14.6. Az eukarióta RNS-polimeráz II működése

Az eukarióta polimeráz II enzim szerkezetének és működésének feltárása legnagyobbrészt Roger Kornberg nevéhez fűződik. Roger Kornberg, Arthur Kornberg fia az eukarióta transzkripció mechanizmusának, a benne szereplő fehérjék, többek között a Mediátor komplex (lásd később) működésének feltárásáért 2006-ban kémiai Nobel-díjat kapott.

14.6.1. Az eukarióta RNS-polimeráz II és a preiniciációs komplex

Az eukarióták esetében a transzkripció kezdőpontjának környékén található szekvenciák analízise alapján csak két majdnem mindig jelen lévő elemet lehet kiemelni: a lánckezdés körüli néhány nukleotidnyi iniciációs régiót (Inr) és az attól „upstream” irányban -30 körüli TATA-box területet. A TATA-box elnevezés ennek a területnek a konszenzus szekvenciája (TATAAA) alapján történt. Valójában még ez a TATA-box sincs meg minden RNS-polimeráz II által átírt gén elején.

A 14.3. táblázat foglalja össze az eukarióta RNS-polimeráz II enzim, valamint a preiniciációs komplex összetételét.

14.3. táblázat: Az eukarióta RNS-polimeráz II enzim és a preiniciációs komplex összetétele

14.3. táblázat: Az eukarióta RNS-polimeráz II enzim és a preiniciációs komplex összetétele

A preiniciációs komplexben résztvevő komponensek szerepének feltárását bonyolítja, hogy az in vitro és az in vivo kísérletek eredményei nincsenek mindig egymással összhangban.

In vitro kimutatható volt, hogy mi elegendő egy alap transzkripciós aktivitás eléréséhez, és az is kiderült, hogy az egyes fehérje komponenseket milyen sorrendben kell az oldatba vinni, hogy összeálljon a preiniciációs komplex. Ugyanakkor az in vivo összeszerelődés nem feltétlenül ezt a sorrendet követi, és in vivo gyakran olyan komponensek is elengedhetetlennek mutatkoztak, amelyek in vitro nem kellenek.

Nézzük meg ezek alapján, hogy a mai ismeretek szerint hogyan szerelődik össze az eukarióta RNS-polimeráz II enzimet tartalmazó preiniciációs komplex in vitro illetve in vivo (lásd 14.12. ábra).

14.12. ábra: Az eukarióta transzkripció preiniciációs komplexének összeszerelődése

14.12. ábra: Az eukarióta transzkripció preiniciációs komplexének összeszerelődése

In vitro, és olyan DNS esetében, amelyen van TATA box, először a TBP (TATA-binding protein) kötődik. Ez a fehérje a kis árkon keresztül köti a DNS-t, és jelentős mértékben meghajlítja azt.

In vivo a TBP nem önmagában, hanem komplexben található a hozzá kötődő fehérjékkel (TBP Associated Factors, TAFs) együtt. Az in vivo komplex neve TFIID, amely tehát a TBP fehérjéit és a TAF fehérjéket tartalmazza. A TFIID a legnagyobb méretű általános transzkripciós faktor. In vivo adatok alapján először a TFIID (melynek egyik alegysége a TBP) kötődik a promóterhez a TFIIA fehérjével együtt. Ezek jelenléte különösen azoknál a promótereknél fontos, amelyek nem tartalmaznak TATA-box szakaszt. Ilyenkor a TATA-box DNS részét egyes TAF fehérjék helyettesítik. A TFIIA a TBP-hez kötődve erősíti a TBP TATA-box kötését. A TFIIA egyik in vivo szerepe az lehet, hogy megakadályozza egyes gátló fehérjék TBP-kötését. In vitro vizsgálatokban ez utóbbi funkció nem kell, ezért in vitro a TFIIA nem esszenciális.

A TBP (vagy TFIID és TFIIA) után a TFIIB kötődik. A TFIIB fő szerepe az, hogy szekvenciaspecifikus DNS felismerés révén megkeresse a transzkripció kezdőpontját a DNS-en. A TFIIB szerepe analóg a prokarióta RNS-polimeráz σ-alegységével.

Az eddig összeszerelődött komplex részben a TFIIB révén irányítja a polimerázt megfelelő orientációban a DNS-hez. Az RNS-polimeráz II a TFIIF általános transzkripciós faktorral komplexben érkezik. A TFIIF erősen köti az RNS-polimerázt, és gátolja annak nem-specifikus DNS-kötését.

A legtöbb gén átírásához két további általános transzkripciós faktor jelenléte szükséges.

Ezek közül először a TFIIE kötődik, amely megteremti a TFIIH számára a kötőhelyet. A TFIIH helikáz és kináz aktivitással is rendelkezik. Egyrészt ATP bontása révén széttekeri a DNS két szálát a start hely környékén, másrészt protein-kináz aktivitásával specifikusan foszforilálja az RNS-polimeráz II C-terminális doménjét (CTD). A CTD foszforilálása elengedhetetlen a transzkripció elindulásához.

Az RNS-polimeráz ebben a preiniciációs komplexben, kis aktivitással ugyan, de már el tudja kezdeni az RNS szintézist. Miközben elindul a DNS-en, a CTD részére a TFIIH egyre több foszfátcsoportot kapcsol. A preiniciációs komplex szétesik, a polimeráz az elongációs fázisba léphet.

A hatékony transzkripcióhoz a preiniciációs komplexet aktiválni kell (lásd 14.13. ábra).

14.13. ábra: Az eukarióta preiniciációs komplex aktiválásának leegyszerűsített modellje

14.13. ábra: Az eukarióta preiniciációs komplex aktiválásának leegyszerűsített modellje

A promóteren kívül, attól akár hatalmas távolságban jelen lehetnek enhanszer (enhancer) DNS szekvenciák (élesztőben UAS: upstream activating sequence), amelyekhez specifikus transzkripciós aktivátor fehérjék kötődnek és a Mediátor komplexen keresztül aktiválják a transzkripciót. Miközben fehérje-fehérje kölcsönhatásokon keresztül az enhanszer fizikai közelségbe kerül a promóterrel, a köztük levő DNS szakasz hurkot kell, hogy képezzen. Ezt speciális DNS hajlító HMG fehérjék (HMG: high mobility group) segítik.

A legalább 31 alegységből álló Mediátor-komplex (tömege >1000 kDa) egyfajta integrációs központnak tekinthető. Ez a komplex fogadja és integrálja a preiniciációs komplex számára a negatív és pozitív jeleket.

A gén átírásának intenzitása végső soron ezeknek a kapcsolatoknak az integrált eredményén múlik. A Mediátor-komplexen keresztül kommunikáló transzkripciós aktivátorokon kívül az eukarióta DNS magasabbrendű szerkezetét is módosítani kell. A nukleoszómás szerkezetet ugyanis fel kell lazítani. Erre szolgálnak a hiszton módosító és remodelling enzimek (további részleteket lásd a 18.3. fejezetben).

Az eukarióta RNS-polimeráz I és -III enzimek preiniciációs komplexének kialakulása az RNS-polimeráz II esetében látottakhoz hasonlóan zajlik, de az egyes polimerázok esetében a komplexeket eltérő fehérjék alkotják.

Érdemes megjegyezni, hogy amint az RNS-polimeráz II létrehozta az RNS 5’-végét, elkezdődik az eukarióta mRNS-ekre jellemző „sapka” szintézise (lásd később). Amikor pedig a polimeráz CTD része foszforilálódik, akkor ide kötődnek azok a fehérjék, melyek az érett mRNS poliA végének kialakulásában vesznek részt.

Az eukarióta RNS-polimerázok is rendkívül nagy processzivitású enzimek, az elongációs fázis ezért ezek esetében is kevéssé szabályozott. Az eukarióta transzkripció terminációjának szabályozása egyelőre kevésbé ismert, mint a prokariótáké. A jelek szerint az RNS-polimeráz II esetében a folyamatban részt vesz az a komplex, amely az érett mRNS-ek poliA végét készíti el (lásd az eukarióta elsődleges átirat processzálásánál).

Az eukarióta preiniciációs komplex kialakulását és az RNS-polimeráz működését közel valós időben a 8. animáció mutatja be.

Érdekességként megjegyezzük, hogy a legújabb ismeretek arra utalnak, hogy az eukarióta RNS-polimeráz II esetében működik egy, a DNS-polimerázok 3’→5’ korrektor funkciójával analóg hibajavítás. Ennek hatékonysága messze elmarad a DNS-polimerázokétól, és mechanizmusának részletei sem ismertek.