14.9. Splicing mechanizmusok

Mint kiderült, az evolúció során 3 fő intron-eltávolítási mechanizmus alakult ki. Ennek megfelelően 3 intron csoportot különítenek el.

14.9.1. Az I. és II. csoport, az önhasító intronok (self-splicing)

Az I. és II. típust az önmagukat eltávolító (self-splicing) intronok jelentik. Tehát ezekben az esetekben olyan RNS molekulákról van szó, amelyek kivágják saját magukat egy nagyobb RNS molekulából. Ezek az RNS-ek kémiai folyamatokat katalizálnak, tehát ribozimek, azaz RNS enzimek! Az önmagukat kivágó intronok példáján keresztül fedezte fel a világon először Thomas Cech 1982-ben, hogy RNS molekulák is lehetnek enzimek.

Thomas Cech az eukarióta csillós egysejtű, a Tetrahymena transzkripcióját vizsgálta. Nagy meglepetésére a 26S riboszómális RNS képes volt processzálódni minden egyéb fehérje, vagy más makromolekula komponens közreműködése nélkül. A kulcs kísérlet az volt, amikor a Tetrahymena 26S rRNS gén kérdéses szakaszát kódoló DNS-t kóli RNS-polimeráz segítségével in vitro írta át, majd a mintát fehérje mentesítette. A kérdéses RNS ebben az esetben is processzálódott. Thomas Cech 1989-ben Sidney Altmannal megosztva kémiai Nobel-díjat kapott. Mint később látni fogjuk, Sidney Altman 1983-ban szintén egy ribozimet fedezett fel a tRNS-eket processzáló RN-áz-P enzim keretében.

Az I. és II. csoport ritka, de evolúciós szempontból létük óriási jelentőségű, mert arra utal, hogy lehetett valaha egy RNS-alapú élővilág (RNA world), amelyben RNS-ek végezhették az információtárolást, és a katalízist is. Ma ezeket az alapfunkciókat két eltérő makromolekula csoport, a DNS és a fehérjék végzik.

A Thomas Cech által felfedezett önmagát kivágó intron az I-es csoportba tartozott. Ezek az intronok kofaktorként egy guanozin nukleotidot használnak a foszfodiészter kötés támadására. A stabil térszerkezetű intron egy specifikus kötőhellyel rendelkezik a nukleotid számára, a katalitikus helye pedig aktiválja a nukleotid 3’-OH csoportját, jobb nukleofil támadóvá téve azt.

Ez a nukleotid kofaktor foszfátészter-kötés csere keretében felbontja az 5’-exon és az intron közötti észterkötést. Ezt követően az intron aktiválja az 5’-exon felszabaduló 3’-OH csoportját, amely így nukleofil támadást intéz az intron és a 3’-exon közötti kötésen. Egy újabb foszfátészter csere következtében a két exon között foszfodiészter kötés alakul ki, miközben az intron felszabadul.

A II. csoportot szintén önmagukat kivágó intronok képezik. Ezek a működési mechanizmus tekintetében annyiban különböznek az I. csoporttól, hogy itt nincs szükség külső nukleotid kofaktorra. Az intron által aktivált hidroxilcsoportot az intron egyik meghatározott pozícióban lévő adenozin egységének 2’-OH csoportja szolgáltatja.

A lépések az előzőek szerint zajlanak, de mivel egy, a láncba beépült, és ott is maradó adenozinon keresztül hasad el az 5’-exon és az intron közötti kötés, az új foszfátészter kötés kialakulásakor ez az adenozin mindhárom hidroxilcsoportján keresztül észterkötésben lesz, és egy lasszószerű képződmény (splicing lariat) alakul ki. A reakció második lépése a már említettek szerint zajlik. A reakció mindkét intron csoport esetében két olyan lépésén keresztül zajlik, melyek során azonos szabadentalpia szintű foszfátészter-kötések alakulnak ki és szűnnek meg (transzészteráz aktivitás), ezért a splicing nem igényel energiát.

14.9.2. A III. csoport és a spliceoszómák

A III. csoportot olyan intronok képviselik, amelyek kivágódása a II. csoportnál látott, belső adenozinon és lasszóképzésen keresztüli sémát követi, de ezek az intronok nem rendelkeznek semmilyen katalitikus aktivitással. A III. típusú intronokat arra szakosodott, RNS és fehérje molekulákból kialakuló ribonukleoprotein komplexek, a spliceoszómák (kiejtve szplájszoszómák) vágják ki (lásd 14.18. ábra).

14.18. ábra: A három eltérő splicing mechanizmus

14.18. ábra: A három eltérő splicing mechanizmus

A spliceoszóma RNS és fehérjék szupramolekuláris komplexe, akárcsak a riboszóma. Míg a saját magukat kivágó intronok a mai élőlényekben ritkaságnak számítanak, a III. típusú intronok hatalmas arányban terjedhettek el, valószínűleg annak köszönhetően, hogy az evolúció során kialakult egy, az introntól elkülönült, intronkivágó egység. Ennek létrejöttével az intronok szekvenciájával kapcsolatban csak az a követelmény maradt meg, hogy abban a spliceoszóma felismerjen bizonyos szekvencia elemeket, amik alapján el tudja végezni az intron kivágását. Ezek a fontos szekvencia elemek az intron két oldalán, tehát a két intron exon határnál, valamint a lasszó szerkezetben az elágazási pontot jelentő adenozin környékén vannak (lásd 14.18. ábra).

A sejtmagban keletkező érett mRNS-ek szinte mindegyike a spliceoszóma segítségével alakul ki. A spliceoszóma öt darab kisméretű ribonukleinsav fehérjékkel alkotott komplexe, másik neve snRNP (small ribonucleoprotein particle). Maga a spliceoszóma az intron köré szerveződve áll össze. A hasítások az önhasító intronokhoz hasonlóan itt sem energiaigényesek, de a spliceoszóma összeszerelődése igen.

A lasszó elágazó szakaszának szerkezetét a 14.19. ábra mutatja.

14.19. ábra: A III. típusú intron jellegzetes szekvencia elemei

14.19. ábra: A III. típusú intron jellegzetes szekvencia elemei

A reakciót kicsit részletesebben, az egyes kémiai lépések sorrendjét is bemutatva a 14.20. ábra szemlélteti, amely jelzi az elágazási hely körüli szekvencia jellegzetességeket is, míg a lasszó szerkezetét a 14.21. ábra mutatja be: Végül a spliceoszóma által katalizált reakció modelljét a 14.22. ábra illusztrálja.

14.20. ábra: A III. típusú intron kivágása, a lasszóképzés

14.20. ábra: A III. típusú intron kivágása, a lasszóképzés

14.21. ábra: A lasszó kémiai szerkezete

14.21. ábra: A lasszó kémiai szerkezete

14.22. ábra: A III. típusú intronok spliceoszóma alapú eltávolításának lépései

14.22. ábra: A III. típusú intronok spliceoszóma alapú eltávolításának lépései