16.2. A fehérjeszintézis első fő szakasza, az aminosavak aktiválása és tRNS-hez kötése

A transzlációban szereplő rendszereknek két fontos feladatot kell megoldaniuk. Az egyik az, hogy az aminosavak polipeptiddé kapcsolódását, ami egy önmagában endergonikus, tehát spontán végbe nem menő folyamat, kapcsolt reakciók segítségével exergonikussá, spontán végbemenővé tegyék.

A másik feladat annak biztosítása, hogy az aminosavak összekapcsolódása az mRNS-ben tárolt információ alapján történjen meg.

A két feladat közös megoldásaként minden egyes aminosav specifikus tRNS-hez kapcsolódik észterkötéssel a karboxil-terminálison keresztül. A termodinamikai értelemben instabil észterkötés jelenti az aktivált állapotot, hiszen az észterkötés bomlása, és ezzel egyidejűleg a stabilabb peptidkötés kialakulása összességében exergonikus folyamat.

A tRNS, mint adapter molekula olvassa ki az mRNS-en lévő információt. A specifikus aminosav-tRNS kapcsolat garantálja, hogy a polipeptid az mRNS-ben rejlő információ alapján keletkezzen.

Az aminosavak és a megfelelő tRNS-ek közötti észterkötés kialakítása a citoplazmában zajlik. A folyamat ATP-igényes, és aminoacil-tRNS-szintetáz enzimek katalizálják.

A 20-féle aminosavnak megfelelően minden élőlényben 20-féle aminoacil-tRNS-szintetáz működik. Tehát minden aminosavhoz egyetlen specifikus tRNS szintetáz tartozik. Ez felismeri a neki megfelelő aminosavat, és egyúttal az adott aminosavhoz tartozó tRNS-eket.

Mindezek alapján kijelenthető, hogy az aminoacil-tRNS-szintetázok „léptetik életbe” a genetikai kódot!

16.2.1. A tRNS-ek közös tulajdonságai, és másodlagos szerkezete

Amikor Robert Holley 1964-ben megfejtette az első tRNS, az élesztő alaninnak megfelelő tRNS-ének (tRNSAla) a nukleotid sorrendjét, a szekvenciában különös szabályszerűséget vett észre. Egyes szekvencia részleteket antiparallel elrendezve olyan bázisok kerültek egymással szembe, amelyek között Watson-Crick bázispárok alakulhattak ki. Amikor úgy rajzolta fel a szekvenciát, hogy az összes ilyen szakasz megtalálja a párját, megkapta a ma már közismert lóherealakot.

A nukleinsavak esetében a kizárólag a Watson-Crick bázispárosodások által diktált szerkezetet másodlagos szerkezeti szintnek hívjuk. A tRNS lóhere alakja tehát az elsődleges szerkezet alapján jósolt másodlagos szerkezetnek felel meg.

Az azóta megismert nagyszámú tRNS szekvencia alapján kiderült, hogy vannak olyan jellegzetességek, amelyek minden tRNS molekulára jellemzőek. A 16.3. ábra a tRNS „lóhere alakján” kívül ezeket is ismerteti.

16.3. ábra: A tRNS-ek másodlagos szerkezete és közös elemei

16.3. ábra: A tRNS-ek másodlagos szerkezete és közös elemei

Minden tRNS-nek legalább 4 „karja” van. A karokat az antiparallel elrendeződésű, egymással Watson-Crick bázispárokat képező láncrészek hozzák létre. Ezek közül az egyik az 5’- és a 3’-terminális szakaszok összekapcsolódásával alakul ki. Mivel a 3’-vég minden tRNS esetében egy CCA szekvenciát hordoz, és ezen keresztül kapcsolódik a szállított aminosav, ezért ezt a kart aminosav karnak hívják.

A másik három kar hurokban végződik, nevüket (D-kar, TΨC-kar és antikodon-kar) a hurok nevéről kapják. A D-hurok 2-3 pozícióban speciális módosult bázist, dihidrouridint (ennek a rövidítése „D”) tartalmaz. A TΨC-hurok arról kapta a nevét, hogy minden tRNS-ben tartalmaz egymás után két módosult bázist, egy ribotimint és egy pszeudouridint, amit egy konzervált citozin követ. Az antikodon hurok természetesen az antikodont hordozza, ami antiparallel elrendeződésben kapcsolatot teremt az mRNS-en lévő kodonnal.

Egyes aminosavakhoz tartozó tRNS-ek egy ötödik, fajonként eltérő méretű kart is tartalmaznak, ennek neve variábilis kar.

Bár a tRNS lóhere ábrázolása széles körben elterjedt, könnyen felismerhető, 1974-ben kiderült, hogy a molekula térszerkezete ettől lényegesen eltér (lásd 16.4. ábra).

Nagyjából egyidőben több kutatócsoport is megoldotta röntgendiffrakciós eljárással a tRNS térszerkezetét. Kiderült, hogy a molekula térben nagyjából L-alakot ölt. Figyelemreméltó, hogy az adapter funkció két kritikus eleme, vagyis az aminosav-kar és az antikodon hurok a molekula két kiálló részén, egymástól a lehető legtávolabb vannak. Ezek a molekularészek nem vesznek részt molekulán belüli kölcsönhatásokban. Ugyanakkor mindkét rész kiválóan hozzáférhető molekulák közötti kölcsönhatás számára.

16.4. ábra: A tRNS térszerkezete

16.4. ábra: A tRNS térszerkezete

A lóhere ábrán szereplő karok helikális szerkezetbe rendeződnek. A nem helikális szerkezetű részen lévő bázisok és ribóz 2’-OH csoportok is zömmel hidrogénhidas kapcsolatban vannak más csoportokkal. Az ezen a területen lévő bázispár kapcsolatok többsége nem követi a Watson-Crick szabályt, amelyet elsősorban a hosszabb helikális struktúrák követelnek meg.

A tRNS-ekre közösen jellemző speciális módosult bázisok (pl. dihidrouridin, pszeudouridin) a standardtól eltérő bázispárosodást tesznek lehetővé, és fontos szerepet játszanak a térszerkezet stabilizálásában. Az L-alak elsősorban annak az eredménye, hogy a D-kar és a TΨC-kar között részben ilyen csoportokon keresztül alakulnak ki kölcsönhatások.

16.2.2. Az aminosav aktiválás lépései

Az aminosavat specifikus aminoacil-tRNS-szintetáz enzim ismeri fel és köti meg, ami az aminosav karboxil csoportját ATP segítségével aktiválja. Ez adenilálással (más néven adenoribozilálás) történik, amelynek végeredménye egy vegyes savanhidrid. Az aktivált AMP-aminosav az enzimhez kötve marad. A reakció sémája tehát: aminosav + ATP = aminosav-AMP + PPi (lásd 16.5. ábra).

16.5. ábra: A két aminoacil-tRNS-szintetáz osztály két, kissé eltérő módon hozza létre az amino-acil tRNS-t

16.5. ábra: A két aminoacil-tRNS-szintetáz osztály két, kissé eltérő módon hozza létre az amino-acil tRNS-t

Korábban már említettük, hogy az aminosav-AMP köztiterméket először Hoagland és Zamecnik izolálta.

A folyamat második szakaszában az aminoacil-tRNS-szintetáz enzim specifikusan felismeri, és köti az aminosavnak megfelelő tRNS molekulát. A felismerés egyik eleme általában, de nem feltétlenül az antikodon hurok, de más specifikus tRNS elemek is fontosak.

Az enzim katalizálja a tRNS „feltöltését” a megkötött aminosavval az alábbi séma szerint:

aminosav-AMP + tRNS = aminosav-tRNS + AMP.

Az ATP-vel meghajtott aminosav aktiválás a kapcsolt reakciók szép példája! Az aminosav és a tRNS között az észterkötés magától nem jönne létre, az a reakció önmagában endergonikus lenne. Az ATP részvétele és exergonikus átalakulása AMP és PPi termékekre exergonikussá teszi a két részreakció összegét. Emlékeztetünk rá, hogy a pirofoszfát hidrolízise tovább fokozza a reakció szabadentalpia csökkenését, gyakorlatilag egyirányúvá téve a szintézist. A reakció részleteit a 16.5. ábra mutatja be.

Mint kiderült, az aminoacil-tRNS-szintetázoknak két evolúciósan elkülönülő csoportja létezik. A 20-féle aminosavból tízet az I. osztályba, a másik tízet a II. osztályba tartozó enzimek töltik tRNS-re. A két osztály jellegzetesen eltér egymástól térszerkezet és katalitikus mechanizmus tekintetében. Amíg az I. osztály enzimei először a tRNS CCA végén lévő ribóz 2’ hidroxiljára kapcsolják fel az aminosavat, majd az átkerül a 3’ hidroxilra, addig a II. osztály enzimei rögtön a 3’ hidroxilra helyezik az aminosavat.

A reakció végeredményeként kialakuló észterkötést, és annak molekuláris környezetét a 16.6. ábra mutatja.

16.6. ábra: Az aminoacil-tRNS CCA végén lévő észterkötése

16.6. ábra: Az aminoacil-tRNS CCA végén lévő észterkötése

Az észterkötésben lévő aminosav továbbra is aktivált állapotban van.  Az aminosavtól, és ezen keresztül az enzimtől függően az aminosavval töltött tRNS olykor nem válik le azonnal az enzimről, hanem minőségi ellenőrzés alá kerül. Ha nem a megfelelő aminosav került felkapcsolásra, az enzim elbontja az észter kötést.

Mielőtt megnéznénk ennek részleteit, felvetődik a kérdés, hogy miért szükséges ez a hibajavítás. A 16.1. táblázat azt mutatja be, hogy a fehérje méretétől, és az aminosav beépítés hibaarányától függően milyen arányban keletkezhetnek hibamentes fehérjék.

16.1. táblázat

16.1. táblázat

Ahhoz, hogy nagy, pl. 1000 aminosavas fehérjék esetében is a szintetizált fehérjék 99%-a hibátlan szekvenciájú legyen, tehát 1 százalék alatt maradjanak azok, amelyek aminosavsorrendje nem felel meg a genetikai információ által diktáltnak, a hibás aminosav beépítésének gyakorisága nem lehet nagyobb, mint 1:100000, azaz egy a százezerhez.

A nagy megbízhatóságú kodon-antikodon kapcsolat mellett az alacsony hibaszázalék elengedhetetlen feltétele, hogy az aminoacil-tRNS-szintetázok legfeljebb minden százezredik katalízis során helyezzenek nem megfelelő aminosavat a tRNS-re.

Ezt a specifikus szubsztrát kötőhely önmagában lehetővé teszi azoknak az aminosavaknak az esetében, amelyek fizikokémiai értelemben kellően nagymértékben eltérnek a többi 19 aminosavtól. Ilyenkor a megfelelő aminosav kötéséhez és a nem megfelelő aminosavak kötéséhez tartozó affinitások kellően nagymértékben eltérnek. A kétféle affinitás különbsége, mint ΔΔG a termodinamika törvényei szerint meghatároz egy egyensúlyi állandót, egy arányt a megfelelő és nem megfelelő komplexek tekintetében, és ez az arány meghaladja a 10000:1 arányt.

Vannak azonban olyan aminosavak, amelyek esetében ez nem teljesül. A treonin például csak egyetlen extra metilcsoportban tér el a szerintől. A treonil-tRNS szintetáz kötőzsebe emiatt nagyjából 100 katalizált reakcióból 1 esetében szerin aminosavat helyez fel a normálisan treonint szállító tRNS-re.

A 16.7. ábra illusztrálja, hogyan képez komplexet a treonil-tRNS szintetáz a treoninnal.

16.7. ábra: A treonil tRNS-szintetáz szubsztrátkötésének molekuláris részletei

16.7. ábra: A treonil tRNS-szintetáz szubsztrátkötésének molekuláris részletei

Az enzim egy hisztidinek és cisztein által koordinált cink ionon keresztül stabilizálja a treonin aminocsoportját (ami minden aminosavban szerepel), és β-szénatomhoz kapcsolódó hidroxilját, ami csak a treoninban és a szerinben van. Ezt a hidroxilt egy aszpartát-csoport is stabilizálja hidrogénhíd kötéssel. A treonin β-szénatomhoz kapcsolódó metilcsoportját egy azzal komplementer hidrofób zseb fogadja be. A metilcsoport hiányában a szerin ~100-szor gyengébben kötődik. Ahhoz, hogy a hiba mégse 1% legyen, hanem jóval kisebb érték, egy, a szubsztrátkötő zseb specifitásától független mechanizmus is szükséges.

Az enzimnek van egy, a szintézist végző helytől elkülönülő hibajavító helye is, ami a szerin esetében észleli a metilcsoport hiányát, és elbontja az aminoacil-tRNS észterkötését. A hidrolízist végző katalitikus centrum olyan kötőhellyel rendelkezik, amelyik nem befogadja be a metilcsoporttal rendelkező treonint, míg a szeril-csoport befogadásához optimális a szerkezete. A 16.8. ábra illusztrálja a két aktív helyet.

16.8. ábra: A treonil tRNS-szintetáz enzim aktiváló- és hibajavító-helye (PDB: 1QF6)

16.8. ábra: A treonil tRNS-szintetáz enzim aktiváló- és hibajavító-helye (PDB: 1QF6)

Látható, hogy a két hely egymástól meglehetősen távol helyezkedik el. Az aminosav két hely közötti ingázását az teszi lehetővé, hogy a tRNS 3’-vége elegendően flexibilis. Ezt a 16.9. ábra illusztrálja.

16.9. ábra: Az aktiváló- és hibajavító-hely közötti ingázást a tRNS flexibilis karja teszi lehetővé

16.9. ábra: Az aktiváló- és hibajavító-hely közötti ingázást a tRNS flexibilis karja teszi lehetővé

A komplex röntgendiffrakciós vizsgálatokból származó valós térszerkezeté a 16.10. ábra mutatja be.

16.10. ábra: a treonil-tRNS és a treonil-tRNS-szintetáz komplexének térszerkezete (PDB: 1QF6)

16.10. ábra: a treonil-tRNS és a treonil-tRNS-szintetáz komplexének térszerkezete (PDB: 1QF6)

16.2.3. A tRNS specifikus felismerése a szintetáz által

Az egyes aminoacil-tRNS-szintetázok különböző módokon ismerik fel a nekik megfelelő tRNS-t. A treonil-tRNS szintetáz például az antikodon hurkot és az aminosav-kart ismeri fel a tRNSThr-en (lásd 16.10. ábra). Amikor a tRNSMet megfelelő részleteit ezekkel a tRNSThr szakaszokkal helyettesítették, akkor a treonil-tRNS szintetáz a tRNSMet-et is felismerte, és treoninnal töltötte fel. A tRNSThr-nek ezáltal azonosították az úgynevezett identitás elemeit, azokat az elemeit, amiket a neki megfelelő tRNS szintetáz felismer.

A glutaminil-tRNS szintetáz ugyanakkor az antikodon hurkon és az aminosav karon kívül egy harmadik elemet is felismer. Ez a tRNS „derekánál” lévő G10-C25 bázispár (lásd 16.11. ábra).

16.11. ábra: A glutaminil-tRNS és a glutaminil-tRNS szintetáz komplexének szerkezete (PDB: 1QRT)

16.11. ábra: A glutaminil-tRNS és a glutaminil-tRNS szintetáz komplexének szerkezete (PDB: 1QRT)

Ezekből a példákból azt hihetnénk, hogy minden aminoacil-tRNS-szintetáz az antikodon hurkon keresztül ismeri fel a neki megfelelő tRNS-eket. Ez egyfelől elméleti alapon sem valószínű, másfelől már a kutatások elején találtak ellenpéldát. Az elméleti megfontolás a következő.

Három olyan aminosav is van (Arg, Leu, Ser), amelyeknek 6 kodonjuk van. A 6 kodonból 4 csak a 3. kodon pozícióban tér el egymástól. Ezeket ki lehet olvasni 2 egymástól csak kissé eltérő antikodonnal. A másik két kodon azonban jelentősen eltér az előbbi négytől. Ezek kiolvasásához az előzőtől jelentősen eltérő antikodon kell. Az a szubsztrát zseb, amelyik az egyik antikodon szettet specifikusan meg tuja kötni, nem kötheti meg a másik szettet. Elvileg persze lehetne két eltérő kötőhelye az enzimnek, de nem ez a megoldás.

A lényeg, hogy az azonos aminosavakat szállító tRNS-eken legyen olyan közös specifikus elem, ami csak ezekre a tRNS-ekre jellemző, a többiben nem fordul elő. A megfelelő aminosav-tRNS szintetáz ezt a specifikus elemet ismeri fel szelektíven. Ez a specifikus elem a tRNS-ek egy részénél lehet éppenséggel az antikodon hurok, másoknál (lásd pl. Arg, Leu, Ser), ez eleve nem lehetséges.

Arra, hogy a szintetáz nem feltétlenül az antikodont ismeri fel, már az elsők között megismert tRNS-ek egyike is meglepő példával szolgált (lásd 16.12. ábra).

16.12. ábra: A kóli alanil-tRNS szintetáza a tRNSAlaszerkezetében egyetlen G3-U70 bázispárt ismer fel, ezért egy mesterséges mikro-RNS-t is feltölt alaninnal

16.12. ábra: A kóli alanil-tRNS szintetáza a tRNSAla szerkezetében egyetlen G3-U70 bázispárt ismer fel, ezért egy mesterséges mikro-RNS-t is feltölt alaninnal

A kóli alanil-tRNS szintetáza a tRNSAla egy apró egyedi részletét ismer fel, de az antikodon hurokhoz egyáltalán nem köt. Az enzim egy nem Watson-Crick bázispárt ismer fel a tRNSAla aminosav karján. A G3-U70 bázispár csak a tRNSAla szerkezetében fordul elő, a többi tRNS-ben nem. Az alanil-tRNS szintetáz számára egy szintetikus RNS is megfelel mint szubsztrát, ha tartalmazza a tRNSAla-ra jellemző aminosav kar részletet (lásd 16.12. ábra). Az enzim ezt a tRNS-re alig emlékeztető molekulát alaninnal tölti fel.