14.2. A prokarióta RNS-polimeráz, a prokarióta transzkripció iniciációs fázisa

A prokarióta RNS-polimeráz alegység-összetételét a 14.1. táblázat, sematikus felépítését pedig a 14.2. ábra mutatja.

14.1. táblázat: A prokarióta RNS-polimeráz összetétele

14.1. táblázat: A prokarióta RNS-polimeráz összetétele

14.2. ábra: A prokarióta RNS-polimeráz sematikus felépítése

14.2. ábra: A prokarióta RNS-polimeráz sematikus felépítése

A prokarióta RNS-polimeráz egy hat alegységes fehérje. Az α2ββ’ωσ felépítésű enzimben a két α alegység a DNS-hez kötődik, a ββ’ alegységek együttesen alkotják az enzim aktív „magját”, az ω alegység szerepe pedig egyelőre nem tisztázott.

A hat alegység közül a σ kivételt képez abban az értelemben, hogy σ alegységéből kólibaktériumban 7-féle is létezik. Egy RNS-polimeráz molekula ezek közül egyszerre mindig csak egyet köt. A σ (szigma) alegységet más néven σ-faktornak is nevezik. Kiderült, hogy az RNS-polimeráz elsősorban a σ-faktor által ismeri fel a DNS-nek azt a szakaszát, a promótert, ahova az RNS szintézis megkezdéséhez kötődnie kell. Úgy is mondhatjuk, hogy a σ alegység az RNS-polimeráz „szeme”.

Az RNS szintézis kezdőpontját a DNS-en tehát a promóter jelöli ki. A promóter felismerésének az alapja egy olyan kölcsönhatás, amelyben egy fehérje (az RNS-polimeráz σ alegysége) a DNS szekvenciája alapján kötődik a DNS-hez.

A promóter egy aszimmetrikus (nem palindrom), duplaszálú DNS szakasz. Mivel aszimmetrikus, az RNS-polimeráz csak egy adott irányban képes hozzákötődni, tehát a promóter mintegy irányba állítja az enzimet. A polimeráz kötőhelyeként a promóter így nemcsak az RNS-lánc szintézisének kezdőpontját jelöli ki, de egyben megszabja a lánc szintézisének az irányát is, kijelölve azt is, hogy melyik DNS szál szolgál majd templát gyanánt a transzkripció során.

Vajon miért van ilyen sokféle σ-faktor a kólibaktériumban? Mint kiderült, az egyes eltérő σ-faktorok eltérő promóter-típusokhoz képesek kötődni (specificitási faktoroknak is hívják őket), és eltérő környezeti hatásokra termelődnek. Az eltérő élethelyzetekben termelődő σ-faktorok olyan gének transzkripcióját segítik elő, amely gének termékére éppen abban az élethelyzetben van szükség. Ezeknek a géneknek természetesen az adott σ-faktorral kompatibilis promóterük van.

A promóterek és σ-faktorok ilyen kölcsönös megfeleltetése egy elegáns alapszabályozást tesz lehetővé. Többek között ennek köszönhető, hogy nem íródik át egyszerre az összes gén, mindig csak azokról a génekről keletkezik RNS átirat, amelyekre éppen szükség van.

Az egyes σ-faktorok elnevezése a fehérje méretére utal. A legtöbb gén promótere olyan, amit a 70 kDa molekulatömegű σ70 szigma faktor ismer fel. Ezeket a géneket funkcionálisan az köti össze, hogy tipikusan akkor van szükség az általuk kódolt fehérjére, amikor a baktérium körülményei optimálisak. Ezeket a géneket a használati jellegük miatt „háztartási” (housekeeping) géneknek is nevezik.

Más σ faktorok például éhezés, túl magas hőmérséklet, vagy nitrogénhiányos környezet esetén termelődnek, és a σ70 faktorral versengve az RNS-polimerázért olyan gének átírását indítják el, amelyek az adott stressz-helyzetben hasznosak. A σ32 faktor például magas hőmérséklet esetén termelődik, és többek között a denaturált fehérjék feltekeredést segítő dajkafehérjék génjeinek átírását teszi lehetővé.

A σ faktorok természetesen csak egy elemi szintű szabályozást jelentenek, a gének jó része ezen felül egyéb, specifikusabb módon is szabályozódik (lásd 18.2. fejezet).

Az egyéb szabályozásoktól egyelőre eltekintve a promóter és a megfelelő σ alegységgel ellátott RNS-polimeráz kölcsönhatása szabja meg a génátíródás általános intenzitását. Ennek kapcsán beszélünk erős és gyenge promóterekről.

A promóterek pozícióit sorszámmal látják el. A +1 pozíció az első RNS nukleotid beépítési helyét jelzi. Ettől a ponttól számítva a láncépítéssel, mint az információ folyásával megegyező irány, a „downstream” irány, míg az azzal ellentétes irány az „upstream” irány, mely utóbbi esetében az egyes pozíciók sorszámát negatív előjellel látják el. (Nulladik pozíciót tehát nem definiáltak).

Amikor olyan gének szekvenciáját hasonlították össze, amelyek átírását a σ70 faktorral ellátott RNS-polimeráz végzi, érdekes jellegzetességeket tártak fel (lásd 14.3. ábra).

14.3. ábra: Aσ70faktorral ellátott RNS-polimeráz által felismert kóli promóterek sávos szerkezete

14.3. ábra: A σ70 faktorral ellátott RNS-polimeráz által felismert kóli promóterek sávos szerkezete

Színekkel kiemelve jól érzékeltethető, hogy az ilyen gének promóterei „sávos” szerkezetűek.

A +1 pozíciónak megfelelően egymás alá rendezett egyedi szekvenciák megmutatták, hogy a -10. nukleotid környéke (-10-es promóter régió), más néven Pribnow-box), valamint a -35. nukleotid környéke (-35-ös promóter régió) nagyon hasonló minden olyan génnél, amelynek a promóterét a σ70 faktorral ellátott RNS-polimeráz ismeri fel.

A nagyon intenzíven átíródó gének esetén ezeken felül találtak még egy jellemző régiót, ami még „feljebb” található upstream (5’) irányban (UP promóter elem).

Ha egy adott szekvencia család esetében minden pozícióban felírjuk az adott családban az adott pozícióban leggyakrabban előforduló elemet, akkor megkapjuk a családra jellemző „konszenzus szekvenciát”. (Maga a konszenzus szekvencia nem feltétlenül jelenik meg egy adott konkrét családtagban.)

A promóterekkel kapcsolatos megfigyelés, hogy minél jobban hasonlít egy konkrét promóter szekvenciája a konszenzus szekvenciához, annál erősebb a promóter. A 14.3. ábrán szereplő egyik promóter például egy riboszómális RNS (rRNS) gén promótere. Az ilyen promóterek nagyon erős promóterek, és mint látható, az adott promóter szekvenciája valóban nagyon hasonlít a konszenzus szekvenciához.

A 14.4. ábra azt is bemutatja, hogy mi magyarázza a promóter szekvencia sávos szerkezetét.

Ahogyan azt a 14.4. ábra illusztrálja, a -10-es és a -35-ös régiók a σ70 faktor egyes részeivel lépnek kölcsönhatásban, míg az „UP” régió az a alegységekhez kötődik.

14.4. ábra: A prokarióta transzkripció iniciációs szakasza

14.4. ábra: A prokarióta transzkripció iniciációs szakasza

De vajon hogyan lehetett meghatározni, hogy a promóternek mely részei kerülnek felismerésre az RNS-polimeráz által?

Ezt a „footprinting” („lábnyom analízis”) eljárás segítségével lehetett kideríteni az alábbiak szerint (lásd 14.5. ábra).

A footprinting eljárás általános megközelítés szekvencia-specifikus DNS-kötő (vagy RNS-kötő) fehérjék kötőhelyének feltérképezésére. Az eljárás azon alapul, hogy a fehérje megvédi a hasadástól a nukleinsavon azt a részt, amit a kötődése révén letakar. A kísérletben egy homogén DNS oldattal indulunk, amely tehát egymással azonos szekvenciájú DNS darabokat tartalmaz. Ezek egyik végükön radioaktív jelet tartalmaznak.

14.5. ábra: A „footprinting” eljárással azonosítható, hogy a nukleinsav mely részéhez kötődnek a szekvencia-specifikus nukleinsav-kötő fehérjék

14.5. ábra: A „footprinting” eljárással azonosítható, hogy a nukleinsav mely részéhez kötődnek a szekvencia-specifikus nukleinsav-kötő fehérjék

Az oldatot kettéosztjuk, az egyik fél a kezeletlen (-) kontroll lesz. A másikhoz DNS-kötő fehérjét keverünk. Ezután mindkét oldatot DNáz I enzimmel kezeljük. A DNáz-I enzim nagyjából véletlenszerűen, ezért egyenletes eloszlásban hasítja be az egyes DNS-eket.

A DNáz enzim / DNS arányt úgy állítjuk be, hogy DNS molekulánként átlagosan egyetlen hasadás történjen. A kezelés után a DNS darabokat izoláljuk, és denaturáljuk (a két szálat elválasztjuk egymástól). A mintát méret szerint elválasztjuk poliakrilamid gélelektroforézissel.

Csak a radioaktívan jelölt DNS-fragmentumokat detektáljuk. A kezelt mintából hiányzó csíkok azt a DNS szakaszt jelzik, amit a DNS-kötő fehérje letakart a DNáz-I-es emésztés alatt. A letakart szakasz mérete a gélelektroforézis alapján meghatározható.

Az RNS-polimeráz esetében a footprinting vizsgálat megállapította, hogy az enzim által lefedett két régió: a -10 és a -35 szakasz (amiket a σ70 alegység ismer fel), valamint az a alegységgel lefedett rész.

Ezek után tekintsük át az iniciáció fázisának történéseit. Az iniciáció maga is két fázisra bontható. Az egyik egy kétfázisú kötődés, a másik az elongáció megkezdéséhez szükséges konformációváltozás.

Első lépésben a σ-faktorral felszerelkezett RNS-polimeráz kötődik a σ-faktor típusának megfelelő promóterhez. A kötődés első terméke egy RNS-polimeráz – zárt DNS komplex. Ebben a komplexben a DNS két szála még nem válik el egymástól. Némi idő elteltével a kötődés hatására a DNS két lánca elválik, kialakul egy RNS-polimeráz – nyitott DNS komplex. Ebben a komplexben a DNS a promóter -10 régiójában nyílik fel, a felnyílás eléri a +3-as pozíciót, összesen mintegy 15 bázispár hosszan nyílik szét a DNS. A nyitott komplexben a templát szál hozzáférhetővé válik a komplementer RNS szál szintézise számára.

A szorosabb értelemben vett iniciációs fázis is (legalább) két lépésből áll. A polimeráz konformációváltozáson megy át, a DNS jellegzetesen megtörik, a polimeráz beépíti az első néhány nukleotidot.

A második fázisban a polimeráz a szintézis folytatásával elhagyja a promóter területét, a σ-faktor leválik, ezzel az elongációs fázis elkezdődhet.