17.4. Irreverzibilis kovalens szabályozása

Az irreverzibilis kovalens szabályozás során a fehérje „véglegesen” módosított állapotba kerül, ami a már sokszor említett módon, konformációváltozás révén változtatja meg az adott fehérje aktivitását. A leggyakoribb ilyen típusú módosítás a polipeptidlánc poszttranszlációs, limitált proteolitikus hasítása. Ez a szabályozás jellemzően egy inaktív fehérjét illetve enzimet (proenzim vagy zimogén) alakít aktív állapotúvá.

Ezen kívül ilyen szabályozó, fehérjelebontási jel a polipeptidlánc utólagos ubiquitinálása és poli-ubiquitinálása. Az ATP-függő, három lépésben (három enzim közreműködésével) lejátszódó folyamat során izopeptidkötés jön létre a 76 aminosavból álló ubiquitin C-terminális glicinjének α-karboxilcsoportja és leggyakrabban a módosítandó fehérje egy lizin oldalláncának e-aminocsoportja között (lásd 17.16. ábra). Az így módosított fehérjék az eukarióta sejtek proteaszómájában lebomlásra kerülnek.

17.16. ábra: Izopeptid kötés egy Gly α-karboxilcsoport és egy Lyse-aminocsoport között.

17.16. ábra: Izopeptid kötés egy Gly α-karboxilcsoport és egy Lys e-aminocsoport között.

Végül megemlítjük az ún. lipidhorgonyok fehérjékre kerülését (lásd még 11.5.2 fejezet). Ilyen módon kerül például számos jelátviteli folyamatokban szerepet játszó fehérjére a sejtmembránhoz történő lokalizációjukat biztosító lipidcsoport. Két példát mutatunk be. Mirisztoil-csoport (C14:0 telített zsírsav) kerül egy transzferáz enzim segítségével, amidkötéssel pl. a kis G-fehérje, a Ras N-terminális Gly α-aminocsoportjára. A farnezilálás során pedig egy izopréncsoport kerülhet fehérjékre, mint például az Src protein-kinázra.

(A Ras egy kis GTP-áz fehérje ami fontos protoonkogén, és többek között a sejtproliferációs jelátviteli útvonalakban játszik szerepet, míg onkogén mutánsai a humán tumorok közel egyharmadában megtalálhatók. Az Src a sejtszaporodást szabályozó ún. szolubilis tirozin-specifikus protein-kináz, szintén protoonkogén fehérje).

17.4.1. Fehérjék aktiválása proteolitikus hasítással

Nagyon gyakran előfordul, hogy elsősorban az extracelluláris térben működő fehérjék és enzimek inaktív formában szintetizálódnak, s egy vagy néhány peptidkötés hasítása után válnak aktívvá. A legismertebb ilyen példa a hidrolitikus enzimek, elsősorban az emésztőenzimek, zimogén formában történő szintézise után a zimogén aktiválás. Erre példa a kimotripszinogén aktiválódása aktív kimotripszinné (lásd 17.17. ábra).

A kimotripszinogén 245 aminosav hosszú polipeptidláncát a tripszin aktiválja úgy, hogy a zimogénen belül elhasítja az Arg15-Ile16 közötti peptidkötést. (Egy második lépésben a létrejött és már aktív p-kimotripszin még két kötést hasít, s két kis peptid távozik is az enzimből, miközben kialakul a három láncból álló aktív α-kimotripszin.) A zimogénben az enzim aktívcentruma szerkezetileg torzult, ezért inaktív. Az Arg15-Ile16 közötti peptidkötés hasítása egy új N-terminális megjelenését eredményezi, ezzel megjelenik egy protonált, tehát pozitív töltésű α-aminocsoport. Ez sóhidat hoz létre a 194-es Asp negatív oldalláncával, s ennek az elektrosztatikus vonzásnak a következtében a katalitikus triád (Ser195, His57 és Asp102) oldalláncai a katalízishez szükséges pozícióba kerülnek. A katalízis mechanizmusát a 8.5.3. fejezetben ismertettük, az itt bemutatott 17.17. ábra a zimogén átalakulás hatására bekövetkező konformációváltozást és a kimotripszin aktív centrumát mutatja, kiemelve az újonnan létrejött sóhidat.

17.17. ábra: A kimotripszinogén és a kimotripszin szerkezetének összehasonlítása (bal) és a kimotripszin aktív helye (jobb).Kiemeltük a zimogén aktivációban kritikus sóhídat (Asp194 és az Ile16 α-aminocsoport között).

17.17. ábra: A kimotripszinogén és a kimotripszin szerkezetének összehasonlítása (bal) és a kimotripszin aktív helye (jobb). Kiemeltük a zimogén aktivációban kritikus sóhídat (Asp194 és az Ile16 α-aminocsoport között).

Az irreverzibilis szabályozásra további példák az ún. proteolitikus kaszkádok, ahol az egyes zimogén komponensek lépésenként egymást aktiválják proteolízissel. Ilyen proteolitikus kaszkádok vezetnek a véralvadáshoz és a veleszületett immunvédekezéshez tartozó a komplementrendszer aktiváláshoz.

A véralvadási kaszkádot itt nem részletezzük, csak az utolsó zimogén aktiválási lépést említjük, nevezetesen a protrombin-trombin átalakulást. A trombin katalizálja, szintén limitált proteolízissel a fibrinogén-fibrin átalakulást, ami a véralvadás utolsó előtti „végrehajtási” lépése (az utolsó lépés a kialakuló fibrilláris fibrin szálak kovalens izopeptid keresztkötésekkel történő stabilizálása, a szintén zimogén aktiválással funkcióképessé váló transzglutamináz enzim által).

A protrombin tipikus moduláris fehérje (lásd 17.18. ábra). A modul egy fehérjeevolúciós egység, amely egy-egy funkció elvégzésére képes génrégió független evolúciójával – az „exon-keveréssel” (exon shuffling) – jöhet létre. Szerkezeti értelemben egy fehérjemodul egy vagy több doménből is állhat (utóbbira példa a sok extracelluláris fehérjében, így a véralvadási kaszkád és a komplement aktiváció egyes komponenseiben megtalálható szerin-proteáz modul, ami két szerkezeti doménből áll, lásd 8.14. ábra).

17.18. ábra: A protrombin szerkezeti sémája és proteolitikus hasítása trombinná.A Gla-domén g-Glu aminosavakat tartalmaz, a kringle-domén fehérje-fehérje kölcsönhatásokban vesz részt.

17.18. ábra: A protrombin szerkezeti sémája és proteolitikus hasítása trombinná. A Gla-domén g-Glu aminosavakat tartalmaz, a kringle-domén fehérje-fehérje kölcsönhatásokban vesz részt.

A protrombin N-terminálisán egy Gla-domén található, amely poszttranszlációsan kialakuló g-glutaminsavakat tartalmaz (az oldalláncában két karboxilcsoport van; lásd 17.19. ábra). Ezt a domént két, tipikusan fehérje-fehérje, domén-domén kölcsönhatásokban résztvevő ún. kringle-domén (topológiája alapján egy dán perec után elnevezve) követi, végül a C-terminális végen található a szerin-proteáz modul.  A proteáz egység aktivitását a Gla- és a kringle-domének a protombinban gátolják, másrészről viszont elősegítik a protrombint aktiváló Xa-véralvadási faktor kötődését. A protrombin aktiváció során két peptidkötés hasad (lásd 17.18. ábra), s ennek eredményeként szabadul fel a katalitikus régió a gátlás alól.

17.19. ábra: A protrombin Gla-domén térszerkezete és a Gla (g-Glu aminosav).Ca2+: zöld, a g-Glu aminosavak: piros (PDB: 2PF2)

17.19. ábra: A protrombin Gla-domén térszerkezete és a Gla (g-Glu aminosav). Ca2+: zöld, a g-Glu aminosavak: piros (PDB: 2PF2)

A trombin, egy tipikus szerin-proteáz, amely azonos módon működik a korábban ismertetett kimotripszinnel (lásd 8.5.3. fejezet). Szubsztrátspecifitása ugyan hasonlít a tripszinéhez, de jóval szűkebb, mivel az Arg utáni peptidkötést szinte csak Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser szekvenciát megkötve, hasítja.

A g-glutaminsav szintézisét egy K-vitamin-függő enzim katalizálja. Ennek a poszttraszlációs úton keletkező aminosav oldalláncnak az a jelentősége, hogy az egy karboxilcsoporthoz képest jóval erősebb fémion kelátor, ezért az érfal sérülésekor felszabaduló Ca2+-ot koordinációs kötéssel megköti (lásd 17.19. ábra), ezzel a sérülés helyéhez „csalogatja” a protrombint, s a zimogén aktiváció ott fog megtörténni, ahol a véralvadásra szükség van.

Érdekességként megjegyezzük, hogy az oldallánc karboxilálását végző enzimet gátolja a kumarin származék dikumarol és a warfarin (4-hidroxikumarin), amelyek antikoaguláns (véralvadásgátló) szerek. Magas koncentrációban az ilyen szerek belső vérzéseket okoznak, az utóbbit, ezt kihasználva patkányméregként is használják.

Végül megemlítünk néhány egyéb példát az irreverzibilis proteolízissel történő proprotein/proenzim (zimogén) aktiválásra: A komplementrendszer proteolitikus kaszkádját már említettük. A prohormonok is limitált proteolízissel aktiválódnak (pl. proinzulin-inzulin átalakulás). A leggyakoribb kötőszöveti fehérje, a kollagén prokollagénként szintetizálódik, s irreverzibilis proteolízis után jönnek csak létre a kollagén fibrillumok. Az egyedfejlődés során szükség lehet a kollagén elbontására (lásd például az ebihal farokszövetének lebomlása), amit a kollagenáz enzim katalizál, de csak miután a zimogén prokollagenáz limitált proteolízissel aktiválódott. A programozott sejthalál, az apoptózis egyik „ítéletvégrehajtója” a kaszpáz enzimcsalád, amelynek inaktív zimogénjei a prokaszpázok.

(A kaszpázok angol nevében - caspase - a kezdő „c”betű onnan ered, hogy a cisztein- proteázok közé tartoznak, az „asp” pedig a szubsztrátspecificitásukat jelzi, mivel Asp oldallánc után hasítják a peptidkötéseket. E proteázcsaládban a szerin-proteázokéhoz hasonló katalitikus apparátus végzi, de Ser, His, Asp triád helyett itt egy Cys, His diád alkotja a katalitikus centrumot.)