18.3. Eukarióta génexpresszió szabályozás

18.3.1. A komplex genom komplex szabályozást igényel

A prokarióta genomoknál nagyságrendekkel nagyobb és komplexebb eukarióta genom nyilvánvalóan komplexebb génexpresszió szabályozást igényel (lásd még 14.5.1. fejezet). A méretbeni különbségek kapcsán emlékeztetünk rá, hogy egy tipikus baktérium, az E. coli egyetlen cirkuláris DNS molekulája 4,6 Mbp méretű, míg például az emberi genom 23 haploid lineáris kromoszómája összességében három nagyságrenddel több információt hordoz (3,2 Gbp). A komplexitást növeli a többsejtű szervezetek differenciálódás- és sejtspecifikus génexpressziójának igénye. Már elöljáróban jeleztük, hogy az eukarióta génexpresszió szabályozás alapvetően különbözik a prokariótákétól, s hallatlanul bonyolult, egymással összefüggő, s még ma sem teljesen feltárt molekuláris mechanizmusok jellemzőek rá.

Az eukarióta génexpresszió komplexitását fokozza, és szabályozáselméleti szempontból új lehetőségeket nyit meg, hogy a transzkripció és a transzláció térben és időben elválik egymástól.

A következő alapvető különbség a bakteriális génexpresszió szabályozással összevetve, hogy amint az előző fejezetben láttuk, a prokarióta gének alaphelyzetben „bekapcsoltak”, míg az eukarióta gének „kikapcsoltak”. Ennek az egyik oka, hogy a bakteriális RNS-polimeráz önmaga hozzáfér a génekhez, a specificitási faktora (s-alegység) segítségével kötődik a promóterhez és meg tudja kezdeni a transzkripció iniciációját (lásd 14.2. fejezet). Ezzel ellentétben erre az eukarióta RNS-polimerázok nem képesek, csak ha a promóteren már kialakult az általános (bazális) transzkripciós faktorok segítségével a preiniciációs komplex (TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, and TFIIH és a PolII; lásd 14.5. fejezet). Másképpen fogalmazva, az eukarióta RNS-polimerázok nem ismerik fel a promóterüket, közvetlenül a DNS-hez nem tudnak kötődni. Megjegyezzük még, hogy az archeák génjeinek transzkripcióját is megelőzi a preiniciációs komplex létrejötte.

Az eukarióta génekre tehát messze nagyobb mértékben jellemző a génaktiválás, mint a génrepresszió. Ennek alapvető oka (ami összefügg az előbbi bekezdésben említett RNS-polimeráz „problémával” is), az eukarióta DNS nukleoszóma és kromatin szerveződése. A nukleoszóma, mint szupramolekuláris komplex szerkezetét korábban már bemutattuk (lásd 12.3.5. fejezet).

Amikor a géneket tartalmazó DNS nukleoszómás szerkezetben van, a gének nehezen hozzáférhetőek a transzkripciós gépezet számára, gyakorlatilag inaktív állapotban vannak. Az eukarióta gének bekapcsolásának egyik alapmechanizmusa ezért a kromatin remodellálás (remodeling) folyamata (lásd 18.3.2. ), ami végső soron úgy rendezi át a nukleoszómás struktúrát, hogy a génekhez hozzáférjenek az általános transzkripciós faktorok.

Az eukarióta transzkripciós faktorok moduláris felépítésűek. Ugyan a prokarióta TF-eknek is külön DNS- és ligandum-kötő doménjük van, de az eukariótákban a DNS-kötés és a transzaktiváció (a transzkripció aktiválása) is külön szerkezeti doménhez (vagy alegységhez) rendelhető. Allosztérikus szabályozást lehetővé tevő regulációs doménből (alegységekből) több is lehet egy eukarióta TF-en. A transzkripciós faktorok működésük során nagy komplexeket alakítanak ki (sztöchiometrikus szupramolekuláris komplexeket, mint pl. a Mediátor komplex, vagy tranziensen kialakuló komplexeket, amelyek fehérjeösszetétele időben és térben változik).

A szabályozási alapelvek következő fontos eleme, a kombinatorikus és szinergisztikus szerveződés. A kombinatorikus szerveződés azt jelenti, hogy egy-egy eukarióta génnek jó pár (minimum öt) regulációs helye van (promóter elemeken kívül), ahova különböző transzkripciós faktorok köthetnek. Ezen kívül egy-egy TF sok gén regulációs elemeihez kötődhet. Szintén a kombinatorikus építkezés valósul meg a már tárgyalt heterodimereket is kialakítani tudó TF-ekben (pl. Fos/Jun heterodimer) (lásd 18.1.1.4.). A szinergizmus jelensége a kialakuló transzkripciós regulációs komplexek együttes jelenlétének fokozott hatékonyságára utal (a külön-külön ható szabályozó fehérjékkel szemben, amire a prokarióta transzkripció szabályozása volt a példa).

Utolsónak említjük a szintén csak eukariótákra jellemző, a génektől (promóter elemek, ún. közeli szabályozó elemek + kódoló régió) távol eső DNS szabályozó elemeket (enhancer, silencer), amelyek úgy működnek, hogy a preiniciációs komplexszel transzkripciós kofaktorok kötik fizikailag össze (lásd Mediátor komplex), miközben a köztes DNS régió kihurkolódik.

18.3.2. Kromatin átrendeződés, remodellálás (remodeling)

Az eukarióta kromatin „kinézete” alapján a sejtbiológusok megkülönböztetnek a génexpresszió szempontjából teljesen inaktív heterokromatint és a nukleoszóma szerkezet alapján „lazább”, aktív génexpresszióra képes eukromatint. A génexpresszió szabályozása, a gének „bekapcsolása” az eukromatinban mehet végbe. A fő kérdés az, hogy milyen molekuláris mechanizmusok teszik aktívvá az eukromatint, mit jelent a kromatin átrendeződés (remodeling). Először tekintsük át röviden, hogy milyen kísérleti bizonyítékaink vannak a kromatin szerkezetének génexpresszióban betöltött szerepére.

18.3.2.1. A kromatin szerkezet génexpresszióban betöltött szerepének bizonyítékai

Az erősen kompakt (kondenzált szerkezetű) DNS kevéssé érzékeny a dezoxiribonukleáz-I (DN-áz I) enzimmel történő hasításra (lásd 14.2. fejezet). Kiderült, hogy aktív gének környékén a DN-áz több helyen vágja el a DNS-t. Ezeken az ún. DN-áz hiperszenzitív helyeken kevesebb nukleoszóma figyelhető meg, és azoknak is más a szerkezete. A hiperszenzitív helyek megjelenése sejt- és fejlődésfüggő: 20 órás csirke embriókban az vörösvérsejtek globin génjei nem érzékenyek a DN-áz kezelésre. Ellenben 35 óra után, amikor a hemoglobin megjelenik a sejtekben, ugyanezek a régiók DN-áz hiperszenzitívekké válnak. (Ezt a módszert már bemutattuk a 14.2. fejezetben az RNS-polimeráz kötőhelyének azonosítása kapcsán.)

Egy másik szép bizonyíték az élesztő galaktóz hasznosításában szerepet játszó géneket szabályozó GAL4transzkripciós faktor specifikus DNS kötésére vonatkozik. A GAL4 a CGG(N)11CCG szekvenciát ismeri fel (amelyhez homodimerként, egy-egy cink-ujj doménnel köt, lásd 18.23. ábra), amelyből az élesztő 12 Mbp méretű genomjában 4000 található. Egy ún. kromatin immunprecipitációs (ChIP) kísérlet segítségével kimutatták, hogy a GAL4 csak 10 ilyen szekvenciához kötődik, a többi a kromatin szerkezet gátló hatása miatt nem hozzáférhető sem a transzkripciós faktor, sem a transzkripciós gépezet számára.

A kísérlet során először a GAL4 fehérjét kovalensen hozzákötötték a DNS-hez, miután a sejtekből kromatint izoláltak (csak ott alakult ki keresztkötés, ahol már a mintában a GAL4 kapcsolódott a DNS-hez). A DNS-t ezután kis darabokra hasogatták (micrococcus nukleáz enzimmel), majd GAL4-specifikus antitestet adtak az emésztményhez, s az antitest-GAL4-DNS-fragmentum komplexet affinitás kromatográfiával tisztították, végül a benne lévő DNS szekvenciát meghatározták.

18.23. ábra: A GAL4 transzkripciós faktor atipikus cink-kötő doménekkel kötődik a DNS szabályozó régióihoz (PDB: 1D66)

18.23. ábra: A GAL4 transzkripciós faktor atipikus cink-kötő doménekkel kötődik a DNS szabályozó régióihoz (PDB: 1D66)

18.3.2.2. A hisztonok poszttranszlációs módosításának szerepe („hiszton-kód”)

Egyértelmű, hogy az aktív kromatin szerkezet kevésbé kondenzált, mint a heterokromatin. Ennek a hátterében mai tudásunk szerint elsősorban a nukleoszóma fehérjekomponenseinek poszttranszlációs (és részben a DNS posztreplikációs) kovalens módosulásai állnak.

Sokszor a nukleoszómák összetétele sem ugyanolyan az eukromatinban, mint a transzkripció szempontjából kevésbé aktív kromatinban (a H3 és a H2A hisztonokat a H3.3 és a H2AZ izoformák helyettesíthetik). De mitől lazul fel a kromatinszerkezet?

Először nézzük meg újból, hogy néz ki a nukleoszóma szerkezete (két-két H2A, H2B, H3 és H4 hiszton oktamere, amely köré balmenetes szuperhélixként 146 bázispár DNS tekeredik), s milyen a szerkezete a hisztonoknak (lásd 18.24. ábra).

A mondandónk szempontjából az fontos, hogy ezek a szerkezeti homológiát mutató, kisméretű globuláris bázikus fehérjék random szerkezetű farokrészekből és egy a-helikális központi doménből állnak. A nukleoszóma oktamer hiszton-magjának létrejöttében, és a DNS kötésben elsősorban az a-helikális központi domének vesznek részt, míg az N-terminális (és részben a C-terminális) farokrészek flexibilis módon kinyúlnak a nukleoszóma magjából. A terminális farokrészek oldalláncaira kerülnek reverzibilis kovalens szabályozással, poszttranszlációs módosítással funkcionális csoportok (lásd 17.3. fejezet).

18.24. ábra: A nukleoszóma (fent) és az egyes hiszton komponensek térszerkezete (lenn) (PDB: 1AOI)

18.24. ábra: A nukleoszóma (fent) és az egyes hiszton komponensek térszerkezete (lenn) (PDB: 1AOI)

A Lys és Arg oldalláncok metilálódnak, a Lys acetilálódik, a Ser és Thr oldalláncok foszforilálódnak. Az előbbi két csoport ubiquitinálódhat és sumoilálódhat is (lásd 18.25. ábra). (A SUMO – small ubiquitin-like modulator – az ubiquitinhez hasonló szerepű kis fehérje.)

18.25. ábra: A „hiszton-kód” molekuláris háttere.A nukleoszóma „mag” hisztonok N-terminális láncvégeinek az ábrán jelzett aminosav pozícióira acetil-, metil-, és foszforilcsoportok, valamint ubiquitin (és SUMO) fehérje kerülhet poszttranszlációs módosulással. A módosulások szabályozzák a nukleoszómához kötődő DNS régió génjeinek expresszióját.

18.25. ábra: A „hiszton-kód” molekuláris háttere. A nukleoszóma „mag” hisztonok N-terminális láncvégeinek az ábrán jelzett aminosav pozícióira acetil-, metil-, és foszforilcsoportok, valamint ubiquitin (és SUMO) fehérje kerülhet poszttranszlációs módosulással. A módosulások szabályozzák a nukleoszómához kötődő DNS régió génjeinek expresszióját.

A metilációt hiszton-metiltranszferázok (HMT) végzik. A H3 N-terminális metilált lizinek (Lys4 és Ly36) kötőhelyül szolgálnak egy hiszton-acetiláz enzim (HAT) számára, amely lizinek e-aminocsoportját acetilálja (lásd 18.26. ábra és 18.27. ábra).

18.26. ábra: A hiszton-acetiltranszferáz enzim által katalizált reakció

18.26. ábra: A hiszton-acetiltranszferáz enzim által katalizált reakció

Egy HAT térszerkezete, egy hiszton peptid és az Ac-CoA szubsztrát jelenlétében látható a 18.27. ábrán. Vegyük észre, hogy az acetiláció hatására a hiszton (és a nukleoszóma) felszínén egy pozitív töltés megszűnik, aminek következtében – a hiszton DNS-kötése (amihez jelentősen hozzájárul a negatív DNS gerinc és a pozitív hiszton felszín közötti elektrosztatikus vonzóerő) drasztikusan lecsökken, végső soron a kromatin fellazul, a transzkripciós masinéria átírhatja az így már hozzáférhető, „bekapcsolt” gén(eke)t.

A hiszton-dezacetiláz (HDAC) enzimek eltávolítják a hisztonokról és transzkripciós faktorokról az acetilcsoportot, ezáltal a géneket visszajuttatják inaktív állapotba. A gének „kikapcsolását”, represszálását további módosítások, többek között Lys és Arg oldalláncok metilálása fokozhatja (például a H3 Lys9 gyakran metilált a heterokromatin régióban). (Megjegyzendő, hogy a bázikus oldalláncok metilálása érdekes módon csak bizonyos géneket gátol, míg másokat aktivál.)

18.27. ábra: Egy hiszton-acetiltranszferáz enzim térszerkezete.Ábrázoltuk az enzim szubsztrátjait, az acetil-koenzim A-t és a H3 hiszton N-terminális láncvégét (a Lys, amire az acetilcsoport kerül, világoskék) (PDB: 1QSN).

18.27. ábra: Egy hiszton-acetiltranszferáz enzim térszerkezete. Ábrázoltuk az enzim szubsztrátjait, az acetil-koenzim A-t és a H3 hiszton N-terminális láncvégét (a Lys, amire az acetilcsoport kerül, világoskék) (PDB: 1QSN).

A létrejött acetil-Lys csoportoknak még egy fontos szerepük van, nevezetesen hozzájárulnak egy új kölcsönhatási felszín kialakításához, aminek a hatására a hisztonokhoz kötődhetnek a ~110 aminosavból álló ún. bromodomént tartalmazó transzkripciós faktorok és egyéb szabályozó fehérjék. Egy bromodomén térszerkezetét acetil-Lys-t tartalmazó peptiddel együtt a 18.28. ábra mutatja.

Bromodomén található például a bazális transzkripciós faktorok közül a promóterhez először kötő TFIID komplexben (ennek a komplexnek a része a TBP is, lásd 14.6.1. fejezet), aminek a segítségével olyan további transzkripció aktivátorokat tud a promóterhez toborozni, amelyeket a HAT enzimek előzőleg acetiláltak. Szintén bromodoménen keresztül kapcsolódik az aktiválandó kromatinrégióhoz - az acetilált hisztonokhoz - az átrendeződést végző remodelláló komplex (lásd 18.3.2.3).

18.28. ábra: Egy bromodomén térszerkezete.A kötőpartner fehérje egy rövid peptidszakaszával komplexben kristályosították a bromodomént (a peptid lila, az acetil-lizin sötétkék) (PDB: 1E6I).

18.28. ábra: Egy bromodomén térszerkezete. A kötőpartner fehérje egy rövid peptidszakaszával komplexben kristályosították a bromodomént (a peptid lila, az acetil-lizin sötétkék) (PDB: 1E6I).

Az ismertetett változatos kovalens módosítások olyan mintázatot eredményeznek, amely egyrészt kifinomult génexpresszió szabályozást tesz lehetővé, másrészt ez a módosítási mintázat öröklődhet is a sejtgenerációk során. Ezt az információt nevezték el a kutatók „hiszton-kódnak” (amit ma még teljes egészében nem értünk). A hiszton-kód is része lehet az ún. epigenetikai öröklésnek, ami olyan generációról generációra terjedő információt jelent, ami nem a DNS nukleotidok sorrendjében kódolt.

Az epigenetikai információ másik fontos molekuláris alapja a DNS posztreplikációs metilációja. Eukariótákban elsősorban a citozin 5-ös szénatomja metilálódik (lásd 18.29. ábra).

18.29. ábra: 5-metil-citozin

18.29. ábra: 5-metil-citozin

Az emlős genomok CpG szekvenciáinak ~70%-a metilált. Általában (bár nem kizárólagosan) a metiláció a gének aktivitásának csökkenéséhez vezet (másképpen fogalmazva, nehezíti a génaktivációt). Példa erre a β-globin gén, ami az aktívan expresszáló sejtekben erősen hipometilált, azaz alulmetilált. A metilcsoport a citozinról a DNS kettőshélix nagyárkába nyúlik be (legtöbbször), ami megnehezítheti egyes génexpressziót aktiváló transzkripciós faktorok kötődését.

Az emlős genomokban ún. CpG szigeteket lehet azonosítani, ami aktív géneket jelez, mivel a nem génközeli CpG szekvenciákban a citozin könnyen dezaminálódik (lásd 13.12.2.2. fejezet).

18.3.2.3. A remodelláló komplex működése

Miután a HAT enzimek fellazították a kromatint, bekapcsolódhatnak a kromatin aktív átrendezésébe a remodelláló (remodeling) komplexek, amelyek ATP energiájának felhasználásával (ATP-áz aktivitás) ténylegesen elmozdítják a hiszton mag köré tekeredett DNS szálakat. Öt ismert családjuk van, amelyek közül három bizonyosan részt vesz a kromatin mechanikai átrendezésén keresztül az eukarióta génexpresszió szabályozásában. Az SWI/SNF és az ISWI/NURF családot említjük meg. A számos alegységből álló motorkomplexek pontos működését nem ismerjük, jelenleg is intenzíven kutatják őket.

A kromatin áthelyeződés egy lehetséges modelljét a 18.30. ábra, míg remodelláláson keresztül történő transzkripció szabályozás általános sémáját a 18.31. ábra szemlélteti.

18.30. ábra: A remodelláló komplex működésének hipotetikus modellje.A komplex ATP-t felhasználva a nukleoszómát körülvevő DNS kettős szálat „túlcsavarja” (negatív szuperhélix), aminek következtében a hiszton-DNS kölcsönhatás meggyengül, és a relaxálódó DNS letekeredési hulláma elmozdítja a DNS-t a hiszton maghoz képest.

18.30. ábra: A remodelláló komplex működésének hipotetikus modellje. A komplex ATP-t felhasználva a nukleoszómát körülvevő DNS kettős szálat „túlcsavarja” (negatív szuperhélix), aminek következtében a hiszton-DNS kölcsönhatás meggyengül, és a relaxálódó DNS letekeredési hulláma elmozdítja a DNS-t a hiszton maghoz képest.

18.31. ábra: A kromatin remodellálás sémája.A gén aktiválásához szükség van a kromatin átrendeződésére (SWI/SNF remodelláló komplex), a hisztonok acetilálására (HAT), a transzkripciós aktivátorok és koaktivátorok kötődésére és esetenként a DNS-en belül citozinek metilálására. (forrás:http://en.wikipedia.org/wiki/File:Luong LD SA F2.jpg;Creative Commonslicensz)

18.31. ábra: A kromatin remodellálás sémája. A gén aktiválásához szükség van a kromatin átrendeződésére (SWI/SNF remodelláló komplex), a hisztonok acetilálására (HAT), a transzkripciós aktivátorok és koaktivátorok kötődésére és esetenként a DNS-en belül citozinek metilálására. (forrás: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Luong_LD_SA_F2.jpg; Creative Commons licensz)

18.3.3. Eukarióta transzkripciós faktorok, kofaktorok, komplexek

Az eukarióta transzkripciós faktorok (aktivátorok, represszorok) moduláris felépítésűek, általában DNS-kötő, ligandum-kötő (más szóval regulációs-) és transzaktivációs-doménből állnak (lásd 18.32. ábra). Ezeket a doméneket géntechnológiai módszerekkel szabadon lehet cserélgetni (domain swapping), ezáltal kísérleti célra új tulajdonságokkal rendelkező transzkripciós faktorokat előállítani.

A DNS-kötő doménjük (DBD) lehet hélix-kanyar-hélix (HTH), homeodomén, Zn-ujj, bázikus leucin-cipzár (bZIP) (lásd 18.1.1.). Nagy többségük homodimer, részleges palindrom szekvenciát ismernek fel. Sokszor hetero- és homodimer formában tudják kombinatorikus módon növelni a szabályozott gének számát illetve a szabályozás „finomhangolását”.

18.32. ábra: Eukarióta transzkripciós faktorok moduláris felépítés.DBD: DNS-kötő domén; LBD: ligandum-kötő (vagy regulációs) domén; TAD: transzaktivációs domén. A funkcionális modulok sorrendje változhat.

18.32. ábra: Eukarióta transzkripciós faktorok moduláris felépítés. DBD: DNS-kötő domén; LBD: ligandum-kötő (vagy regulációs) domén; TAD: transzaktivációs domén. A funkcionális modulok sorrendje változhat.

A transzaktivációs doménjük (TAD) is sokféle lehet. A szekvencia legjellemzőbb aminosavai alapján csoportosítjuk őket. A GAL4 élesztő TF-ben savas, a GCN4-ben hidrofób, az Sp1-ben Gln-gazdag, a CTF1-ben Pro-gazdag a TAD. A legkisebb méretű transzaktivációért felelős motívumcsalád mindössze 9 aminosavból áll (például az NF-κB transzkripciós faktorban).

A TAD vagy közvetlenül az RNS-polimeráz II enzimhez vagy a preiniciációs komplex valamelyik komponenséhez kötődik. Sokszor a TAD-on keresztül a transzkripciós aktivátor számos további szabályozó fehérjével képes kölcsönhatásra lépni, ezzel mintegy „toborozó” feladatot lát el. Az utóbbi fehérjék mintegy hidat képezhetnek a TF és az RNS-polimeráz II között. Ezek a fehérjék már a transzkripciós kofaktorok közé tartoznak (mivel közvetlenül nem kötődnek a DNS-hez; lásd 18.3.3.1).

Egy-egy TF az esetek nagy részében számos gén expresszióját tudja befolyásolni (általában aktiválni). Ne felejtsük el, hogy a TF-ek nem háztartási gének, az ő expressziójuk is szabályozott, általában valamilyen külső vagy belső jel hatására expresszálódnak. Az utolsónak említett NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) például az állatokat érő valamilyen sérülés vagy stressz hatására expresszálódik, s a nevének megfelelően az immunválaszban szereplő géneket aktivál. Hibás működése rákos, gyulladásos és autoimmun betegségekkel is kapcsolatba hozható.

Az eukarióta TF-ek DNS-kötőhelye jellemzően, bár nem mindig, részlegesen palindrom szekvenciából áll. Egy példát említve, az Sp1 transzkripciós aktivátor kötőhelyének konszenzus szekvenciája:

5' (G/T)GGGCGG(G/A)(G/A)(C/T)-3' (GC-box-nak is nevezik).

18.3.3.1. Transzkripciós kofaktorok: Mediátor komplex

A transzkripciós aktivátorok (ritkábban represszorok) és a transzkripciós gépezet (preiniciációs komplex, benne az RNS-polimerázzal) közötti kapcsolatot az esetek nagy többségében fehérje komplexek biztosítják. Ezen transzkripciós kofaktorok (koaktivátorok) közül a legismertebb a jelenleg is intenzíven kutatott Mediátor komplex. A komplexet (az RNS-polimeráz II működésének felderítéséért 2006-ban Nobel-díjban részesült) Roger Kornberg 1994-ben fedezte fel élesztőben. Azóta kiderült, hogy az eukarióták körében általánosan elterjedt, konzervatív szerkezetű és funkciójú fehérje komplex.

A Mediátor 25-30 fehérjeláncból álló nagy fehérje komplex (>1,5 MDa), szerkezetét atomi felbontásban még csak részlegesen ismerjük. A preiniciációs komplex kialakításában és a szabályozott transzkripcióban is fontos szerepet játszik. Nevének megfelelően az alapvető szerepe, hogy közvetítő szerepe van a DNS elemekhez kötődő transzkripciós faktorok és a promóteren kialakuló transzkripciós komplex között. A bazális transzkripciós komplexen a legfontosabb kölcsönhatást az RNS-polimeráz II C-terminális farokrészével (CTD) alakítja ki (emlékeztetünk rá, ennek a szerkezeti elemnek a foszforilációja szükséges a transzkripció iniciációból az elongációs fázisba történő átmenethez, lásd 14.6.1. fejezet). A komplex szerkezetét és kapcsolatát a preiniciációs komplexszel vázlatosan a 18.33. ábra mutatja.

18.33. ábra: A koaktivátor szerepet betöltő Mediátor-komplex vázlatos szerkezete(az atomi felbontású szerkezetét még nem ismerjük)

18.33. ábra: A koaktivátor szerepet betöltő Mediátor-komplex vázlatos szerkezete (az atomi felbontású szerkezetét még nem ismerjük)

18.3.3.2. A promótertől távoli DNS szabályozó elemek: enhancer, silencer

A transzkripciós faktorok kötőhelye sokszor nagy távolságban (több kilobázis) van a szabályozott gén promóterétől. Ezeket a DNS-elemeket, ha a jelenlétük fokozza az adott gén átírását enhanszernek (enhancer: fokozó, növelő), ha viszont - ritkábban - csökkenti, akkor silencer-nek (csendesítő) nevezzük. A promóterhez viszonyított helyzetük nem rögzített, attól 5’- és 3’-irányban is elhelyezkedhetnek, sokszor akár a gének kódoló régióján belül is. (Az élesztő géneknél a szakirodalom az UAS, (upstream activator sequences) elnevezést használja a promótertől távoli szabályozó elemekre.)

Hogyan tudják a nagy elsődleges szekvencia távolság ellenére ezek a DNS elemek a promóterek működését befolyásolni? A válasz a korábban leírtakból  következik: az enhanszer elemhez kötődik egy transzkripciós aktivátor fehérje, s a promóter régióval, az ott kialakuló preiniciációs komplex-szel a Mediátor komplex hoz létre fizikai kapcsolatot. A két cisz-elem között egy DNS hurok alakul ki. A kihurkolódást segítik egyes nem-hiszton kromatinkötő fehérjék, amelyek a HMGprotein (high mobility group) elnevezést kapták.

Az eukarióta gének szabályozásának legfontosabb komponenseit a 18.34. ábra és a 10. animáció szemlélteti. A transzkripció beindulásához legalább az alábbi fehérjék szükségesek: 1) bazális transzkripciós faktorok, 2) kromatin módosító enzimek és remodelláló komplexek, 3) a promóterhez közeli és távoli DNS szabályozó elemekhez (enhanszer) kötődő aktivátorok és/vagy represszorok, 4) transzkripciós kofaktorok, Mediátor komplex és további aktivátor vagy represszor kofaktorok.

18.34. ábra: Az eukarióta transzkripció szabályozási sémái (fent aktiváció, lent represszió).Az ábra bemutatja, hogy a promótertől távoli szabályozó helyek (enhanszerek) a DNS kihurkolódásával a Mediátoron keresztül hogyan befolyásolják a transzkripciót. A Mediátor általában az RNS-polimeráz C-terminális farokrészéhez (CTD) kötődik.

18.34. ábra: Az eukarióta transzkripció szabályozási sémái (fent aktiváció, lent represszió). Az ábra bemutatja, hogy a promótertől távoli szabályozó helyek (enhanszerek) a DNS kihurkolódásával a Mediátoron keresztül hogyan befolyásolják a transzkripciót. A Mediátor általában az RNS-polimeráz C-terminális farokrészéhez (CTD) kötődik.

18.3.4. Szteroid hormonok hatásmechanizmusa

A környezetből érkező jelekre bekövetkező sejtválasz igen gyakran génexpressziót igényel, azaz a jeltovábbítási (szignál transzdukciós) mechanizmusok a gének aktiválását vagy gátlását is eredményezhetik. A szignál transzdukciós folyamatok részleteiről ebben az e-könyvben nem lesz szó, de azt tudnunk kell, hogy a külső jelek gyakorlatilag minden esetben valamilyen receptorfehérjén keresztül „közlik az információt” a sejttel. A receptorok nagyobb hányada membránfehérje (lásd 11.5. fejezet), de van egy intracelluláris receptorcsalád is, az ún. nukleáris receptorok, amelyek a szteroid valamint a tiroid és retinoidhormonokra adott sejtválasz kiváltásának fő végrehajtói.

A receptorcsalád (emberben ~50 gén kódolja őket) neve utal arra, hogy ezek a szabályozó fehérjék ligandum-kötött formában a sejtmagon belül transzkripciós faktorként közvetlenül tudnak géneket be- és kikapcsolni (általában aktiválni).

A ligandumaik lipofil molekulák (néhánynak a szerkezeti képletét, és specifikus receptoruk nevét a 18.35. ábra mutatja be), tehát átdiffundálnak a sejtmembránon és vagy a citoszolban vagy a sejtmagban kötődnek a receptorukhoz, majd a ligandum-kötés kiváltotta konformációváltozás következtében felismerik a szabályozandó géneket és kötődnek hozzájuk. A sejtmagi receptorok DNS-kötőhelyét hormon válaszelemnek (HRE: hormone response element) nevezik.

18.35. ábra: Nukleáris receptorokhoz kötődő, transzkripciós faktorokon keresztül ható szabályozó lipidek.A feltüntetett szteroidok, trijódtrionin, D- és A-vitamin a nevük után feltüntetett nukleáris receptorhoz köt.

18.35. ábra: Nukleáris receptorokhoz kötődő, transzkripciós faktorokon keresztül ható szabályozó lipidek. A feltüntetett szteroidok, trijódtrionin, D- és A-vitamin a nevük után feltüntetett nukleáris receptorhoz köt.

Általában homo-, ritkábban heterodimerek, s a transzkripciós faktorokról eddig ismertetett tények nagyrészt igazak rájuk is. Az N-terminális doménjük (AF: aktivációs funkció) variábilis; a transzaktivációban vesz részt, valamint a transzkripciós kofaktorok részben ide kötődnek. A DBD cink-ujj típusú, viszonylag kisméretű, konzervált szerkezetű domén. Az ösztrogén receptor HRE szekvenciája:

5’-AGGTCANNNTGACCT-3’ (részleges palindrom).

A két cink-ujj a szomszédos nagyárokhoz köt (lásd 18.36. ábra). A többi nukleáris receptor is 6-6 nukleotidot ismer fel, de néhol az összekötő DNS szakasz hiányzik.

18.36. ábra: Az ösztrogén receptor transzkripciós faktor kötődése az ösztrogén válaszelemhez.A transzkripciós faktor cink-ujj doméneken keresztül kötődik a DNS-hez (a cinkionok szürkék) (PDB: 1HCQ).

18.36. ábra: Az ösztrogén receptor transzkripciós faktor kötődése az ösztrogén válaszelemhez. A transzkripciós faktor cink-ujj doméneken keresztül kötődik a DNS-hez (a cinkionok szürkék) (PDB: 1HCQ).

Az LBD a legváltozatosabb szerkezetű (a D-vitamin-kötő receptorban mindössze 25 aminosavból, míg a mineralokortikoid receptorban több mint 600 aminosavból áll), s a kismolekula ligandumokon kívül koaktivátorokat is köt. Az ösztrogén receptor LBD-je a-helikális harmadlagos szerkezetű (három rétegből álló, ún. a-helikális szendvicset alkot). A 18.37. ábra jól látszik a ligandum (ösztradiol) okozta konformációváltozás (csak egy alegységet ábrázoltunk).

18.37. ábra: Az ösztrogén-receptor ligandum-kötő doménje (LBD) ösztrogén apo formában (bal) és az ösztrogén ligandum jelenlétében (jobb).A ligandum-kötés (az ösztrogén piros) hatására a C-terminális hélix (lila) pozíciója jelentősen változik (PDB: 1A52 és 1ERE)

18.37. ábra: Az ösztrogén-receptor ligandum-kötő doménje (LBD) ösztrogén apo formában (bal) és az ösztrogén ligandum jelenlétében (jobb). A ligandum-kötés (az ösztrogén piros) hatására a C-terminális hélix (lila) pozíciója jelentősen változik (PDB: 1A52 és 1ERE)

A ligandum nélkül a globuláris fehérjéből kinyúló C-terminális α-hélix ösztradiol jelenlétében visszahajlik egy felszíni mélyedésbe. A változás következtében hozzáférhetővé válik egy kötőfelszín, amelyhez a p160 koaktivátor fehérjék (pl. SRC-1) kötődnek. Érdekes módon az ösztrogén-receptor a hormon kötődése nélkül is felismeri az ösztrogén válaszelemet, de génaktivációra csak a ligandum jelenlétében képes, miután kötődött hozzá egy koaktivátor (lásd 18.38. ábra).

Az ösztrogén válaszelem sok gén promóterénél megtalálható, amiből az is következik, hogy az ösztrogén hatása sejttípus függő (ez természetesen igaz az eukarióta transzkripciós faktorok zömére).

18.38. ábra: Az ösztrogén-receptorral a koaktivátor fehérje csak az ösztrogén kötődése után tud kölcsönhatásba lépni, s ezzel fokozni a szabályozott gén aktivitását

18.38. ábra: Az ösztrogén-receptorral a koaktivátor fehérje csak az ösztrogén kötődése után tud kölcsönhatásba lépni, s ezzel fokozni a szabályozott gén aktivitását

Az emlőszövet sejtjeinek rákos elváltozása sok esetben ösztrogén-függő (a mellrákok 70%-a ilyen; az aktivált receptor sejtproliferációt fokozó géneket aktivál). Ezeket a betegeket az ösztrogénnel kompetáló, antagonista gyógyszerrel, a tamoxifennel lehet kezelni. A hatásmechanizmust megérthetjük a 18.39. ábra alapján.

A gyógyszer kötődése (az ösztrogén helyére) megváltoztatja a C-terminális hélix pozícióját, amely így „elállja az útját” a koaktivátornak. (Érdekességként megjegyezzük, hogy a génexpresszió szabályozás komplexitását jelzi, hogy a tamoxifen az endometrium sejtekben viszont agonista hatású, azaz fokozza az ösztrogén hatását – amiből az is következik, hogy csak mellrák esetén van pozitív hatása.)

18.39. ábra: A tamoxifen mellrák gyógyszer és kötődése az ösztrogén-receptorhoz.A gyógyszermolekula (piros) kompetitív gátlószerként megakadályozza az ösztrogén kötődését, így a receptor génaktivátor hatása gátlódik (a koaktivátor nem tud kötődni) (PDB: 3ERT).

18.39. ábra: A tamoxifen mellrák gyógyszer és kötődése az ösztrogén-receptorhoz. A gyógyszermolekula (piros) kompetitív gátlószerként megakadályozza az ösztrogén kötődését, így a receptor génaktivátor hatása gátlódik (a koaktivátor nem tud kötődni) (PDB: 3ERT).