15.2.  A genetikai kód feltöréséhez vezető kísérletek

Az előzetes ismeretek, és a kódolási eljárásokkal kapcsolatos, elméletileg megalapozott feltételezések nyomán megindulhattak a kód feltöréséhez vezető konkrét kísérletek. Az alábbiakban ezeket vesszük sorra.

15.2.1. Az első tripletek jelentésének feltárása mesterséges homopolimer RNS-ekkel

Az első áttörést 1961-ben Marshall Nirenberg és Heinrich Matthaei érték el in vitro előállított homopolimer RNS, mint mesterséges mRNS segítségével. A kísérletben Paul Zamecnik kóli kivonaton alapuló in vitro fehérjeszintézis eljárását fejlesztették tovább, és egy olyan enzimet használtak, amit 1955-ben Severo Ochoa izolált. Ochoa korábban kimutatta, hogy ezzel az enzimmel in vitro lineáris RNS-eket lehet előállítani. Mivel úgy tűnt, Ochoa felfedezte a sejt fő RNS-szintetizáló enzimét, 1959-ben megosztott orvosi Nobel-díjat kapott. (A másik díjazott Arthur Kornberg volt, aki a DNS-polimeráz I felfedezéséért, valamint a DNS szintézis kémiai alapjainak kidolgozásáért kapta a díjat.) Hamarosan kiderült, hogy az Ochoa által felfedezett enzimnek nincs köze a genetikai információhoz, hiszen ez az enzim mindennemű templát nélkül is katalizálta az RNS létrejöttét az alábbi séma szerint: (NMP)n + NDP  ↔  (NMP)n+1 + Pi.

(Vegyük észre, hogy az enzim NDP-t használ. Ma már tudjuk, hogy az enzim in vivo funkciója a fordított irányú reakció katalizálása, tehát RNS-ek degradálása nukleozid difoszfátokká.)

Ugyanakkor ez az enzim hatalmas áttöréshez vezetett a genetikai kód megfejtése terén. Nirenberg és Matthaei először poli-U szerkezetű mesterséges RNS-t inkubáltak olyan kóli extraktummal, amit előzetesen DN-ázzal kezeltek, hogy megszüntessék a kóli saját mRNS-einek utánpótlását. Ismerve, hogy az mRNS-ek rövidéletűek, a kóli saját mRNS készlete így nem jelentett gondot. A kóli kivonatot GTP-vel és ATP-vel is kiegészítették, valamint kívülről adtak be nagy koncentrációban aminosavakat.

A kísérlet során 20 reakcióedényt használtak. Mind a 20 edényben jelen volt mind a 20 aminosav, de mindegyik edényben csak az egyik fajta aminosav volt radioaktívan jelölt, edényenként mindig más és más.

A mesterséges poli-(U) mRNS radioaktív poli-fenilalanin peptidet eredményezett. Ezáltal megfejtették az első tripletet. Az UUU RNS nukleotid triplet, más néven kodon, fenilalanin aminosavat kódol!

Analóg kísérletekben a poli-(A) poli-lizint, a poli-(C) poli-prolint eredményezett. A poli-(G) négyláncú tetraplex szerkezetet képez, ezért nem működik. Három kodont tehát megfejtettek.

15.2.2. A random nukleotid keveréses módszer

Ochoa és Nirenberg csoportja között valódi verseny alakult ki a tripletek és a kódolt aminosavak egymáshoz rendeléséért.  Mindkét csoport alkalmazta a random nukleotid keverés módszerét. Meghatározott arányban adva az NDP nukleotidokat a polinukleotid-foszforiláznak random szekvenciájú RNS-ek jöttek létre. Az egyes tripletek aránya a kezdeti nukleotidok arányától függött. (A templát-független polinukleotid-foszforiláz random szekvenciájú RNS láncokat szintetizál.)

Például 5 egység ADP és 1 egység CDP olyan polimereket ad, melyekben átlagosan ötször annyi AMP egység van, mint CMP egység. Az egyes lehetséges tripletek aránya ez alapján számolható. Az AAA tripletből van a polimerben a legtöbb. Vegyük ennek valamilyen (nem %-ban értelmezett) mennyiség-egységét 100-nak. Az AAC, ACA, CAA tripletekből ehhez képest egyenként ötödannyi lesz, tehát mindegyikből külön-külön 20 egység. Az ACC, CAC, CCA tripletekből az előzőekhez képest is ötödannyi, vagyis 4-4 egység, végül a CCC tripletből ugyanilyen logika szerint 0,8 egység a várt „mennyiség”.

A kóli sejtmentes fehérjeszintézis rendszerben ilyen random polimer RNS alkalmazása után a radioaktív peptidek keverékében az egyes aminosavakat azonosították, és azok arányát megmérték. A kapott aminosav beépülési arányokat összevetették a tripletek arányával, és ezek alapján rekonstruálták, hogy az egyes aminosavakhoz hányféle, és milyen nukleotid összetételű tripletek tartozhatnak (lásd 15.1. táblázat).

15.1. táblázat

15.1. táblázat

Az már ismert volt, hogy az AAA triplet lizint jelent. Feltéve (és ez igaz volt), hogy a lizinhez nem tartozik citozin-tartalmú triplet, a lizin beépülésének mértékét az AAA kodon gyakorisághoz illeszkedve 100 egységnek vették. A lizinen kivül még 5-féle aminosav épült peptidbe. A prolin esetében ismert volt, hogy a CCC az egyik kodonja. A tapasztalt aminosav beépülési arányokat a legjobban a 15.1. táblázatban szereplő kodon összetételek magyarázták.

A pontos triplet szekvencia ugyan nem volt megállapítható, de a nukleotid összetétel igen. Például egyértelműen kiderült, hogy a hisztidint ebben a keverékben AC2 összetételű triplet kódolja, de azt nem tudjuk, hogy ez CAC, CCA, vagy ACC. Az is látszik, hogy három aminosavhoz (His, Pro, Thr) is fel kellett tételezni AC2 összetételű tripleteket. 1964-re szinte az összes aminosavra meghatározták a kódoló triplet összetételét, de még mindig nagyon kevés konkrét kodont sikerült megfejteni.

15.2.3. Szintetikus trinukleotid módszer: a Nirenberg-Leder kísérlet

A következő áttörést ismét Nirenberg ötlete hozta, amikor 1963-ban kiderült, hogy a riboszóma stabil komplexet képez az aminosavat hordozó tRNS-sel mRNS jelenlétében. Nirenberg eltűnődött azon, hogy vajon mi lehet egy ilyen kísérletben a legkisebb még használható mRNS, vajon egyetlen triplet elegendő-e. Nos, hamar kiderült, hogy a válasz, igen. Hatalmas elánnal új ötletek nyomán elkezdtek mesterséges tripleteket készíteni az akkoriban már beszerezhető 16-féle dinukleotidokból. Ehhez enzimeket használtak.

A módszer rendkívül elegáns ötlete a következő volt: az aminosavat szállító tRNS és a triplet, mint „mesterséges mRNS” átmegy egy megfelelő méretű pórusokat tartalmazó nitrocellulóz szűrőn, a hatalmas riboszóma azonban nem. Az aminosavat hordozó tRNS mRNS nélkül nem kötődik a riboszómához, de mRNS, vagy azt helyettesítő specifikus trinukleotidok jelenlétében igen, és ebben az esetben a riboszómához kötődve fennakad a szűrőn (lásd 15.6. ábra).

15.6. ábra: Nirenberg és Leder szintetikus trinukleotid módszere

15.6. ábra: Nirenberg és Leder szintetikus trinukleotid módszere

Nirenberg és Leder ezzel a módszerrel az esetek többségében meg tudta állapítani, hogy az egyes trinukleotidokhoz mely aminosavak tartoznak. A kísérlet során radioaktív aminosavakat hordozó tRNS-eket használtak. Azt korábban Zamecnik már megoldotta, hogy az ilyen aminoacil-tRNS molekulákat hogyan lehet izolálni. A kísérlet kiértékelésénél azt kellett meghatározni, hogy egy adott triplet esetében melyik aminosav okozza a legnagyobb radioaktív jelet a szűrőn. Elsőként a három már ismert, általuk korábban meghatározott tripleteket vizsgálták meg, az eredményt a 15.2. táblázat mutatja. (A táblázatban radioaktivitási adatokon alapuló, a filterre került aminosav mennyiségek szerepelnek mikromólban.)

15.2. táblázat

15.2. táblázat

Minden trinukleotidot megvizsgáltak mind a 20 aminosav esetében. Ezzel a módszerrel a 64 lehetséges triplet közül 50 esetében meghatározták, hogy milyen aminosavat kódolnak.

A nagyon gyengén kötődő tripletek, illetve a stop kodonok esetére azonban más eljárás kellett.

15.2.4. Khorana repetitív ismétlődéseket tartalmazó szintetikus RNS módszere

Khorana olyan kémiai eljárást dolgozott ki, amivel kisebb, ismert szekvenciájú oligonukleotidokat tudott összeépíteni. Ezáltal olyan szintetikus RNS-eket készített, amelyekben 2, 3, vagy 4 bázisnyi szekvencia ismétlődött.

A kétbázisos ismétlődés tripletek alternatív váltakozását jelenti. Például a CA ismétlésekből CACACACACA... keletkezik, amelyben a CAC és ACA tripletek váltogatják egymást. Ez a kóli kivonat alapú in vitro fehérjeszintetizáló rendszerben Thr-His-Thr-His szekvenciájú polipeptideket eredményezett.

Nirenberg és Ochoa összetételre vonatkozó kísérleteivel összevetve (AC2 His-t ad) látható, hogy a CAC a His, míg az ACA a Thr kódoló tripletje.

A hárombázisos ismétlődés háromféle egyenként homogén összetételű polipeptidet adhat. Például az ACCACCACCACC szekvenciájú RNS háromféle polipeptidet eredményezett, poli-treonint, poli-hisztidint és poli-prolint.

A négybázisos ismétlődés akárhol kezdődik a leolvasása, lényegében egyféle polipeptidet ad, amiben négyféle aminosav szabályosan ismétlődik (lásd 15.3. táblázat).

Az aminosavat nem kódoló stop tripletek meghatározása is ezzel a módszerrel történt. Három nukleotidos ismétlődéseknél egyes esetekben az egyik leolvasási keret stop kodonok egymásutánját jelentette, így háromféle helyett csak kétféle poli-aminosav keletkezett.

A négy nukleotidos ismétlődésnél pedig di-és tripeptidek keletkeztek, vagyis az aminosavakat kódoló tripletek között jelentek meg a stop-jelek.

A fent ismertetett megközelítésekkel 1966-ra megfejtették az összes triplet jelentését. Kiderül, hogy az elméleti várakozásoknak megfelelően van egy specifikus kezdő triplet. Ennek fényében meglepő volt, hogy az in vitro kísérletek e nélkül is eredményre vezettek. Mint később kiderült, a normálisnál jóval magasabb Mg2+ koncentráció miatt a riboszóma kezdő kodon hiányában is el tudta kezdeni a szintézist.

A genetikai kód megfejtésében elért eredményeiért Nirenberg és Khorana 1968-ban orvosi Nobel-díjat kaptak. A harmadik díjazott Robert Holley volt, aki 1964-re megfejtette az alanint hordozó tRNS teljes nukleotid sorrendjét.

15.3. táblázat

15.3. táblázat