szabályozott folyamat, hiszen a többsejtű szervezet sejtjeinek együtt kell működniük. Az osztódást szabályozó faktorok proto-onkogének és anti-onkogének, más néven tumor-szupresszor gének mutációja elősegíti a rákos sejtátalakulást. A proto-onkogének olyan sejtosztódás szabályozásában résztvevő fehérjék génjei, amely gének mutációja esetén a fehérje aktivitása és/vagy mennyisége megnő, tehát egyfajta funkciónövekedés történik, és ez visz a rákos elváltozás irányába.

A tumor szupresszor gének, vagy más néven anti–onkogének olyan fehérjék génjei, amelyek negatív szabályzóként működnek. Az ilyen gének mutációja akkor sodorja a sejtet a rákos elváltozás irányába, ha az elváltozás a fehérje mennyiségének és / vagy funkcióképességének csökkenésével jár.

A funkcionális csoportosításban van egy harmadik gén típus is, amelynek mutációja különlegesen veszélyes. Számos fehérje fő funkciója a sejtben az, hogy általa a mutációk alacsonyabb frekvenciával jöjjenek létre, vagy ha létrejöttek, nagy arányban javítódjanak ki. Az ilyen fehérjék génjében bekövetkező mutáció egy pozitív visszacsatolást hoz létre. A mutációk elkerülését vagy kijavítását végző mechanizmusok sérülnek, ami miatt a mutációs gyakoriság megnő. Ez megnöveli annak az esélyét, hogy további proto-onkogénekben, anti-onkogénekben és DNS hiba-javításban szereplő génekben is mutációk keletkezzenek. Ez fokozza a rákos elváltozás kialakulásának valószínűségét.

A mutációt indukáló anyagok (mutagének; figyelem, ezek nem gének, hanem olyan vegyületek, amelyek fokozzák a mutációk kialakulásának veszélyét) vagy ionizáló sugárzások a fenti okok miatt növelik meg a rákos betegségek kockázatát. Az ilyen, nyilvánvalóan külső eredetű mutációkat indukált mutációknak nevezzük. Ezek nagy szerepet játszottak a kísérletes genetikai tudományának kialakulásában.

Az indukált mutáción kívül azonban spontán mutációk is bekövetkeznek, amelyeket nemigen lehet elkerülni. Nézzük meg ezek típusait.

Mutációt (nagyon ritkán) okozhat a replikáció során a 3’→5’ exonuleázon alapuló, korrektor típusú hibajavításon is átcsúszó másolási hiba. A replikációt követő spontán (tehát nem kívülről származó mutagén okozta) mutációk négy fő típusa, és kialakulásuk fő mechanizmusa a következő:

·      A bázis oxidatív dezaminálódása

·      A bázis lehasadása az N-glikozidos kötés hidrolízise révén

·      A főleg UV sugárzás hatására kialakuló pirimidin dimerek

·      Bázis alkilálás

Érdemes megjegyezni, hogy az indukált mutációk is ugyanezekkel a mechanizmusokkal következnek be. A mutagén anyagok zöme vagy bázis dezaminálódást, vagy bázis alkilálást (pl. metilálás) okoz.

A mutáció rendkívüli fontossága miatt már igen korán komoly igény támadt egy olyan tesztre, amellyel különböző anyagok mutagén hatását kvantitatívan ellenőrizni lehet. Az első, és a mai napig is alkalmazott egyszerű tesztet Bruce Ames dolgozta ki a hetvenes évek elején.

13.12.1. Az Ames-teszt

Az Ames-tesztben olyan baktérium törzseket alkalmaznak, amelyek hisztidin szintézisben szerepet játszó egyik enzime nem működik. Az enzim azért nem működik, mert az azt kódoló génben van egy tökéletesen ismert típusú hiba. A hiba jellegétől függően különböző törzsek léteznek. Van, amelyikben egy báziscsere miatt funkcióképtelen az enzim, van, amelyikben egy nukleotid egységgel kevesebb van a génben (deléciós mutáns), vagy éppen több (inszerciós mutáns).

Ezek a baktérium törzsek csak olyan táptalajon szaporodnak, amelyben van hisztidin. Az ilyen törzseket, amelyek csak az adott metabolit külső hozzáadása mellett növekszenek, auxotrófnak hívják.

A teszt során az adott törzs sejt-szuszpenzióját agar lemezre kenik szét (lásd 13.22. ábra).

13.22. ábra: Az anyagok mutagén hatását vizsgáló Ames-teszt

13.22. ábra: Az anyagok mutagén hatását vizsgáló Ames-teszt

A sejtek egymástól távol, random helyezkednek el a lemez felszínén. A lemezben bőségesen van tápanyag, de csak nagyon kevés hisztidint tartalmaz, éppen csak annyit, hogy az enzimmel nem rendelkező sejtek kis ideig életben maradjanak.

Amikor több százmillió sejtet kikennek egy ilyen agar lemezre, néhány sejt szaporodóképessé válik, mert a rendelkezésére álló idő alatt spontán módon olyan mutációt szenved, amely működőképessé alakítja vissza a hibás génjét. Ezek a baktériumok teljesen random módon eloszolva jelennek meg a lemezen, és egyfajta negatív kontroll hátteret jelentenek

A kísérlet során egy, a vizsgált anyaggal átitatott korongot helyeznek a táplemez közepére. A korong körül a vegyület koncentrációja egy gradiens mentén sugárirányban csökken. Ha az anyag mutagén, akkor jelenléte megnöveli az adott gén visszamutálódásának gyakoriságát.

Eközben természetesen számos más gén mutációját is lehetővé teszi.

Nagyon magas mutagén koncentráció toxikus a sejtekre, (lásd a koronghoz közeli üres sávot), mert egyszerre átlagosan több mint egy mutáció bekövetkeztét teszi lehetővé. Így azok a sejtek, amelyek hibás enzim-génje kijavítódott, és elvileg szaporodóképessé váltak, több más mutáció miatt elpusztulnak.

Van azonban egy optimális távolság, ahol a mutagén hatás már lényegesen megnöveli a hibás gén kijavítódásának gyakoriságát, de még nem olyan magas, hogy minden sejtnek egyszerre sok génje is mutációt szenvedne. A 13.22. ábra az „a” csésze a negatív kontroll, a „b”, „c” és „d” csészén ugyanaz az anyag szerepel csökkenő koncentrációban. Minél kisebb koncentrációban hatásos a vegyület, annál veszélyesebb mutagén. A rákkeltő anyagok nagy része pozitív az Ames-tesztben.

Egyes anyagok, amelyek a tesztben veszélyesnek mutatkoznak, valójában az emberi szervezet számára nem azok, mert a szervezetbe jutó anyagot a máj kémiailag módosítja, és a módosult anyag már nem mutagén. Ennek a fordítottja is ismert, egyes anyagok a tesztben nem mutagének, de a máj átalakítása során azzá válnak. Ezért az Ames-tesztet kiegészítették egy olyan eljárással, amely során a vizsgált vegyületet egy standardizált májkivonattal előkezelik, és ezek után végzik el vele a tesztet. 

13.12.2. Mutáció típusok

13.12.2.1. Hibás bázispárok

A replikáció mechanizmusánál bemutattuk, hogy a DNS-polimerázok ellenőrzik, hogy a beépítendő monomer megfelelő számú hidrogénhíddal bázispárosodik-e a templáton vele szemben álló monomer egységgel, és azt is ellenőrzik, hogy eközben a B-DNS szerkezet megőrződik-e. A monomert csak akkor építik be, ha mindez teljesül. Ez a fajta ellenőrzés alapvetően kötési energia alapú. A megfelelő monomerrel alkotott komplex szabadentalpia szintje alacsonyabb, mint a nem megfelelő monomerrel alkotott komplexé. A két szabadentalpia szint különbsége a termodinamika törvénye szerint meghatároz egy arányt, egy egyensúlyi állandót. Ez az arány tízezer és százezer között van az egyhez, tehát nagyjából minden tízezer és százezer közötti helyesen beépített monomer után jön egy hibás beépülés. Ez a hiba elkerülhetetlen. Azok a DNS-polimerázok, amelyeknek nincs 3’→5’ exonukleáz aktivitásuk, és ebből következően nem rendelkeznek korrektor típusú hibajavítással, ezzel a 10-4-10-5 közötti hibagyakorisággal működnek.

A korrektor funkcióval rendelkező DNS-polimerázok esetében ugyanakkor nagyjából minden 1 milliárd helyesen beépített monomerre jut egy hibásan beépített, tehát a hibagyakoriság 10-9. A korrektor funkció egy, az előzőekben említett hibaellenőrzéstől független másik ellenőrzés, ami ezek szerint minden tízezer-százezer hibásan beépített monomerből csak egyet hagy meg, a többit kivágja. Ennek a független folyamatnak is megvan a fenti termodinamikai háttere.

A két független ellenőrzés tehát két termodinamika által megszabott folyamat, a kettő eredője elképesztően jó hatásfokkal működik. Ez a hatásfok teszi lehetővé, hogy a genetikai információ szinte tökéletesen változatlan formában adódjon át a következő generációnak.

A termodinamika által diktált hibaarányon kívül azonban van egy kémiai oka is, hogy a másolás nem lehet tökéletes. Mint ismeretes, a DNS-alkotó bázisok különböző tautomer formákban lehetnek jelen. A legstabilabb, ezért legnagyobb arányban előforduló tautomer formák alkotják a Watson-Crick bázispárokat. Amikor a replikáció során a beépítendő monomer bázisa, vagy a soron következő templát egység bázisa éppen egy ritka tautomer formában van, akkor nem azzal a bázissal alkot geometriailag és energetikailag mindenben megfelelő párt, mint amivel a normál formája, hanem egy másik bázissal. Ilyen esetben a polimeráz minden ellenőrző funkcióján átmegy az egyébként hibás, csak az adott a pillanatban éppen tökéletesnek tűnő bázispár. Ha ez a hibás bázispár elegendő ideig stabil marad ahhoz, hogy a polimeráz még egy következő monomer egységet beépítsen, akkor a korrektor funkcióra sincs már lehetőség.

Az ilyen hibát, amikor két normális DNS-alkotó bázis között hibás pár alakul ki, egy komplex hibajavító mechanizmus korrigálja.

13.12.2.2. Bázis dezaminálás

A purin vagy pirimidin vázról lelógó ─NH2 csoportot tartalmazó DNS-alkotó bázisok (tehát a timin kivételével az összes) mind átalakulhatnak oxidatív dezaminációval (lásd 13.23. ábra).

13.23. ábra: Aminocsoportot tartalmazó DNS-bázisok dezaminálódása

13.23. ábra: Aminocsoportot tartalmazó DNS-bázisok dezaminálódása

Az oxidatív dezamináció spontán is végbemegy, de például a salétromossav, és az azt képző nátrium-nitrit és nátrium-nitrát mutagének, mert növelik a dezamináció gyakoriságát. Mivel dezamináció hatására a hidrogénhíd kötésben donor szerepet játszó amin helyett egy akceptor szerepet betöltő karbonil oxigén jelenik meg, a módosult bázis elveszti eredeti bázispár-képző tulajdonságát (lásd 13.23. ábra). Ebből két fontos dolog is következik:

A hibás bázispár a DNS-ben szerkezet-torzulást okoz, amit a hibajavító mechanizmusok képesek detektálni.

A ki nem javított módosult bázis a soron következő replikációs lépésben mutációt okoz, hiszen vele szemben nem az eredeti formájával komplementer bázis, hanem valami más fog beépülni (lásd 13.24. ábra).

13.24. ábra: A dezaminálódás hibás bázispárosodást okoz, javítás híján a replikáció mutáns DNS-t eredményez

13.24. ábra: A dezaminálódás hibás bázispárosodást okoz, javítás híján a replikáció mutáns DNS-t eredményez

A citozin dezaminációja uracilt eredményez. Az uracil a metilcsoport nélkül azonos a timinnel. Bázispárosodás tekintetében megegyezik vele, ezért a transzkripció során a szintén bázispárosodás alapján szintetizálódó RNS-be mindig uracil kerül, amikor a DNS templátban adenin van. Javítás híján ezért a következő replikációs lépésben az eredeti citozin helyén szereplő uracillal szemben adenin épülne be az eredeti guanin helyett, végleg megváltoztatva az utód DNS szekvenciáját. Ez lehet a fő evolúciós előnye annak, hogy a DNS-ben nem uracil van, hanem timin. Ha ugyanis az uracil DNS-alkotó bázis lenne, akkor a citozin dezaminálódása olyan hibás bázispárhoz vezetne, amelyben mindkét bázis normális DNS-alkotó elem lenne. Így nagyobb problémát jelentene annak eldöntése, hogy egy G:U párban melyik bázis a hibás, melyiket kell kicserélni. Ebben az esetben viszont ez nem kérdés, hibás bázispár esetén nyílván a nem DNS-alkotó bázist kell eltávolítani. (Mint azt hamarosan ismertetjük, mind a prokarióta, mind pedig az eukarióta sejtekben külön hibajavító mechanizmus biztosítja a nem DNS-alkotó uracil eltávolítását.)

Azzal, hogy uracil helyett timin van a DNS-ben, a citozin dezaminációból eredő probléma gyakorisága erősen csökkent, de nem szűnt meg. A citozinnak ugyanis van egy természetes módosulata, az 5’-metilcitozin. Ez a módosítás a citozin bázispárosodását nem befolyásolja, ugyanakkor epigenetikai jelként funkcionál. Az 5’-metilcitozin dezaminálódása hibás G:T bázispárt eredményez, amelyben mindkét bázis normális DNS-alkotó. Az ezt felismerő javítómechanizmus a T-t távolítja el, mert egy ilyen hibajavító mechanizmus átlagosan kevesebb hibát követ el, mint egy olyan, ami a G-t cserélné A-ra.

13.12.2.3. Bázis alkilálás

Az O6-metilguanin egy ritka tautomer alak alkilálódásával keletkezik. A fő fiziológiás metilálószer az S-adenozilmetionin koenzim. Amint azt már korábban a replikáció során bekerülő hibáknál említettük, a ritka tautomer alak hibás bázispárt eredményez. A metiláció az O6-metilguanin esetében stabilizálja a guanin ritka tautomer alakját, így az stabilan hibás bázispárosodást okozna, ha nem kerülne kijavításra. Az O6-metilguanin bázispárosodás tekintetében az adeninhez hasonlít (lásd 13.25. ábra).

13.25. ábra: Az O6-metilguanin bázispárosodás tekintetében az adeninhez hasonló

13.25. ábra: Az O6-metilguanin bázispárosodás tekintetében az adeninhez hasonló

A replikáció során a templát szálban lévő O6-metilguanint a polimeráz nem különbözteti meg az adenintől, ezért a komplementer szálba timin épül be, tehát egy báziscserés mutáció keletkezik (lásd 13.26. ábra).

13.26. ábra: Az O6-metilguanin a következő generációban G:C helyett A:T párt, tehát mutációt eredményez

13.26. ábra: Az O6-metilguanin a következő generációban G:C helyett A:T párt, tehát mutációt eredményez

13.12.2.4. Depurinálódás, depirimidinálódás

A dezaminálódás mellett a leggyakoribb DNS-t károsító kémiai reakció a bázist a cukorhoz kapcsoló N-glikozidos kötés spontán hidrolízise (lásd 13.27. ábra).

13.27. ábra: A bázis spontán hidrolízise az egyik leggyakoribb spontán DNS károsodás

13.27. ábra: A bázis spontán hidrolízise az egyik leggyakoribb spontán DNS károsodás

Magas hőmérséklet, alacsony pH kedvez a folyamatnak. Becslések szerint az emberi kromoszómában naponta több ezer ilyen hiba keletkezik, és javítódik ki. (A javítás mechanizmusát lásd később). Ha nem kerülne kijavításra, a replikáció során, amikor a bázishiányos rész templátként funkcionál, a bázis nélküli pozícióval szembe bármi beépülhet, ami 75%-os mutációs valószínűséget jelent.

13.12.2.5. Pirimidin dimerek keletkezése

Ultraibolya fény hatására a láncban egymást követő pirimidin gyűrűk elektronszerkezete úgy gerjesztődhet, hogy közöttük kötésátrendeződéssel kovalens kötések alakulnak ki (lásd 13.28. ábra). A pirimidin dimerek nagymértékű térszerkezeti torzulást hoznak létre a DNS-ben.

13.28. ábra: A pirimidin dimerek kialakulása UV fény hatására

13.28. ábra: A pirimidin dimerek kialakulása UV fény hatására

13.12.3. A fő DNS hibajavító mechanizmusok

A fő hibajavító-mechanizmusokat, az abban szereplő fehérjéket és a javított károsodás típusát a 13.4. táblázat foglalja össze.

13.4. táblázat: DNS hibajavító mechanizmusok

13.4. táblázat: DNS hibajavító mechanizmusok

13.12.3.1. Hibás bázispárosodás kijavítása közvetlenül a replikáció után (mismatch repair)

Amint azt már érintettük, elkerülhetetlen, hogy – ugyan nagyon kis gyakorisággal, de – a replikáció során is bekövetkezzenek hibák. Ezeknek a hibáknak az eredménye egy olyan hibás bázispár, amelynek mindkét tagja normális DNS-alkotó bázis. A hibajavító mechanizmusok közös funkciója az, hogy visszaállítsák az eredeti állapotot. Belátható, hogy koncepcionálisan a legnehezebb feladata akkor van egy ilyen hibajavító rendszernek, ha mindkét bázis normális szereplője a DNS-nek. Ilyenkor antropomorf módon megfogalmazva azt kell eldönteni, hogy melyik bázis volt ott eredetileg, és melyik az, amelyik az eredetivel szemben hibásan épült be. Ez egyben azt is jelenti, hogy a rendszernek azt kell eldöntenie, hogy melyik szál a szülői szál, és melyik az újonnan szintetizált utódszál. A bázist az utódszálon kell ugyanis kicserélni.

A kólibaktériumban egy rendkívül elegáns rendszer látja el ezt a feladatot. A replikációt megelőzően a Dam-metiláz módosítja a két szülői DNS szálat a középpontosan szimmetrikus (palindrom) GATC szekvenciáknál. Az adenin metilálódik olyan módon, hogy az nem érinti a bázispárosodási képességét. Ez tehát az epigenetikai jelek (és öröklődés) egyik szép példája.

A replikáció után egy rövid ideig csak a régi, szülői szál metilált, az újonnan szintetizált utódszál még nem. A replikációt követő pár perc során (nem sokkal a következő replikáció előtt) az új szál is metilálttá válik. A kóli trükkje tehát az, hogy a replikációt követően specifikus szekvenciáknál metilálással megjelöli a DNS-ét (lásd 13.29. ábra).

13.29. ábra: A Dam-metiláz működése

13.29. ábra: A Dam-metiláz működése

Abban a pár perces időszakban, amikor a metilációs jel még csak a szülői szálon van jelen, az újon nincs, a két szál a jel alapján megkülönböztethető. Ez teszi lehetővé, hogy hibás bázispárosodás detektálása esetén a sejt „eldöntse”, melyik bázist kell megőrizni. Az a bázis őrződik meg, amelyik a szülői, metilált szálon van. Nem kis teljesítmény ennek meghatározása, ugyanis a bekövetkezett hiba és a metilálás helye egymástól nagyon messze is lehet. Nézzük meg, hogyan zajlik le ez a folyamat (lásd 13.30. ábra).

A hibás bázispárosodás a B-DNS szerkezet lokális torzulását eredményezi. Ezt a konformációváltozást specifikus fehérjék ismerik fel. Ezek a MutS és MutL fehérjék, amelyek a hibás bázispárt tartalmazó szakaszhoz kötnek. A MutS-MutL komplex a DNS-t egy ATP-t igénylő folyamatban mindkét oldalról húzva mintegy átfűzi magán. A MutH fehérje eközben Dam-metilált szekvenciákat köt. Amikor a MutS-MutL egy ilyen metilcsoporthoz kötött MutH fehérjével találkozik, az átfűzés abbamarad, a MutH és a MutL összekapcsolódnak. Ez a kötődés aktiválja a MutH eladdig gátolt endonukleáz aktivitását, és a MutH enzim elvágja a nem-metilált szálat.

13.30. ábra: A replikáció során keletkezett nem-normális bázispár metiláció-függő javítása

13.30. ábra: A replikáció során keletkezett nem-normális bázispár metiláció-függő javítása

A szülői szál azonosításához használt metiláció akár 1000 bázispárnyi távolságra is lehet a hibás bázispártól. Kísérletek mutatják, hogy amennyiben már mindkét szál metilált, a rendszer csaknem inaktív. Ha egyik szál sem metilált, akkor véletlenszerűen vagy az egyik, vagy a másik bázis őrződik meg a hibás párból, ami 50%-ban mutációt eredményez.

A hibás bázispárnak és a MutH hasításnak egymáshoz viszonyított helyzetétől függően kétféle hibajavítási séma létezik (lásd 13.31. ábra).

Ha a hasadás a hibához képest 5’-irányban van, akkor a hiba visszaemésztésen alapuló eltávolítása 5’→3’ exonukleáz aktivitást igényel. Amennyiben a hasadás a hibához képest 3’ irányban van, akkor a javításhoz 3’→5’ exonukleáz aktivitásra van szükség. A hibás szálat mindkét esetben helikázok „hámozzák le” a templát szálról, az exonukleázok, amelyek egyenként távolítanak el monomereket az egyszálú DNS-ről, ezen a felfejtett DNS-en működnek. Mindkét esetben a DNS-polimeráz III pótolja a hiányzó DNS-t, összhangban azzal, hogy a replikáció során bekövetkező hiba javításáról van szó, amikor is aktív polimeráz III van jelen a sejtben.

Az itt ismertetett hibás bázispárosodás javítási mechanizmust az angol nyelvű szakirodalom „mismatch repair”-nek hívja.

13.31. ábra: A DNS hiba és a metiláció relatív helyzete alapján kétféle metiláció-függő hibajavítási séma létezik

13.31. ábra: A DNS hiba és a metiláció relatív helyzete alapján kétféle metiláció-függő hibajavítási séma létezik

13.12.3.2. Bázis-eltávolító javítás (base-excision repair)

Amikor a DNS-ben egy normálisan elő nem forduló módosult bázis jelenik meg, olyankor nem kérdéses, hogy melyik szál hordozza a helyes információt. Ilyenkor nyilvánvaló, hogy a módosult bázist kell a vele szemben álló normális alapján az eredetire visszacserélni. A bázis-eltávolító javítómechanizmus angol elnevezése: base-excision repair.

A DNS-ben normálisan elő nem forduló bázisokat specializált DNS-glikozilázok ismerik fel, és vágják ki. Tehát minden gyakran előforduló nem-normális bázisra van egy szelektív DNS-glikoziláz enzim, amelynek kötőhelye csak azt a bázist ismeri fel (lásd 13.32. ábra).

A javítás az alábbi lépésekben zajlik: a) A hibás bázis eltávolítása az N-glikozidos kötés szelektív enzimatikus hasításával. Az eredmény egy apurinos, vagy apirimidines, úgynevezett „AP” hely. b) Az AP helyhez közel, attól 5’ irányban egy erre a feladatra specializált AP endonukleáz elhasítja az egyik foszfodiészter kötést, egy „nick” keletkezik a DNS-ben c) A DNS-polimeráz I enzim 5’"3’ exonukleáz valamint polimeráz aktivitásának kombinálásával hasadás áthelyezést (nick translation) végez, és eközben visszaállítja a helyes bázispárosodást. d) Az áthelyeződött hasadást a DNS ligáz szünteti meg.

Vegyük észre, hogy a báziseltávolítás után keletkező AP-hely egy független, enzimkatalízis nélküli folyamatban is kialakul a bázisok N-glikozidos kötésének spontán hidrolízise révén. Valójában ez a leggyakoribb mutáció az emberi szervezetben. A spontán megjelenő AP-helyek javítása a c) és d) pontokban imént leírtak szerint megy végbe.

13.32. ábra: A bázis-eltávolító hibajavítás

13.32. ábra: A bázis-eltávolító hibajavítás

13.12.3.3. Nukleotid-eltávolító javítás

A fent bemutatott bázis-kivágó javítás második szakaszában a hiba környékén a DNS szál megemésztődött, és a szemközti komplementer szál, mint templát alapján újraszintetizálódott.

Vannak olyan DNS sérülések, melyeket nem lehet báziskivágáson keresztül kijavítani. Ilyenkor a hiba környékén lévő láncot kell kivágni. Ez a nukleotid-eltávolító hibajavítás (nucleotide-excision repair). Ilyenkor a torzulás detektálása után a hiba környéki szálat egy sok-alegységes, specifikus enzimrendszer vágja el a sérülés mindkét oldalán. Kóli-ban ilyen az Uvr A, B, C tagokból álló, ABC-excinukleáz komplex (lásd 13.33. ábra).

Az excinukleáznak azonosítania kell, hogy melyik szálon van a pirimidin dimer, és azt a szálat kell elvágnia a hiba két oldalán. Ezután a hibát tartalmazó szakaszt helikáz „hámozza le”, a hiányzó részt pedig DNS-polimeráz I pótolja, a szálakat ligáz kapcsolja össze.

13.33. ábra: Nukleotid-eltávolító hibajavítás kólibaktériumban és emberben

13.33. ábra: Nukleotid-eltávolító hibajavítás kólibaktériumban és emberben

13.12.3. 4. Közvetlen bázisjavítás

Az eddig bemutatott esetekben a hibajavító rendszer a hiba felismerése után annak környékével együtt eltávolította a hibás DNS szakaszt, majd kijavított változatban újra szintetizálta azt. Bizonyos bázissérülések azonban javíthatók a bázis eltávolítása nélkül is. Ezt közvetlen hibajavításnak (direct repair) hívjuk.

Ilyenkor egy enzimatikus folyamat keretében közvetlenül maga a bázis javítódik ki. A módosításhoz vezető kémiai reakcióval ellentétes irányú folyamat révén újra kialakul az eredeti bázis.

Az egyik ilyen hibajavító mechanizmus-csoport a mutációt okozó alkilálást, a példában bemutatott enzim a guanozin metiláltságát szünteti meg. Az enzim általánosan elterjedt az élővilágban (lásd 13.34. ábra).

13.34. ábra: A guanin metiláltságát megszüntető közvetlen bázisjavítás

13.34. ábra: A guanin metiláltságát megszüntető közvetlen bázisjavítás

A metilált enzim serkenti saját génjének expresszióját, vagyis metiláló mutagének jelenlétében a hibajavító mechanizmus hatékonysága megnövekszik. A példában szereplő metil transzferáz egy „önfeláldozó” enzim, ugyanis miután a metil-csoportot saját ciszteinére helyezve eltávolította a DNS-ről, inaktívvá válik. Ez tehát egy meglehetősen költséges módja a javításnak, hiszen egy teljes enzimmolekulát fel kell áldozni, amelynek létrehozása nagyon sok energiát igényelt. Az evolúció során mégis kialakult, és mivel előnyt biztosított, fennmaradt ez a módszer is. Ez is jelzi, milyen fontos a sejt számára a hibák kijavítása.

A pirimidin-dimerek javításának is van egy közvetlen módja, ami általánosan elterjed (lásd 13.35. ábra).

A 200-300 nm-es ultraibolya fény hatására létrejövő pirimidin dimereket egy olyan enzimatikus apparátus javítja ki, amely 300-500 nm-es (tehát látható) hullámhossz tartományban aktiválódik.

A reakciót katalizáló enzim a DNS-fotoliáz, ami egy, az adott látható hullámhossz tartományban gerjeszthető koenzimmel működik. Ilyen koenzim pl. az MTHF-poli-Glu (MetenilTetraHidroFolsav származék). A gerjesztett koenzim átadja energiáját a fotoliáz enzim kovalensen kötött FADH koenzimének, ami ideiglenesen átad egy elektront a pirimidin-dimernek. Ez az elektron destabilizálja a pirimidin-dimert, ami az elektron visszaadása közben az eredeti pirimidin bázisokra bomlik. Emiatt a rendszer miatt javasolják az UV lámpázás utáni erős, látható fénnyel történő fényfürdőzést.A legújabb ismeretek szerint ugyanakkor a méhlepényes emlősökben, köztük az emberben nem működik fotoliáz-alapú hibajavítás. Ezekben az élőlényekben ezek a hibákat kizárólag a nukleotid-eltávolító mechanizmussal javítódnak. Fotoliázzal rokon fehérjék a méhlepényes emlősökben is vannak, de ezek feltehetően a napszakos ciklus szabályozásában játszanak szerepet.

A fentiekben megtárgyaltuk a centrális dogma első információ-áramlási útvonalának, a replikációnak a mechanizmusát. Ennek a folyamatnak a során az információ generációról generációra adódik át, ezért a másolásnak rendkívül pontosnak kell lennie. A már elkészült DNS-t is folyamatosan karban kell tartani, hogy az eredeti bázissorrend fennmaradjon.

A következő fejezetben a centrális dogma egy másik információ-áramlási útvonalára térünk át, a transzkripcióra.

13.35. ábra A pirimidin dimerek megszüntetése közvetlen bázisjavítással

13.35. ábra A pirimidin dimerek megszüntetése közvetlen bázisjavítással