18.5. Szabályozott mRNS lebomlás: RNS interferencia

Utoljára maradt a mindössze másfél évtizede felfedezett transzlációs szintű szabályozási mód, az RNS interferencia (RNSi) bemutatása.

A jelenség felfedezéséért 2006-ban Andrew Fire és Craig Mello Nobel-díjat kapott. A két kutató modellorganizmusként a Caenorhabditis elegans nevű fonálférget használta. A kutatók kimutatták az 1990-es évek végén, hogy az állat testébe injektált kétszálú RNS az adott gén funkcióvesztéses mutációjához hasonló fenotípust eredményezett. (Az egyszálú minták esetén alig volt kimutatható hatás.) A kétszálú RNS tehát „interferált” a gén működésével. Fire és Mello más géneket „megcélozva” is megismételte a kísérletet, így kimutatták, hogy a jelenség általános, továbbá specifikus a megcélzott génre. Mivel az RNS interferenciához igen kis mennyiségű kétszálú RNS is elég volt, feltételezték, hogy valamilyen katalitikus komponens is szerepet játszik a jelenség mögötti molekuláris mechanizmusban.

A jelenséget egyébként először poszttranszkripciós géncsendesítés (PTGS) néven növényekben írták le a 90-es évek elején, de mára világossá vált, hogy az eukariótáknál általánosan elterjedt szabályozási mechanizmusról van szó, mely mögött a sejtekben szintetizálódó mRNS molekulákat lebontó enzimatikus mechanizmus áll. Ez az enzimrendszer számos fontos funkcióval rendelkezik, így például védelmet nyújt a vírusokkal, vagy a transzpozonokkal (mobil genetikai elemek) szemben, de elengedhetetlen számos gén működésének szabályozásához is. A legújabb kutatások szerint egyes esetekben az RNSi nem csak mRNS degradáción, hanem a közvetlenül a transzláció és a transzkripció gátláson keresztül is szabályozhatja a génexpressziót.

Napjainkra az RNS interferencia a génműködés tanulmányozásának fontos eszközévé is vált, sőt várható, hogy a jövőben a humán gyógyászatban is szerepet kap.

RNS interferenciát kétféle kis RNS válthat ki, kissé eltérő útvonalon. Az általában exogén eredetű kétszálú RNS prekurzorokból keletkező kis interferáló RNS-ek (siRNS; small interfering RNA) a vírusfertőzések, transzpozonok (ugráló gének) elleni védelem részét képezik. Ilyen kétszálú siRNS molekulákkal lehet (akár közvetlenül, akár rekombináns DNS-konstrukciók segítségével a sejtbe juttatva őket) az egyes gének szerepét vizsgálni a géncsendesítésnek (gene silencing, geneknockdown) nevezett géntechnológiai módszerrel (lásd 19.9.2. fejezet).

A másik kis RNS endogén génekről keletkező, egyszálú mikro-RNS (miRNS). A humán genom ~1000 mikro-RNS gént tartalmaz, s mai becslések szerint ezek az összes gén ~60%-ának expresszióját szabályozhatják. Elsősorban transzlációs represszión keresztül hatnak, de például a növényi miRNS-ek transzkripciós faktorként is működhetnek. Ki kell emelnünk, hogy újabban a miRNS-eket számos betegség, így tumorok kialakulásával is kapcsolatba hozták.

A miRNS gének vagy fehérjét kódoló gének intronjain belül vagy gének között (intragénikus régiókban) helyezkednek el, többségüket az RNS-polimeráz II írja át. A primer transzkriptumról (pri-miRNS) az 5’-sapka és a poliA-farok egy endonukleáz komplex (Drosha/Pasha) segítségével még a sejtmagon belül lehasad, majd a pre-miRNS a citoplazmába kerül (lásd 18.43. ábra).

A további molekuláris történések során először a pre-miRNS-t és az exogén eredetű kétszálú RNS-t is a Dicer nevű enzim endonukleáz aktivitással hasítja. A hasítás eredményeképpen 20-25 (leggyakrabban 21) nukleotidból álló kétszálú siRNS-ek keletkeznek, amelyeket Watson-Crick bázispárok tartanak össze, úgy hogy, a végeken két 3’-túlnyúló nukleotid marad. A pre-miRNS-ből a Dicer egyszálú miRNS-t állít elő.

A siRNS és a miRNS is végül beépül a RISC (RNA-induced silencing complex) komplexbe, ahol bázispárosodik a komplementer mRNS szállal. A komplex Argonauta nevű komponense az mRNS szálat több helyen elhasítja (lásd 18.43. ábra).

18.43. ábra: Az RNS interferencia két útvonalának vázlatos sémája.Az exogén kettős-szálú RNS (dsRNS)-t és a génekről átírt, a sejtmagban részben processzálódó pre-mikro-RNS-t is a Dicer endonukleáz processzálja tovább a citoplazmában. A kétszálú siRNS és az egyszálú miRNS is a RISC enzim komplexre kerül, ahol a vele komplementer mRNS szálakkal bázispárosodik és fragmentálódik. A RISC endonukleáz komponense az Argonauta fehérje.

18.43. ábra: Az RNS interferencia két útvonalának vázlatos sémája. Az exogén kettős-szálú RNS (dsRNS)-t és a génekről átírt, a sejtmagban részben processzálódó pre-mikro-RNS-t is a Dicer endonukleáz processzálja tovább a citoplazmában. A kétszálú siRNS és az egyszálú miRNS is a RISC enzim komplexre kerül, ahol a vele komplementer mRNS szálakkal bázispárosodik és fragmentálódik. A RISC endonukleáz komponense az Argonauta fehérje.

A miRNS és a célszekvencia között csak részleges a bázispárosodás, ezért egy miRNS több mRNS transzlációját is represszálhatja. Ezzel szemben az siRNS irányító (guide) szála csak teljes komplementaritás esetén kötődik cél mRNS-hez, ezért ezen az útvonalon csak egyféle mRNS degradálódik. Ezért lehetséges a géncsendesítéssel (knockdown) egyenként vizsgálni a géntermékek hatását sejtkultúrákban és in vivo modell organizmusokban is (C. elegans, Drosophila, Arabidopsis).

A Dicer és az Argonauta fehérjék kristályszerkezetét a 18.44. ábra mutatja be.

18.44. ábra: A Dicer és az Argonauta endonukleázok doménszerkezete.Az Argonautához kötődő miRNS és a vele komplementer mRNS kettőshélixet alkot (PDB: 2FFL és 3HK2)

18.44. ábra: A Dicer és az Argonauta endonukleázok doménszerkezete. Az Argonautához kötődő miRNS és a vele komplementer mRNS kettőshélixet alkot (PDB: 2FFL és 3HK2)

Mindkét enzim rendelkezik endonukleáz doménnel (az ábrán világoskék színnel kiemelve), ahol RNS foszfodiészter kötések hasadnak. Az Argonauta protein a RISC komplex kulcs komponense: RNS-kötő fehérjék, a felszínükön ismerik fel egymást a cél mRNS és az siRNS. Ezen kívül endonukleáz aktivitásuk van, tehát az mRNS hasítását is végzik. A két RNS lánc kettőshélix konformációban van az enzim felszínén, amely az A-DNS formához hasonlít. Az Argonauta katalitikus aktivitáshoz két Mg2+-ionra is szükség van.