19. fejezet - A géntechnológia alapjai

Tartalom

19.1. A géntechnológia célja és módszerei
19.2. Rekombináns DNS előállítása és felszaporítása: molekuláris klónozás
19.2.1. Restrikciós endonukleázok, a rekombináns DNS előállítás legfontosabb eszközei
19.2.2. Rekombináns DNS in vitro előállítása
19.2.3. A molekuláris klónozás lépései
19.2.4. A vektor DNS-ek típusai
19.2.5. Rekombináns DNS könyvtárak
19.3. Hibridizációs technikák
19.3.1. A Southern- és Northern-blot technika és az RFLP módszer
19.3.2. DNS-chip (microarray) technika
19.4. Polimeráz láncreakció (PCR)
19.5. DNS-szekvenálás
19.5.1. A Sanger-féle láncterminációs (didezoxi-) szekvenálás
19.5.2. Automata fluoreszcens szekvenálás
19.5.3. Új-generációs szekvenálás
19.6. Irányított in vitro mutagenezis
19.6.1. Hely-specifikus mutagenezis Kunkel-módszerrel
19.7. Rekombináns fehérjék előállítása
19.7.1. Prokarióta expressziós rendszerek
19.7.2. Rekombináns fehérjék előállításának további lehetőségei
19.8. Transzgenikus élőlények és génterápia
19.8.1. Transzgenikus állatok
19.8.2. Transzgenikus növények
19.8.3. Génterápia
19.9. Célzott génmódosítás in vivo: génkiütés és géncsendesítés
19.9.1. Génkiütés (knockout) egérben
19.9.2. Géncsendesítés (gene silencing, knockdown)

(szerző: Nyitray László)

A „klasszikus” biokémia korában a makromolekulák között is óriásnak számító DNS izolálása és vizsgálata a fehérjéknél ismertetett módszerek (lásd 6. fejezet) segítségével csak korlátozottan volt lehetséges, a génekben rejlő információt, a nukleotidok sorrendjét sem lehetett meghatározni. Az utóbbit a 1970-es évek második felére megszülető géntechnológia tette lehetővé. Az újonnan kifejlesztett módszerek - és nem túlzás ez a kifejezés - forradalmasították a molekuláris biológiai kutatásokat.

De mit is jelent a géntechnológia (amit neveznek „génsebészetnek” vagy kissé pejoratív kifejezéssel „génmanipulációnak” is)? Elsősorban a rekombináns DNS technikákat értjük alatta, azt a lehetőséget, hogy egyrészt speciális enzimek segítségével DNS molekulákat lehet „szabni-varrni”, másrészt specifikus DNS szekvenciákat lehet olyan mennyiségben előállítani, amiből meghatározható az elsődleges szekvencia (DNS-szekvenálás) és amelyet a fejezetben ismertetett számos más módszerhet fel lehet használni.

A „szabás-varrás” eredménye a rekombináns DNS, amelyben több különböző eredetű DNS szakasz „kombinálódik”, s amelyet a molekuláris klónozásnak nevezett eljárással szaporítottak fel. Ezekkel az alapmódszerekkel és néhány további géntechnológiai alkalmazással ismerkedünk meg ebben a fejezetben. Felhívjuk az olvasó figyelmét, hogy erről a témakörről sokkal részletesebb információkhoz juthat egy, az ELTE Biokémiai Tanszék szerzőgárdája által írt, a világhálón szintén elérhető elektronikus tankönyvből („Géntechnológia és fehérjemérnökség”).

19.1. A géntechnológia célja és módszerei

A rekombináns DNS technikák segítségével az alább felsorolt kísérleteket lehet elvégezni.

·      Egy specifikus DNS-szakasz (pl. egy gén) felszaporítása. Erre két lehetőség van: a gazdasejtet igénylő molekuláris klónozás (in vivo módszer) és az in vitro kivitelezhető polimeráz láncreakció.

·      A klónozott DNS információtartalmát meg lehet határozni. Ez a DNS-t felépítő nukleotidok sorrendjének megállapítása, tehát a DNS-szekvenálása. Korábban már írtunk róla, hogy a fehérjék aminosavsorrendjét manapság egyszerűbb az őket kódoló gének szekvenálásával meghatározni. A DNS-szekvenálás segítségével ma már teljes genomok információtartalmát is ki lehet nyerni (genom projektek).

·      Rekombináns fehérjéket lehet előállítani, azaz valamilyen gazda élőlényben kifejeztetni (expresszálni) a vizsgálandó fehérje génjét egy rekombináns DNS konstrukcióról. A rekombináns fehérjét aztán ugyanazokkal a módszerekkel lehet vizsgálni, amiket 6. fejezetben megismertünk. Fontos tudnunk, hogy a rekombináns fehérje szekvenciája pontosan megegyezhet a természetes forrásból izolált fehérjével, tehát a rekombináns DNS-sel ellentétben itt nem különböző eredetű polipeptidlánc szakaszok kapcsolódnak össze.

·      In vitro irányított mutagenezissel megváltoztatható a gének információtartalma (szekvenciája), azért, hogy egyrészt a módosított gének segítségével megértsük a működésüket, másrészt akár megváltozott tulajdonságú fehérjéket hozzunk létre. Azok a kísérletek, amelyek során (akár alap-, akár alkalmazott kutatási céllel) egy megváltoztatott szekvenciájú génről helyspecifikus változásokat tartalmazó rekombináns fehérjéket állítanak elő, a fehérjemérnökség (protein engineering) tárgykörébe tartozik.

·      A géneket és az mRNS átiratokat is specifikusan tönkre lehet tenni egyes élőlényekben. A géneket a „génkiütés”-nek (KO: knock out), az mRNS-eket a „géncsendesítés”-nek (gene knock down) nevezett módszerrel lehet inaktiválni.

·      Géneket lehet egyenként bejuttatni bármilyen élőlénybe, s az így előállított transzgenikus állatokat, növényeket, mikrobákat (ezek GMO-k: genetikailag módosított organizmusok) kutatási célra felhasználni vagy valamilyen alkalmazott tudományág szolgálatába állítani, illetve a gyakorlatban is alkalmazni – gondoljunk csak a vitákra és parlamenti határozatokra a GMO-növények európai és hazai termesztéséről.

·      A legambiciózusabb géntechnológiai alkalmazás hibás humán gének, genetikai betegségek kijavítását célozza meg (génterápia).