17.2. Allosztérikus fehérjék/enzimek

Allosztérikus fehérjék több ligandum kötőhelyet tartalmaznak, s az egyik ligandum befolyásolja a másik kötődését. Azonos ligandumok esetén az allosztéria speciális esetéről, kooperativitásról beszélünk (pl. hemoglobin O2-kötése). Erről a szabályozási módról a hemoglobinnal foglalkozó fejezetben már röviden volt szó (lásd 7.6. fejezet). Az allosztéria görög eredetű szó, az allos jelentése „más”, a stereos jelentése „alak”.

17.2.1. Az allosztérikus fehérjék általános tulajdonságai

Az allosztérikus fehérjék esetében a molekuláris szabályozás (információtovábbítás) a következő séma alapján valósul meg:

Információt hordozó „jel” kötődése konformációváltozás biológiai válasz (enzimaktivitás csökkenés/növekedés, kötőpartner affinitás csökkenés/növekedés)

A jelhordozót allosztérikus effektornak (vagy modulátornak) nevezzük, ami lehet kismolekula, makromolekula vagy ion. A pozitív effektorok aktivátorok, a negatív effektorok inhibitorok. A fehérje fő ligandumával megegyező szabályozó jelek homotróp effektorok (kooperativitás), minden más szabályozó molekula vagy ion heterotróp effektor.

Ha egy fehérje ligandumtelítési vagy enzim esetében szubsztráttelítési görbéje nem derékszögű hiperbola, hanem szigmoid alakú, akkor lehetséges, hogy az allosztéria jelenségével állunk szemben (lásd 17.4. ábra).

17.4. ábra: Allosztériára utaló szigmoid alakú ligandum telítési görbe

17.4. ábra: Allosztériára utaló szigmoid alakú ligandum telítési görbe

Amennyiben a kísérlet során csak a „főligandumot” illetve a szubsztrátot adjuk hozzá növekvő koncentrációban a fehérjénkhez, akkor a jelenség kooperativitásra utal (lásd a hemoglobin oxigénkötése), amennyiben valamilyen további ligandum is jelen van a kémcsőben, akkor az utóbbi heterotróp allosztérikus effektor lehet (lásd a Hb oxigénkötése BPG jelenlétében).

Az allosztérikus fehérjék általában negyedleges szerkezetűek (pl. a hemoglobin négy alegységből áll, míg az egy polipeptidláncból felépülő mioglobin nem allosztérikus fehérje) vagy a harmadlagos szerkezetük több domént tartalmaz. Negyedleges szerkezetű allosztérikus enzimeknél sokszor a katalitikus funkció és a reguláció különböző alegységhez köthető (pl. aszpartát-transzkarbamoiláz enzim, lásd 17.2.2)

Az allosztérikus fehérjéknek minimum két konformációs állapota van, amelyeket rövidíthetünk T és R betűvel. A T (tense vagy taut: feszült) állapotban a szerkezet általában merevebb, aminek a következménye az lesz, hogy kevésbé (kisebb affinitással) kötődik a ligandum a fehérjéhez. Az R (relaxed: relaxált) állapotban a fehérje flexibilisebb, a kötőhelyéhez könnyebben hozzáfér (nagyobb affinitással kötődik) a ligandum.

Az allosztériát leíró legegyszerűbb működési modellben az allosztérikus effektorok a két állapot közötti egyensúlyt tolják el, a pozitív effektor az R, a negatív effektor a T irányba. Az allosztérikus szabályozás megvalósulhat kizárólag a fehérje szerkezeti dinamikájának megváltozásán keresztül is, mint ahogy azt a 17.5. ábra szemlélteti.

17.5. ábra: Kooperativitás (allosztéria) a fehérje szerkezeti dinamikájának megváltoztatásán keresztül.Ligandum nélkül mobilisabb/ flexibilisebb régiók; ligandumkötés stabilizál (itt pozitív kooperativitás).

17.5. ábra: Kooperativitás (allosztéria) a fehérje szerkezeti dinamikájának megváltoztatásán keresztül. Ligandum nélkül mobilisabb/ flexibilisebb régiók; ligandumkötés stabilizál (itt pozitív kooperativitás).

Az allosztéria és a kooperativitás kvantitatív leírására két modell született (lásd 17.6. ábra és 7.8. fejezet).

Az összehangolt (concerted; más néven szimmetrikus) modellt Jacques Monod, Jeffries Wyman és Jean-Pierre Changeux 1965-ben írták le. A modell szerint az allosztérikus fehérje alegységei funkcionálisan ekvivalensek és vagy a T vagy az R konformációs állapotban vannak. A ligandum mindkét állapothoz köt, de az R-hez nagyobb affinitással. Ha köt a ligandum az egyik alegységben levő kötőhelyéhez, mindegyik alegységben eltolódik a konformációs egyensúly az R állapot felé. E modell szerint a kooperativitás két homotróp kötőhely között csak pozitív lehet.

17.6. ábra: Az allosztéria/kooperativitás két modelljének összehasonlítása.T és R az allosztérikus fehérje alegységeinek konformációs állapota. S: szubsztrát vagy ligandum

17.6. ábra: Az allosztéria/kooperativitás két modelljének összehasonlítása. T és R az allosztérikus fehérje alegységeinek konformációs állapota. S: szubsztrát vagy ligandum

Egy évvel később született meg az általánosabb, David Koshland által kidolgozott szekvenciális (sequential) modell, ahol az első ligandum kötése olyan konformációváltozást okoz, ami a többi kötőhelyre is kiterjed. Ebben a modellben több átmeneti állapotot is felvehet az allosztérikus fehérje, azonkívül pozitív és negatív kooperativitás is elképzelhető a homotróp effektorok között.

A két modell egymást nem zárja ki, az együttműködő modell valójában a szekvenciális modell egy „mindent-vagy-semmit” alesetének tekinthető.

17.2.2. Példa egy allosztérikus enzimre: aszpartáz-transzkarbamoiláz

Az anyagcsere során egy kiindulási anyagból sokszor több lépésen keresztül alakul ki a végtermék, a katabolikus és az anabolikus folyamatokra is jellemzőek az anyagcsere útvonalak, ahol egy enzimreakció terméke a következő enzim szubsztrátja lesz (lásd 20.2. fejezet).

Az anyagcsere útvonalak enzimei között mindig találunk legalább egyet, mely allosztérikus szabályozás alatt áll. Ez jellemzően a reakcióút első enzimeinek egyike, hiszen az útvonal elején a leggazdaságosabb a szabályozás. A szabályozott enzim általában a reakcióút úgynevezett elkötelezett (committed) lépését katalizálja. Ha ez a reakció lezajlik, akkor általában már az összes további reakciólépés is megtörténik és a kiindulási szubsztrátból létrejön a végtermék. A szabályozott enzim gyakran irreverzibilis reakciót katalizál (azaz a reakció szabadentalpia csökkenése nagy, pl. ATP átalakulásához kapcsolt reakciók).

A végtermék gyakran a reakcióút szabályozott enzimére negatív allosztérikus effektorként hat vissza – ez a végtermék gátlás (feedback inhibition). Különböző reakció utak végtermékei is hathatnak egymás keletkezésére allosztérikus módon, ezáltal egy komplex szabályozási hálózat alakul ki, amely az anyagcsere homeosztázisának egyik fő molekuláris szabályozási mechanizmusát jelenti. A szabályozott metabolikus enzimek nem csak allosztérikus, de sokszor reverzibilis kovalens szabályozás alatt is állnak (lásd 17.3.1).

Az allosztérikusan szabályozott enzimek közül példaként a pirimidin nukleotidok szintézisének elkötelezett lépését katalizáló aszpartát-transzkarbamoiláz (ATC-áz) szabályozását mutatjuk be (lásd 17.7. ábra).

17.7. ábra: A pirimidin nukleotid anyagcsereút elkötelezett lépése.A reakciót az aszpartát-transzkabamoiláz (ATC-áz) enzim katalizálja. További lépéseken keresztül a végtermék, a CTP allosztérikusan gátolja az ATC-ázt.

17.7. ábra: A pirimidin nukleotid anyagcsereút elkötelezett lépése. A reakciót az aszpartát-transzkabamoiláz (ATC-áz) enzim katalizálja. További lépéseken keresztül a végtermék, a CTP allosztérikusan gátolja az ATC-ázt.

Az E. coli-ból származó enzim ~300 kDa molekulatömegű, 12 alegységből álló fehérje. A negyedleges szerkezet: c6r6 (2xc3 + 3xr2). A„c”a 6 katalitikus alegységet (34 kDa) jelöli, amelyek két, egymással kölcsönhatásban levő trimert alkotnak, míg az „r” a 6 regulációs alegységet jelöli (17 kDa), amelyek a trimerekhez oldalról dimerekként kapcsolódnak (lásd 17.8. ábra)

17.8. ábra: Az ATC-áz enzim térszerkezete. A2x3 katalitikus alegység színei piros és zöld árnyalatúak. A 3x2 regulációs alegység világoskék és sárga. A teljes szerkezetet két orientációban mutatjuk be felszíni ábrázolással. Külön kiemeltünk egy-egy katalitikus és regulációs alegységet szalagábrázolással, valamint az allosztérikus gátlószer CTP-t (piros) és a katalitikus alegységhez kötődő szubsztrát analógot (PALA; lila) (PDB: 1RAI és 8ATC)

17.8. ábra: Az ATC-áz enzim térszerkezete. A 2x3 katalitikus alegység színei piros és zöld árnyalatúak. A 3x2 regulációs alegység világoskék és sárga. A teljes szerkezetet két orientációban mutatjuk be felszíni ábrázolással. Külön kiemeltünk egy-egy katalitikus és regulációs alegységet szalagábrázolással, valamint az allosztérikus gátlószer CTP-t (piros) és a katalitikus alegységhez kötődő szubsztrát analógot (PALA; lila) (PDB: 1RAI és 8ATC)

Az ATC-áz enzimreakció kezdeti sebessége nem követi a Michaelis-Menten kinetikát, nem hiperbola, hanem szigmoid alakú, azaz kooperativitást mutat (lásd 17.9. ábra).

17.9. ábra: Az ATC-áz allosztérikus enzim szubsztrát telítési görbéje.Az ATP pozitív, a CTP negatív allosztérikus effektor.

17.9. ábra: Az ATC-áz allosztérikus enzim szubsztrát telítési görbéje. Az ATP pozitív, a CTP negatív allosztérikus effektor.

Szubsztrát nélkül a fehérje preferáltan a T állapotban van, míg a szubsztrátot az R állapotban köti nagyobb affinitással. A szubsztrát kötődése az egyik alegységhez a többi alegységben a T→R irányba tolja el a konformációs egyensúlyt (lásd 17.10. ábra). A kooperativitás szerkezeti alapja a katalitikus alegység interakciós felszínek közötti konformációváltozás, amit a szubsztrátkötés következtében a katalitikus alegység két doménjének záródása (indukált illeszkedés) idéz elő.

Az enzimet a pirimidin szintézis reakció végterméke, a citidin-trifoszfát (CTP) allosztérikusan gátolja. A CTP a regulációs alegységhez kötődik és az enzimfehérje konformációs egyensúlyát a T állapot felé tolja el (azaz a T állapothoz köt preferáltan). Ezzel szemben az ATP (a purin bioszintézis egyik végterméke, a sejt magas energiafeltöltöttségének jele) az ATC-áz enzim pozitív allosztérikus effektora.

Ez logikus szabályozási lépés, hiszen egyrészt a sejt a legtöbb nukleotidot DNS szintézisre használja, a DNS molekulában a Chargaff-szabályok alapján a purin és pirimidin nukleotidok aránya megegyezik, következésképpen a sejtnek célszerű ugyanolyan mennyiségben előállítania őket. Ezen kívül a magas energiaszint a replikáción kívül a transzkripcióhoz is kell, amihez szintén szükség van pirimidin nukleotidokra. Az ATP a regulációs alegységhez köt, preferáltan az enzim R konformációs állapotához (másképpen fogalmazva a konformációs egyensúlyt az R állapot felé tolja el) (lásd 17.10. ábra).

17.10. ábra: Az ATC-áz T és R konformációs állapota.A CTP, mint negatív allosztérikus effektor, az egyensúlyt a T állapot felé, míg a szubsztrát (pozitív kooperativitás) és az ATP az R állapot felé tolja el.

17.10. ábra: Az ATC-áz T és R konformációs állapota. A CTP, mint negatív allosztérikus effektor, az egyensúlyt a T állapot felé, míg a szubsztrát (pozitív kooperativitás) és az ATP az R állapot felé tolja el.

Az enzimek világában természetesen nem csak a metabolikus útvonalak elkötelezett lépését katalizáló enzimfehérjékre jellemző az allosztérikus szabályozás. A motorfehérjéknél a polimer „sínt” (ami mentén a motor mozog) felépítő fehérjék, az aktin illetve a tubulin allosztérikus effektorként fokozzák a miozin illetve a kinezin és a dinein motorokfehérje ATP-áz aktivitását. A jelátvitelben (szignál transzdukció) szerepet játszó enzimeknél a másodlagos hírvivők allosztérikus aktivátorként „bekapcsolnak” protein-kináz enzimeket (a cAMP a protein-kináz A, a Ca2+ a protein-kináz C enzimeket; lásd 17.3. fejezet).