17.3. Reverzibilis kovalens szabályozása

A fehérjék aktivitásának gyors, lokális szabályozását teszi lehetővé az allosztérikus reguláció, hiszen az effektor molekulák kötődését mindössze a koncentrációjuk befolyásolja. Ezzel szemben a kovalens módosításon alapuló szabályozás hosszabb távon befolyásolhatja az adott fehérje aktivitását, mivel a módosítás létrehozásához illetve az eltávolításához is egy-egy enzimre van szükség. Ma már mintegy 500 aminosav módosítást ismerünk, amelyek között vannak irreverzibilis és reverzibilis módosítások is (fontos emlékeztetnünk rá, hogy ezen változások mindegyike poszttranszlációs módosítás).

A módosítások többségében valamely donor molekuláról kerül egy funkciós csoport a fehérjére. Ismerünk olyan kovalens módosításokat is, ahol egy teljes fehérje kerül rá a szabályozandó fehérjére (ubiquitinálás, sumoilálás).

A fontosabb reverzibilis kovalens módosításokat a 17.1. táblázat mutatja be, feltüntetve a módosított aminosavat, a donor molekulát és a módosítás kémiai szerkezetét is.

17.1. táblázat: A reverzibilis kovalens módosítások főbb típusai

17.1. táblázat: A reverzibilis kovalens módosítások főbb típusai

A reverzibilis acetilációra példa a hiszton fehérjék módosítása, amelynek fontos szerepe van az eukarióta transzkripció szabályozásában (lásd 18.3.2.2. fejezet). A funkcionális csoport az acetil-koenzim-A molekuláról származik, a reakciót katalizáló enzimek a hiszton-acetiltranszferázok (HAT). Az acetil-csoport Lys oldalláncra kerül. A csoport eltávolítását a hiszton-dezacetilázok végzik. Fontos észrevennünk, hogy a módosított aminosav elveszíti a pozitív töltését (de negatív töltése sem lesz).

A fehérje metilációról (pl. a hiszton fehérjék, de az aktin és a miozin is metilálódnak poszttranszlációsan) sokáig úgy gondolták, hogy irreverzibilis szabályozás, de ma már tudjuk, hogy léteznek protein-demetiláz enzimek is, amelyek el tudják távolítani ezt a csoportot, ezáltal szerepet tölthetnek be például a génexpresszió szabályozásában.

Az ADP-ribozilációnál a NAD „kétharmada” kerül a fehérje pl. Arg oldalláncára. Sokszor nem csak egy funkciós csoport kerül a fehérjére, hanem ún. poli-ADP-riboziláció történik, amelyet a PARP (poli-ADP-ribóz polimeráz) enzimek katalizálnak. Ez a módosítás igen fontos szerepet tölt be a DNS hibajavításban, gyulladásos folyamatokban, az apoptózis szabályozásában.

Az ubiquitinálás az intracelluláris célzott fehérjedegradáció egyik legfontosabb szignálja, amikor egy fehérjére rákerül egy vagy több ubiquitin izopeptid kötéssel. Ezek a megjelölt fehérjék a proteaszómában lebomlanak. (Az ubiquitin-függő fehérjedegradációs útvonal felderítéséért a magyar származású Avram Hershko, Aaron Chachanover és Irwine Rose társaságában 2004-ben Nobel-díjat kapott.) A reverzibilis ubiquitinálás (és a rokon SUMO fehérje által közvetített sumoilálás) többek között a transzkripció, a DNS hibajavítás, az apoptózis szabályozásában játszik szerepet.

A fehérjék aminosav oldalláncainak poszttranszlációs kovalens módosításai közül a fehérjeműködés szabályozása szempontjából a legelerjedtebb a reverzibilis fehérje foszforiláció. Becslések szerint az eukarióta fehérjék legalább egyharmadára rákerülhet egy vagy több foszfátcsoport, amely meg tudja változtatni a fehérje térszerkezetét vagy a térszerkezet dinamikáját, s ezáltal szabályozza az aktivitását.

17.3.1. Reverzibilis foszforiláció

A reverzibilis fehérjefoszforiláció jelentőségére az első bizonyítékokat a glikogén szintézis kulcsenzimét, a glikogén-foszforilázt szabályozó foszoriláz kináz működésének felderítése szolgáltatta a 1960-as évek közepén (Edmond Fischert és Edwin Krebset 1992-ben Nobel-díjjal jutalmazták ezekért az eredményekért). Ma már tudjuk, hogy ez a kovalens szabályozási mód nagyon elterjedt az élő rendszerekben, kiemelten az eukarióták világában, s a nem-kovalens allosztérikus szabályozás mellett a leggyakoribb molekuláris szabályozó mechanizmus.

A reverzibilis szabályozás foszorilcsoport donorja minden esetben az ATP, amelynek a g-foszforilcsoportja transzferálódik a reakció során a fehérjék Ser, Thr, Tyr vagy ritkábban His oldalláncára. A reakciót katalizáló enzimek neve: protein-kináz, a defoszforiláló enzimeké pedig protein-foszfatáz.

A foszforiláció során az ATP által szolgáltatott kb. -30 kJ/mol szabadentalpia (standard körülmények között, lásd 3.4.5. fejezet) körülbelül fele „megőrződik” a létrejött foszfoproteinben (a hidroxilcsoportot tartalmazó oldalláncokkal észterkötést alakít ki a foszfát, aminek a hidrolízise kb. -15 kJ/mol szabadentalpia csökkenéssel jár). A „fél ATP-nyi”  -15 kJ/mol szabadentalpia változás ugyanakkor elegendő ahhoz, hogy a reakciót gyakorlatilag irreverzibilissé tegye.

Emlékezzünk rá, az egyensúlyi állandó egy nagyságrenddel történő eltolása 5,69 kJ/mol szabadentalpia változással jár (DG = – RT lnKeq; lásd 3.2. táblázat és 3.29. egyenlet), azaz a foszforiláció irányába három nagyságrenddel el van tolva a reakció. Ebből a tényből az is következik, mint arról már feljebb is írtunk, hogy a foszfátcsoport eltávolítását egy másik enzimnek egy másik reakcióval, nevezetesen defoszforilációval (hidrolízis) kell elvégeznie. A szabályozás reverzibilitást biztosító lépését a fent említett protein-foszfatáz enzimek katalizálják (lásd 17.11. ábra). Fontos megértenünk, hogy itt nem a foszforiláció (vagy éppen defoszforiláció) kémiai reakciója a reverzibilis, hanem a foszfátcsoport jelenlétén illetve hiányán alapuló szabályozás, amelyet két egymással ellentétes irányú, önmagában irreverzibilis, enzimkatalizált kémiai reakció kombinálása tesz lehetővé.

Miért hatékony szabályozási lehetőség a reverzibilis foszforiláció? Nem meglepő, hogy itt is a szabályozott fehérje konformációváltozását eredményezi az oldallánc(ok)ra rákerült foszfátcsoport. A neutrális pH-n két negatív töltéssel bíró csoport a módosítatlan fehérje felszínén töltéseket semlegesíthet, vagy új töltéseket hozhat létre, amelyek konformációváltozást eredményezhetnek. A foszfátcsoport több új H-híd kölcsönhatást is ki tud alakítani a módosított fehérje aminosav oldalláncaival.

17.11. ábra: A protein foszforiláció és defoszforiláció.Ábrázoltuk a protein-kináz illetve protein-foszfatáz enzimek által katalizált reakció szabadentalpia változását is.

17.11. ábra: A protein foszforiláció és defoszforiláció. Ábrázoltuk a protein-kináz illetve protein-foszfatáz enzimek által katalizált reakció szabadentalpia változását is.

Ez a szabályozás elsősorban az intracelluláris fehérjéket/enzimeket érinti, s az allosztériához képest általában hosszabb idejű (másodpercektől akár órákig, napokig fennálló) aktivitásváltozást (aktiválás, gátlás) tesz lehetővé, amelynek a bekapcsolási/kikapcsolási kinetikáját illetve időtartamát a reverzibilis módosításban résztvevő két enzim további szabályozásával lehet finomhangolni.

A foszforiláción keresztül egy nagyon kis szabályozó jel könnyen felerősíthető (amplifikálható) protein-kináz kaszkádok segítségével. Ilyen, egymást foszforiláló és ezáltal „bekapcsoló”protein-kinázok szabályoznak például több fontos jeltovábbító (szignál transzdukciós) útvonalat a sejtben. Jellemző példa erre a sejtproliferációt szabályozó MAP-kináz (mitogén-aktiválta protein-kinázok) jeltovábbító útvonal.

17.3.2. Protein-kináz családok

A reverzibilis fehérje foszforiláció jelentőségét mi sem bizonyíthatja jobban, minthogy pl. a saját genomunkban ~600 gén (az összes gén több mint 3%-a) protein-kináz enzimet kódol. Ezeket alapvetően két fő kategóriába soroljuk, attól függően, hogy az ATP-ről a foszforilcsoportot milyen oldalláncra viszik át.

A népesebb csoport az ún. Ser/Thr-kinázok, amelyek az alifás hidroxil oldalláncra helyezik a foszfátot. Ezek az enzimek a sejtanyagcsere szabályozásán kívül többek között a jelátviteli folyamatok és a sejtosztódás szabályozásában is fontos szerepet töltenek be. A másik csoport a Tyr-kinázok, amelyek a Tyr aromás fenilcsoportján alakítanak ki foszfátésztert. Ezek a szabályozó enzimek tipikusan a jelátviteli útvonalakban játszanak szerepet (pl. a receptorok egyik külön osztálya, az ún. receptor tirozin-kinázok tartoznak ebbe a csoportba, mint pl. az EGF-receptor vagy a növekedési hormon receptora).

A protein-kinázok a szubsztrátjuk szerint lehetnek ún. dedikált kinázok, melyek specifikusan csak egy vagy néhány fehérjét tudnak foszforilálni. Példa a miozin könnyű lánc-kináz (MLCK) enzim, amely a simaizom kontrakciót „bekapcsoló” regulációs enzim, s nevének megfelelően a miozin motorfehérje egyik kisméretű alegységét foszforilálja. A másik csoportjuk széles célfehérje spektrummal rendelkezik, azaz sokféle fehérjét/enzimet tud szabályozni. Mi alapján „tudja” az enzim, hogy melyik fehérjét kell szabályoznia? A szubsztrátspecificitás természetesen itt is, mint minden fehérje-fehérje, enzim-szubsztrát kölcsönhatás során (molekuláris felismerés) térbeli és elektrosztatikus komplementaritás alapján történik. Ebbe a csoportba tartozik az alábbiakban részletesen ismertetett protein-kináz A (más néven cAMP-függő protein-kináz).

Azt a szekvenciát (pontosabban szekvenciákat), ami beleillik a kináz enzim aktív helyébe, konszenzus szekvenciának nevezzük. A 17.2. táblázatban mutatunk be néhány fontos protein-kinázt, a konszenzus szekvenciákat és a kinázt allosztérikusan szabályozó modulátorokat is feltüntetve.

17.2. táblázat: Protein-kináz enzimek

17.2. táblázat: Protein-kináz enzimek

Fontos tulajdonsága a protein-kinázoknak, hogy ők is szabályozott fehérjék. Már említettük a protein-kináz kaszkádokat, de még általánosabb az allosztérikus szabályozás. Az allosztérikus effektor nevét sokszor a protein-kináz neve (vagy alternatív neve) is tartalmazza, mint például a Ca2+-CaM-kináz esetében, amelyet a kalciumionok által szabályozott kalmodulin allosztérikus kötődése „kapcsol be”.

17.3.3. A cAMP-függő protein-kináz (protein-kináz A) működése

Az állatok tipikus stresszválaszának (angol kifejezéssel: fight-or-flight) molekuláris hátterében központi szerepet tölt be a cAMP-függő protein-kináz (más néven protein-kináz A, PKA). Az adrenalin, a „stresszhormon” kötődik a sejtfelszíni adrenalin receptorhoz (ami egy G-fehérje kapcsolt receptor, GPCR, lásd 11.5.2.1. fejezet), ami olyan konformációváltozást eredményez a membránfehérje intracelluláris doménjében, hogy egy heterotrimer G-fehérje fog kötődni az aktivált receptorhoz. (A receptor aktiváció molekuláris részleteinek feltárásért ítélték oda a 2012. évi kémiai Nobel-díjat Robert Lefkowitz-nak és Brian Kobilkának.).

A heterotrimer G-fehérjéhez kötött GDP GTP-re cserélődik, és szétesik egy Gαs és egy heterodimer Gβγ alegységre. A GTP-kötött, ezért „bekapcsolt” állapotú Gαs aktivál egy membránkötött enzimet, az adenilát-kinázt. Ez utóbbi enzim ATP-ből cAMP-t (lásd 17.12. ábra) szintetizál, ami aktiválja a kulcsenzim PKA-t.

17.12. ábra: A 3’-5’-ciklikus-adenozin-monofoszfát (cAMP) szerkezeti képlete

17.12. ábra: A 3’-5’-ciklikus-adenozin-monofoszfát (cAMP) szerkezeti képlete

Végül az aktivált PKA számos célfehérjét foszforilálva, sejttípus függően kiváltja a stresszválaszt (a szignál transzdukciós folyamat molekuláris részleteiről az emelt szintű biokémia oktatás keretében esik majd szó).

Ebben az alfejezetben a PKA működését ismertetjük. A PKA tanulságos példa arra is, hogy a fehérjeszabályzás során hogyan működik együtt az allosztérikus és a reverzibilis foszforiláción alapuló szabályozás, ugyanis a cAMP a PKA allosztérikus pozitív modulátora.

A PKA alegységszerkezete R2C2, azaz két regulációs és két katalitikus alegységből áll. Inaktív állapotban a regulációs alegység egy-egy ún. pszeudoszubsztrát régiója kötődik a katalitikus alegységek aktívhelyéhez, s ezáltal az enzimet kikapcsolt állapotban tartja (lásd 17.13. ábra). Hogyan működik a pszeudoszubsztrát?

17.13. ábra: A protein-kináz A enzim működésének vázlata.A bal oldali inaktív állapotot az aktív helyhez kötődő pszeudoszubsztrát okozza (intrasztérikus gátlás). Az allosztérikus effektor cAMP kötődése aktiválja az enzimet úgy, hogy a katalitikus és regulációs alegységek disszociálnak (jobb oldal).

17.13. ábra: A protein-kináz A enzim működésének vázlata. A bal oldali inaktív állapotot az aktív helyhez kötődő pszeudoszubsztrát okozza (intrasztérikus gátlás). Az allosztérikus effektor cAMP kötődése aktiválja az enzimet úgy, hogy a katalitikus és regulációs alegységek disszociálnak (jobb oldal).

Ennek megértéséhez először nézzük meg mi a PKA célfehérjék konszenzus szekvenciája: R(R/K)X(S/T)Z. Ezek alapján olyan szekvenciát ismeri fel a PKA szubsztrátként, amelynek az első aminosava Arg, a második pozitív töltésű (ezt jelzi a konszenzusszekvenciák egybetűs írásmódja szerint az R vagy K), a harmadik aminosav bármi lehet (ezt jelzi az X), a negyedik Ser vagy Thr, végül az ötödik aminosav hidrofób karakterű (ezt jelzi a Z). Tehát az enzim szubsztrátkötő zsebébe egy öt aminosavból álló peptidszakasz illik bele, s a negyedik pozícióban lévő Ser vagy Thr hidroxiljára kerül az aktív helyen lévő ATP-ről a terminális foszfátcsoport. Fontos emlékeztetnünk rá, hogy az ATP (mint minden más ATP-t kötő enzimnél) Mg2+-komplex formájában (lásd 17.14. ábra) kötődik a fehérjéhez. Ennek oka többek-között, hogy a magnézium jelenlétében az ATP hasítandó P-O kötése erősebben polarizálódik, ezért könnyebben lezajlik a reakció.

17.14. ábra: Mg2+-ATP komplex

17.14. ábra: Mg2+-ATP komplex

A regulációs alegység N-terminális régiójában található az Arg-Arg-Gly-Ala-Ile pszeudoszubsztrát szekvencia Ebben a konszenzus szekvenciában levő Ser vagy Thr aminosavat Ala helyettesíti. Mivel ennek az aminosavnak nincs hidroxil oldallánca (amire az ATP-ből a foszforilcsoport átkerülhetne), viszont a többi aminosavmaradék és a szubsztrátkötő zseb között kialakulnak a specifitást biztosító másodlagos kölcsönhatások, érthetővé válik, hogy miért „álszubsztrát” ez a szekvencia.

A katalitikus alegységekhez 2-2 cAMPköt, amely kölcsönhatás olyan konformációváltozásokat indukál az alegységek kölcsönhatási felszínén (a pszeudoszubsztrát és a katalitikus alegység között), ami végső soron a kétféle alegység disszociációjához vezet. A katalitikus alegységekben a szubsztrákötő zseb így hozzáférhetővé válik a célfehérje számára, a PKA aktív állapotba kerül. A pszeudoszubsztráton alapuló, sok más fehérjére is jellemző szabályozási típust intrasztérikus gátlásnak nevezzük

Az inaktív PKA enzim szerkezetét, kiemelve a pszeudoszubsztrát szekvenciát a 17.15. ábra szemlélteti.

17.15. ábra: A PKA enzim szerkezete inaktív állapotban.A katalitikus alegység piros, a regulációs alegység világoskék színű. Az utóbbi N-terminális régiója, a pszeudoszubsztrát szekvencia kék. Az aktív helyen lévő ATP-analóg térkitöltő ábrázolással zöld. (PDB: 3FHI)

17.15. ábra: A PKA enzim szerkezete inaktív állapotban. A katalitikus alegység piros, a regulációs alegység világoskék színű. Az utóbbi N-terminális régiója, a pszeudoszubsztrát szekvencia kék. Az aktív helyen lévő ATP-analóg térkitöltő ábrázolással zöld. (PDB: 3FHI)