19.2. Rekombináns DNS előállítása és felszaporítása: molekuláris klónozás

Specifikus DNS szekvenciák felszaporítása (amplifikációja) alapvetően kétféle módon történhet, vagy valamilyen gazdaszervezetben történő molekuláris klónozással, vagy az adott DNS szakaszok in vitro amplifikációjával, amire az ún. polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction, PCR) szolgál. Utóbbi bemutatására a 19.4. fejezetben kerül sor.

A rekombináns DNS-konstrukciók a klónozni kívánt DNS-szakasz (inszert) és a választott gazdaszervezetben történő felszaporításhoz szükséges vektor (hordozó) DNS összekapcsolásával jönnek létre. Tehát:

rekombináns DNS = vektor DNS + inszert DNS

A molekuláris klónozás nem más, mint egy specifikus inszertet tartalmazó rekombináns DNS felszaporítása megfelelő gazdasejtben (pl. Escherichia coli). Ezeknek a sejteknek a klónjaiból (bakteriális kolóniák) izolálják a rekombináns DNS-t, ami a molekuláris klón lesz.

(A „klónozás” szó egymással azonos, közös eredetű kópiák létrehozását jelenti. Eredeti jelentése a biológiában: egyetlen sejt vagy organizmus (aszexuális) elszaporítása olyan módon, hogy genetikailag azonos sejtek illetve élőlények homogén populációi jöjjenek létre.)

A klónozás sémájának és lépéseinek részletezése előtt ismerkedjünk meg a „génsebészet” legfontosabb enzimeivel, a restrikciós endonukleázokkal.

19.2.1. Restrikciós endonukleázok, a rekombináns DNS előállítás legfontosabb eszközei

A tudomány nagy szerencséje, hogy a baktériumokban működik egy idegen DNS-ek ellen kialakult védekező mechanizmus, az ún. restrikció-modifikáció, amelyet bakteriofágok gazdasejt-specifitása alapján fedezett fel Werner Arber a hatvanas években.

Megfigyelte, hogy az E. coli K12 törzsben felszaporított bakteriofágok alacsony hatásfokkal fertőznek egy másik törzset, az E. coli B-t, és ugyanez történik megfordítva is. Ha viszont megtörténik a keresztfertőzés, az újonnan termelt fágok már jól szaporodnak az új gazdasejtben, és alacsony hatásfokkal fertőzik az eredeti gazdasejtet, amiben korábban jól szaporodtak. A rendszernek két eleme van, egy restrikciós endonukleáz és egy annak megfelelő módosító DNS-metiláz enzim.

A restrikciós endonukleáz felismer egy specifikus, 4-8 bázisnyi DNS szekvenciát és hasítja a DNS mindkét szálát. A módosító metiláz ugyanebben a szekvenciában metilál egy adenint (az aminocsoporton), vagy egy citozint (az 5. szénen vagy az aminocsoporton). Az így módosított szekvenciát már a restrikciós endonukleáz nem tudja elhasítani. A két enzim együttesen van jelen a sejtben, és jelenlétük törzs-specifikus. A rendszer működésének lényege: a baktérium genomiális DNS-e metilált, tehát hasítással szemben védve van. A replikációkor újonnan szintetizált nem-metilált szál a régi metilálttal párt alkotva szintén védve van.

A fágból származó DNS, feltéve hogy más baktérium törzsből érkezik, nincs metilálva ugyanezeknél a specifikus szekvenciáknál (máshol viszont lehet, hogy igen), ezért nagy valószínűséggel elhasítja a gazdasejt restrikciós endonukleáza. Kis valószínűséggel ugyan, de előfordul, hogy a metiláz találja meg előbb ezeket a szekvenciákat, és még a hasítás előtt módosítja a megfelelő bázisokat. Ezek a fágok az új gazdasejtben védve lesznek, és replikálódhatnak. A keletkező új fágok DNS-e már az új gazdasejtre jellemző metilázzal lesz védve, ezért elveszíti a védelmet a korábbi gazdasejt restrikciós endonukleázával szemben.

Az első restrikciós endonukleázt Hamilton Smith és Daniel Nathans izolálták az 1960-as évek végén. Mára ~3000 restrikciós enzimet fedeztek fel, melyek több mint 250 különböző szekvenciát ismernek fel.

A restrikciós endonukleázok neve az enzimet termelő mikroba nemzettségének első betűjéből és a fajnév első két betűjéből áll, amit a törzs vagy szerotípus nevéből eredő betű követ, majd egy római szám, ami azt jelzi, hogy az adott törzsből hányadiknak izolálták az adott enzimet. Például a BamHI enzim a Bacillus nemzetség amyloliquefaciens faj H törzsének első izolátuma, az EcoRI az Escherichia nemzetség coli faj R törzsének első, míg az EcoRV az ötödik izolátuma.

A restrikciós endonukleázok (röviden restrikciós enzimek) dimer fehérjék, a kétszálú DNS molekulák foszfodiészter kötéseit hidrolizáló enzimek. Az enzimek többsége középpontosan szimmetrikus palindrom szekvenciát ismer fel. Ha a DNS két szálának elhasítása egymással szemközti foszfodiészter-kötéseknél történik, ún. tompa végek (blunt end) keletkeznek. Ha azonban egymáshoz képest elcsúsztatva, néhány bázissal távolabb van a felismerőhely a szimmetriatengelytől, úgy ragadós végek (sticky end) jönnek létre.

A 19.1. ábra az egyik leggyakrabban használt restrikciós endonukleáz, a ragadós végeket eredményező EcoRI felismerőhelyét és a homodimer enzim térszerkezetét mutatja be. A GAATTC palindrom szekvenciát felismerő enzim a guanozin és adenozin nukleotidok között hasítja el a cukorfoszfát gerincet (egyszerű felírással: G/AATTC), ezáltal 5‘-túlnyúló ragadós végek jönnek létre.

19.1. ábra: Az EcoRI restrikciós endonukleáz felismerőhelye és térszerkezete.A dimer enzim szimmetrikusan kötődik a palindrom felismerőhelyhez, ezáltal mindkét szálon ugyanazt a kötést tudja elhasítani. Ez a szimmetria jól látszik az aktív hely működéséhez szükséges magnéziumionok (lila) pozícióján (PDB: 1ERI).

19.1. ábra: Az EcoRI restrikciós endonukleáz felismerőhelye és térszerkezete. A dimer enzim szimmetrikusan kötődik a palindrom felismerőhelyhez, ezáltal mindkét szálon ugyanazt a kötést tudja elhasítani. Ez a szimmetria jól látszik az aktív hely működéséhez szükséges magnéziumionok (lila) pozícióján (PDB: 1ERI).

A 19.1. táblázatban néhány ragadós illetve tompavéget kialakító enzimet és felismerőhelyüket tüntettük fel.

19.1. táblázat: Néhány restrikciós endonukleáz és felismerőhelyük

19.1. táblázat: Néhány restrikciós endonukleáz és felismerőhelyük

A restrikciós emésztéssel előállított DNS fragmentumokat gélelektroforézissel lehet szeparálni és a méretüket is meghatározni. Mivel még a DNS fragmentumok is jóval nagyobbak a fehérjemolekuláknál (gondoljunk bele, egy mindössze 1 kbp-ból álló relatíve kicsi DNS darab molekulatömege 1000 x 350 x 2 (350 Da a nukleotidok átlagos mérete), azaz 700 kDa, ami nagyobb, mint például a nagy fehérjének számító izom miozin molekulatömege), ezért a poliakrilamid helyett nagyobb „lyukméretű” térhálós polimert kellett találni. Ez a természetes eredetű agaróz (lásd 10.3. fejezet), s ennek megfelelően a DNS fragmentumokat agaróz gélelektroforézissel szeparálják. A kétszálú lineáris DNS fragmentumok vándorlási sebessége fordítottan arányos a bázispárok (pontosabban a nukleotidok) számának logaritmusával. A DNS-t a gélben egy fluoreszkáló festék, az etídium-bromid segítségével lehet láthatóvá tenni (lásd 19.2. ábra).

Ismert méretű DNS-ek segítségével ismeretlen DNS darabok mérete meghatározható. Különböző restrikciós enzimek külön-külön illetve együttes használatával ezek hasítási pozícióinak egymáshoz képesti elrendeződése felderíthető. Ez az úgynevezett restrikciós térképezés. Egy ilyen restrikciós analízis eredményét mutatja a 19.2. ábra.

19.2. ábra: DNS fragmentumok agaróz elektroforézissel elválasztva és a DNS festék etídium-bromid szerkezete

19.2. ábra: DNS fragmentumok agaróz elektroforézissel elválasztva és a DNS festék etídium-bromid szerkezete

19.2.2. Rekombináns DNS in vitro előállítása

A restrikciós enzimekkel létrehozott ragadós végek Watson-Crick bázispárosodással könnyen felismerik egymást. Különböző eredetű DNS-eket azonos enzimmel hasítva olyan DNS darabok jönnek létre, melyek könnyen egymáshoz illeszthetők. A DNS-ligáz enzim (ATP-t vagy NAD-ot energiaforrásként felhasználva) képes ezeket a darabokat foszfodiészter kötések révén összekapcsolni. A DNS-ligáz tehát in vitro rekombinációval hibrid (vagy más néven kiméra) molekulákat, azaz rekombináns DNS-t hozhat létre, mint azt a 19.3. ábra szemlélteti. (Természetesen az eredetileg szétvágott DNS fragmentumok is felismerhetik egymás – ebben az esetben az eredeti DNS-t is kapjuk vissza a ligálás végén.)

19.3. ábra:In vitrorekombináció.Két különböző eredetű DNS hasítása EcoRI restrikciós endonukleázzal. A létrejövő DNS fragmentumok egymást felismerő ragadós végekkel rendelkeznek. Összekapcsolásuk DNS-ligáz segítségével történik. Amennyiben a két különböző eredetű DNS-vég kapcsolódik össze,in vitrorekombináció történik.

19.3. ábra: In vitro rekombináció. Két különböző eredetű DNS hasítása EcoRI restrikciós endonukleázzal. A létrejövő DNS fragmentumok egymást felismerő ragadós végekkel rendelkeznek. Összekapcsolásuk DNS-ligáz segítségével történik. Amennyiben a két különböző eredetű DNS-vég kapcsolódik össze, in vitro rekombináció történik.

A molekuláris klónozás in vitro szakaszában jön létre a rekombináns DNS. A hordozó DNS leggyakrabban egy cirkuláris plazmid vektor (a klónozó vektorokat a 19.2.4. alfejezetben mutatjuk be), míg a vizsgálandó DNS lehet egy eukarióta kromoszóma DNS egy fragmentuma. Példaként egy olyan klónozási stratégiát mutatunk be, ahol az inszertet a kromoszómális DNS-ből két különböző restrikciós enzimmel hasították ki. Ha a vektort és a klónozandó DNS-t ugyanazon két restrikciós enzimmel linearizálják (a cirkuláris DNS molekulából lineáris DNS fragmentumok keletkeznek), és a tisztított hasítási termékeket összekeverik, a DNS-ligáz a kémcsőben lezajló reakció során gyakorlatilag csak ezt a kétféle eredetű DNS-t képes egymáshoz kapcsolni, ezáltal rekombináns DNS jön létre, mint azt a 19.4. ábra mutatja.

A folyamat molekuláris grafikai ábrázolását, kiemelve egy restrikciós enzim, az EcoRI és a DNS-ligáz működését, a 11. animáció mutatja be.

A kromoszómális (genomiális) DNS-t hasítva egy-egy enzimre nézve megbecsülhető a keletkező DNS fragmentumok várható átlagos mérete. Ez az enzim felismerőhelyének hosszától függ. A fragmentumok átlagos mérete 4n, ahol „n” a felismerőhely bázispár-száma. Egy hatos felismerőhelynél 46 = 4096 az átlagos fragmentumok méret.

19.4. ábra: Rekombináns DNS létrehozása irányított klónozással.A plazmid vektort és a kromoszómális DNS-t is ugyanazzal a kétféle restrikciós enzimmel hasítjuk. Az egyik végén "ragadós" (EcoRI), a másik végén "tompa" végű (DraI) DNS molekulákat a DNS-ligáz kovalens összekapcsolja, ezzel létrejön a rekombináns DNS.

19.4. ábra: Rekombináns DNS létrehozása irányított klónozással. A plazmid vektort és a kromoszómális DNS-t is ugyanazzal a kétféle restrikciós enzimmel hasítjuk. Az egyik végén "ragadós" (EcoRI), a másik végén "tompa" végű (DraI) DNS molekulákat a DNS-ligáz kovalens összekapcsolja, ezzel létrejön a rekombináns DNS.

19.2.3. A molekuláris klónozás lépései

A DNS klónozás in vivo szakasza a rekombináns DNS gazdasejtbe juttatása és felszaporítása. A DNS sejtekbe juttatására többek között a bakteriális transzformáció jelenségét lehet kihasználni (lásd 12.2.1. fejezet).

A transzformálás során a sejtek plazmamembránját a DNS számára átjárhatóvá teszik kémiai módszerekkel (ún. kompetens sejteket állítunk elő), és a sejtet együtt inkubálják a plazmiddal. A sejtek egy kis hányada ilyenkor plazmidot vesz fel. Egy nagyobb hatékonyságú eljárás az elektroporálás, amikor a DNS-t rövid idejű, nagyfeszültségű elektromos impulzussal juttatják a sejtbe (a nagy térerő hatására, csak az impulzus idejére pórusok nyílnak a sejtmembránon, amiken átdiffundál a DNS).

Egy baktérium sejt általában csak egyetlen rekombináns DNS-t vesz fel. Mivel a transzformáció hatásfoka alacsony, szükség van valamilyen szelekciós eljárása. A vektor tartalmaz egy antibiotikum elleni védelmet biztosító gént (antibiotikum rezisztencia gén), amely megfelelően választott körülmények között szelektív túlélést tesz lehetővé a rekombináns DNS-t hordozó sejtek számára.

A transzformálás után a sejteket olyan, antibiotikumot tartalmazó, szelektáló táptalajra helyezik, ahol csak a rekombináns DNS-t (és így az adott antibiotikumra rezisztenciát biztosító gént) tartalmazó sejtek képesek szaporodni. Minden sejtből egy kolónia keletkezik (amely genetikailag azonos sejtekből, klónokból áll). Egy-egy kolónián belül azonos rekombináns DNS-t tartalmazó sejtek vannak. A folyamat sémáját a 19.5. ábra mutatja be. Az ábra jobb oldalán baktériumkolóniákat (rekombináns DNS klónokat) látunk egy Petri-csészében lévő agar lemezen.

A bakteriális klónokat folyadékkultúrában tovább lehet szaporítani és a sejtekből a rekombináns DNS-t, azaz a molekuláris klónokat egyszerű eljárással izolálni lehet. Néhány milliliter, baktériumokkal telített tápfolyadékból akár több 10 mg rekombináns DNS is előállítható, amely elegendő mennyiség a DNS-szekvenáláshoz és további vizsgálatokhoz.

19.5. ábra: A molekuláris klónozás elvi vázlata.A rekombináns DNS-t transzformációval juttatjuk azE. coligazdasejtbe, ahol az a baktériumsejt kromoszómájától (amit nem ábrázoltunk) függetlenül replikálódik és több kópiában lesz jelen az utódsejtekben, ezzel is hozzájárulva a DNS klón felszaporításához (amplifikáció). A különböző inszerteket tartalmazó baktériumok egyedi klónok. A kromoszóma egészét darabokban tartalmazóE.coliklónok összessége a genomiális könyvtár (ld.19.2.5.1).

19.5. ábra: A molekuláris klónozás elvi vázlata. A rekombináns DNS-t transzformációval juttatjuk az E. coli gazdasejtbe, ahol az a baktériumsejt kromoszómájától (amit nem ábrázoltunk) függetlenül replikálódik és több kópiában lesz jelen az utódsejtekben, ezzel is hozzájárulva a DNS klón felszaporításához (amplifikáció). A különböző inszerteket tartalmazó baktériumok egyedi klónok. A kromoszóma egészét darabokban tartalmazó E.coli klónok összessége a genomiális könyvtár (ld. 19.2.5.1).

A szelekcióhoz leggyakrabban használt antibiotikum a penicillin származék ampicillin, egy béta-laktám vegyület (lásd 19.6. ábra), amely kötődik és ún. öngyilkos szubsztrátként gátolja a sejtfal peptidoglikán szintézisben szerepet játszó transzpeptidáz enzimet, és ezáltal gátolja a baktérium növekedését (lásd 10.4.1. fejezet). Az ampicillin elleni rezisztenciát a béta-laktamáz enzim biztosítja, amely képes elhasítani a béta-laktámgyűrűt, ezáltal hatástalanítja a molekulát.

19.6. ábra: Az ampicillin szerkezeti képlete

19.6. ábra: Az ampicillin szerkezeti képlete

Alább felsorolunk néhány további, a transzformáció során szelekcióra használt antibiotikumot és rezisztencia génjeiket:

A kloramfenikol bakteriosztatikus képességének molekuláris háttere, hogy a riboszóma komplex 50S alegységéhez köt, így gátolja a fehérjeszintézist. A kloramfenikol rezisztencia gén egy kloramfenikol-acetiltranszferáz enzimet kódol, amely úgy képes inaktiválni az antibiotikumot, hogy egy acetilcsoportot helyez rá. Egy másik fehérjeszintézis gátló antibiotikum a tetraciklin, egy poliketid típusú természetes antibiotikum. Az aminoacil-tRNS mRNS-riboszóma komplexhez való kötődését gátolja a 30S alegységhez kötődve. A tetraciklin rezisztenciát egy 40 kDa-os membránfehérje biztosítja, amely aktív módon kipumpálja az antibiotikumot a sejtből. A kanamicin és a vele rokon neomicin szintén a prokarióta riboszóma 30S alegységéhez köt, és ott transzlációs hibát indukál, amellyel gátolja a fehérjék átíródását. Mindkét antibiotikum aminoglikozid típusú szer, inaktiválásukat egy acetil-transzferáz enzim végzi.

19.2.4. A vektor DNS-ek típusai

A vektorok az egyes gazda szervezetek DNS információjának módosításához használt általános géntechnológiai eszközök, a klónozandó DNS (az inszert) hordozómolekulái.

A vektorokat felhasználásuk alapján két nagy csoportra oszthatjuk. Az első csoportba a klónozó vektorok tartoznak, melyeket specifikus DNS információ tárolására, sokszorosítására használhatunk fel. Milyen tulajdonságokkal kell rendelkezni egy DNS molekulának, hogy vektor céljára használhassuk?

A vektor DNS-nek a gazdaszervezetben önálló replikációra kell képesnek lennie (replikon). Lehetőleg legyen kis mérete (2-10 kbp), s több kópiában replikálódjon. Minden vektornak egyedi restrikciós helyekkel, ún. klónozó helyekkel kell rendelkeznie. Legtöbbször ezek multiklónozó (poliklónozó) helyek (MCS: Multiple Cloning Site), amelyek a vektorban csak egyszer előforduló, egymás mellett elhelyezkedő különböző restrikciós endonukleáz felismerő helyek. Végül a vektornak kell tartalmazni legalább egy szelekciós marker gént, amely célra általánosan antibiotikum rezisztencia géneket használnak.

Egy már géntechnológiai úton létrehozott klónozó vektor (a 2,7 kbp méretű plazmid, a pUC18) egyszerűsített vektor térképét a 19.7. ábra mutatja be.

19.7. ábra: Egy klónozó vektor térképe és multiklónozó helye.Mivel a plazmid vektorok cirkuláris DNS-ek, a vektor térkép egy kör, amin feltüntetik a DNS-ben található géneket, szabályozó elemeket (ori: replikációs origó, promóter) valamint a klónozóhelyeket. AmpR: ampicillin rezisztencia gén; MCS: multiklónozó hely.

19.7. ábra: Egy klónozó vektor térképe és multiklónozó helye. Mivel a plazmid vektorok cirkuláris DNS-ek, a vektor térkép egy kör, amin feltüntetik a DNS-ben található géneket, szabályozó elemeket (ori: replikációs origó, promóter) valamint a klónozóhelyeket. AmpR: ampicillin rezisztencia gén; MCS: multiklónozó hely.

Az ori az önálló replikációt biztosító replikációs origót jelöli. Ez nem egyezik meg az E. coli kromoszóma replikációs origójával (lásd 13.4. fejezet), aminek a fontos következménye az lesz, hogy a vektor DNS a kromoszóma DNS-től függetlenül replikálódik, s több példányban is jelen lehet a baktériumsejtben. Az ampR az ampicillin antibiotikum elleni rezisztencia gént, a szelekciós markergént jelöli. Az MCS-t az E. coli lac-operon lacZ génjének 5’-régiójába illesztették be. Ennek a jelentőségét később magyarázzuk el.

A vektorok másik nagy csoportjába az expressziós vektorok tartoznak. Ezek a DNS konstrukciók olyan szabályzó elemeket tartalmaznak, amelyek lehetővé teszik, hogy a bennük tárolt DNS információ (az inszert) képes legyen fehérjeként kifejeződni, expresszálódni. Az expressziós vektoroknak tartalmazniuk kell a klónozó hely előtt egy promóter régiót, ahonnan a transzkripció elindulhat. A promóter milyensége határozza meg az expresszált fehérje mennyiségét, de az is kulcsfontosságú a gyakorlatban, hogy a transzkripció szabályozható legyen, - ennek segítségével a kívánalmaknak megfelelően lehet elindítani a rekombináns fehérje termelését. Az egyik legismertebb és leginkább alkalmazott szabályzó mechanizmus az E. coli lac operon elemeire épül (lásd 18.2.1. fejezet).

A vektor DNS eredete alapján megkülönböztetünk plazmid és bakteriofág (bakteriális vírus) alapú vektorokat, az előbbi kettő kombinálásával létrehozott típusokat (pl. fágmid) és mesterséges kromoszómákat. Az expressziós vektorokra a 19.7. fejezetben térünk vissza.

19.2.4.1. Plazmid vektorok

A plazmidok számos baktériumfajban (és néhány egyszerű eukariótában, mint az élesztők) megtalálható, extrakromoszómális, kétszálú, gyűrűbe záródó (cirkuláris) DNS-molekulák. Eredeti formájukban méretük 1 és 200 kbp között van. Gyakran tartalmaznak olyan géneket, amelyek a gazdasejt számára valamilyen szelekciós előnyt biztosító enzimeket kódolnak. Ilyen előny lehet antibiotikumok elleni rezisztencia; más esetekben éppen antibiotikumok, esetleg különböző toxinok szintézise. Egyes restrikciós-modifikációs rendszerek enzimei szintén plazmidon kódoltak.

Az első klónozó vektor a pBR322 nevű plazmid még nem tartalmazott igazi poliklónozó helyet. Tartalmazott azonban két különböző antibiotikum elleni rezisztenciagént (AmpR: ampicillin rezisztencia és TcR: tetraciklin rezisztencia), és számos egyedi restrikciós endonukleáz hasítóhelyet tartalmaz, elsősorban a rezisztenciagéneken belül. Ha az idegen DNS-t ilyen hely belsejébe építjük be, a rezisztencia megszűnik. Ezt a tényt lehetett szelekcióra kihasználni. A vektor ma már ritkán használják, de tudománytörténeti jelentősége miatt a térképét a 19.8. ábrán bemutatjuk.

19.8. ábra: A pBR322 vektor térképe.A vektor méretén túl az egyedi restrikciós felismerőhelyeket tüntettük fel.

19.8. ábra: A pBR322 vektor térképe. A vektor méretén túl az egyedi restrikciós felismerőhelyeket tüntettük fel.

A plazmid vektorok a legáltalánosabb klónozó vektorok. A ma használatos típusoknál (mint a 19.7. ábra bemutatott pUC család tagjai) mindig poliklónozó helyet használnak, amely akár tucatnyi egyedi restrikciós enzim felismerőhelyét tartalmazza. Ezen kívül sok vektort alkalmassá tettek egy másodlagos szelekcióra, ami arra alkalmas, hogy a transzformációval a sejtekbe került üres plazmid vektort tartalmazó sejtkolóniáktól meg tudjuk különböztetni a rekombináns DNS-konstrukciót felvett sejtklónokat. Ez az ún. kék-fehér szelekció. A látványos módszert röviden bemutatjuk.

A szelekció molekuláris alapja a β-galaktozidáz enzim működésében rejlik és az ún. α-komplementáción alapszik. A β-galaktozidáz homotetramer szerkezetű fehérje (lásd 19.9. ábra), és csak ebben a formában aktív. Ha a polipeptidláncokról eltávolítunk egy rövid N-terminális peptidet, (α-peptid), melyet az ábrán narancs színnel jelöltünk, akkor a fennmaradó nagyméretű ω-fragmentumok nem tudják felvenni a homotetramer szerkezet, és az enzim inaktív lesz. Ha azonban az α-peptidet hozzáadjuk a ω-fragmentumhoz, vagyis azt mintegy kiegészítjük az α-fragmentummal, (amit genetikai kifejezéssel α-komplementációnak hívunk), spontán kialakul az aktív enzimszerkezet.

 

19.9. ábra: A β-galaktozidáz enzim térszerkezete.A homotetramer enzim négy láncát más-más színnel jelöltük. Az α-komplementációért felelős α-peptidszakaszt narancsszínű golyókkal emeltük ki (PDB: 3MUY).

19.9. ábra: A β-galaktozidáz enzim térszerkezete. A homotetramer enzim négy láncát más-más színnel jelöltük. Az α-komplementációért felelős α-peptidszakaszt narancsszínű golyókkal emeltük ki (PDB: 3MUY).

A szelekció során az enzimnek ezt a spontán, fragmentumaiból történő összeszerelődési képességét használjuk ki oly módon, hogy az α-peptidet (α-fragmentumot) a plazmid kódolja, míg az ω-fragmentumot a gazdasejt genomja. Mivel a cél az inszert beépülésének a vizsgálata, a vektorban a multiklónozó hely (MCS) az α-fragmentumot kódoló szakaszba van beépítve. Vagyis sikeres klónozás esetén az α-fragmentumot kódoló szakasz „elromlik”, és az α-fragmentum nem fejeződik ki. Ebben az esetben tehát az IPTG-vel való indukció eredményeként az inszert által kódolt fehérje fog expresszálódni, és a telepek fehérek lesznek. Az üres vektort tartalmazó baktériumok IPTG indukció hatására az enzim mindkét fragmentumát szintetizálják, ami azt eredményezi, hogy egy kromogén szubsztrát, az 5-bróm-4-klór-3-indolil-β-D-galaktozid (X-gal) jelenlétében kék színű baktérium telepek keletkeznek. (lásd 19.10. ábra).

19.10. ábra: A „kék-fehér” szelekció molekuláris háttere.Az ábra felső része egy olyan lac-operon vázlatos szerkezetét mutatja, amiből a lacZ génben deléció van, a β-galaktozidáz a-peptidje (a 11.-től a 42. aminosavig) nem íródik át. A β-galaktozidáz ω-fragmentuma (sárga) IPTG jelenlétében a gazdasejtben termelődik, de inaktív marad, míg a vektorban kódolt α-peptid (piros) ki nem egészíti, és aktívvá nem teszi (a két fragmentum másodlagos kötésekkel kapcsolódik egymáshoz, s így is kialakul az aktivitás szükséges konformáció). Ez az α-komplementáció jelensége. Az aktív enzim az X-gal nevű szubsztrátot bontja, kék csapadék keletkezik, ami kék színűvé teszi a telepeket is. Ha az inszerció sikeres, akkor az α-fragmentum nem termelődik (a kódoló régióját valószínűleg tönkreteszi az inszert), így a kolónia fehér színű marad.

19.10. ábra: A „kék-fehér” szelekció molekuláris háttere. Az ábra felső része egy olyan lac-operon vázlatos szerkezetét mutatja, amiből a lacZ génben deléció van, a β-galaktozidáz a-peptidje (a 11.-től a 42. aminosavig) nem íródik át. A β-galaktozidáz ω-fragmentuma (sárga) IPTG jelenlétében a gazdasejtben termelődik, de inaktív marad, míg a vektorban kódolt α-peptid (piros) ki nem egészíti, és aktívvá nem teszi (a két fragmentum másodlagos kötésekkel kapcsolódik egymáshoz, s így is kialakul az aktivitás szükséges konformáció). Ez az α-komplementáció jelensége. Az aktív enzim az X-gal nevű szubsztrátot bontja, kék csapadék keletkezik, ami kék színűvé teszi a telepeket is. Ha az inszerció sikeres, akkor az α-fragmentum nem termelődik (a kódoló régióját valószínűleg tönkreteszi az inszert), így a kolónia fehér színű marad.

A plazmid vektorok nem alkalmasak 10 kbp-nál nagyobb inszertek stabil fenntartására. A beépült DNS a plazmidból gyakran kivágódik, és az így kisebbé váló plazmid gyorsabban szaporodik. Az eukarióta genomok óriásiak, az emberi pl. kb. 3,2 milliárd bázispárnyi információt hordoz (mivel 23 különböző kromoszómánk van, egy-egy kromoszóma DNS mérete 100 millió bp körül van). Minél nagyobb DNS darabokat sikerül egy-egy vektorban fenntartani, annál kevesebb klón képes reprezentálni a teljes ún. genomiális könyvtárat (a könyvtárakat a 19.2.5. fejezetben mutatjuk be). Egy 10 kilobázis / klón kapacitású plazmid könyvtár esetén kb. 1,5 millió klón reprezentálná a teljes emberi genomot! (Ha egy Petri-csészén 1000 klón fér el, akkor 1500 Petri csésze kellene!)

A fenti ok és a plazmid alapú vektorok alacsony transzformálási hatékonysága vezettek arra, hogy a bakteriofág genomjából kiindulva újabb típusú vektorokat állítottak elő.

19.2.4.2. Bakteriofág alapú vektorok

A bakteriofág alapú vektorok előnye a plazmidokkal szemben, hogy egyrészt fertőző tulajdonságuk révén sokkal hatékonyabban képesek az idegen DNS-ta gazdasejtbe bejuttatni, másrészt nagyobb méretű inszertet tudnak befogadni, mint a plazmid alapú vektorok.

 A tipikus bakteriofág egy külső, fehérjéből álló kapszidból (a virion burka), és a benne lévő örökítőanyagból áll. A genomjukat alkothatja RNS és DNS is, egy- és kétszálú formában egyaránt. A géntechnológiában a vektor előállítása céljából elsősorban az ikozaéderes λ-fágot és a fonalas szerkezetű M13 fágcsaládot vonták be.

A lambda (λ) fág tipikus fág struktúrát mutat, rendelkezik fej, más néven kapszid régióval, amelyben lineáris kettős szálú DNS örökítőanyag található, valamint farok régióval, amin keresztül a DNS bejuthat a gazdasejtbe. A vírus genomja ~48500 bp-ból áll és közel 60 gént kódol, amelyek biztosítják a fág szaporodásához és becsomagolásához szükséges enzimeket, azok szabályzó fehérjéit, valamint burokfehérjéket. A vírus lineáris genomja képes cirkularizálódni a gazdasejten belül, ezt a DNS szálak végén található két ragadó cos régió biztosítja. Az λ-fág kétféle életciklust mutat. A lítikus életciklus során a vírus örökítőanyaga miután bejutott a gazdasejtbe, ott többször replikálódik, majd a fej és farok struktúrát képző fehérjék expresszióját követően új vírusrészecskék képződnek, amik a gazdasejt elpusztulása után további sejteket fertőznek. Ezzel ellentétben a lizogén életciklusba akkor lép a fág, amikor az örökítőanyaga beépül az E. coli kromoszómájába, azzal együtt replikálódik. A sejt osztódásával tovább öröklődő, látens fágot profágnak nevezzük (lásd 19.11. ábra).

19.11. ábra: Aλ-fág két életútja.A lizogén életúthoz szükséges gének nélkül lítikus módon tud szaporodni a vírus, ezért ezek a gének helyettesíthetők idegen DNS-sel.

19.11. ábra: A λ-fág két életútja. A lizogén életúthoz szükséges gének nélkül lítikus módon tud szaporodni a vírus, ezért ezek a gének helyettesíthetők idegen DNS-sel.

A λ-fág-alapú vektorok közül leginkább az ún. helyettesítővektorokat használják. A lineáris DNS-en belül található egy "kitöltő" (stuffer) szekvencia (amely régió a vírus lítikus életciklusához nem esszenciális géneket tartalmaz), amit elsőként ki kell vágni a vektorból és annak helyére tudják beépíteni az idegen génszakaszt. A λ-fág helyettesítő vektorokban az inszert maximális mérete 23 kbp, és főleg genomiális könyvtárak előállítására használják. Egy helyettesítő λ-fág vektor konstrukciót mutat be a 19.12. ábra.

A lambda-fág DNS két végén olyan szakaszok vannak, melyeket a fágfehérjék felismernek, és képesek a DNS-t fágrészecskébe pakolni. Ez sejtmentes közegben in vitro is végbemegy. Az „in vitro pakolás” során minden olyan DNS fág virionba kerül, melynek két végén jelen van a szükséges lambda fág szekvencia (a cos régió). Az in vitro létrehozott fág részecskék sokkal nagyobb hatékonysággal viszik be a DNS-t a kóli sejtbe, mint a transzformálás a plazmidokat.

19.12. ábra: Egy ún. helyettesítőλ-fág vektor konstrukció elkészítésének vázlata

19.12. ábra: Egy ún. helyettesítő λ-fág vektor konstrukció elkészítésének vázlata

A fág vektorok esetében a klónokat tarfoltok, más néven plakkok (plaque) reprezentálják. Amikor a kólisejteket fágok fertőzik, minden egyes sejtbe legfeljebb egy fág virion kerül be. Megfelelően alacsony fág/baktériumsejt arány esetén a sejtek többsége nem fertőződik. Ilyen körülmények között a sejteket nagy koncentrációban szilárd táptalajra kenve kolóniák helyett az egyes kolóniákból összefüggő sejtpázsitot kapunk. Azokból a sejtekből, melyek a kikenéskor fággal fertőzöttek voltak, a fágok kiszabadulnak, és a környező sejteket pusztítani fogják. Ezért a fággal fertőzött sejtek helyén illetve körülöttük tarfoltok keletkeznek. Egy-egy ilyen tarfolt más-más klónból származó fágok tömegét tartalmazza. A tarfoltokból a fágok izolálhatók, és ezekkel újabb kóli sejtek fertőzhetők. Ezáltal egyedi klónoknak megfelelő l-fág DNS izolálható, és ezzel együtt természetesen a beépült idegen DNS klón is izolálható.

A DNS-szekvenáláshoz és egyéb in vitro DNS szintézisen alapuló technikákhoz sokszor egyszálú DNS templátra van szükség. Az M13 fágon alapuló klónozó vektorok nagy előnye az, hogy segítségükkel egyszerű eljárással egyszálú formában izolálható a rekombináns DNS.

Az M13 a fonalas fágok közé tartozik, genomja az E. coli sejtben kétszálú DNS formájában replikálódik, és a sejtből ezt a formát kinyerve az plazmidként kezelhető, tehát restrikciós endonukleázokkal és ligázzal abba idegen DNS építhető. A sejtből kiszabaduló fágokban azonban a genom (és ezzel együtt a beépített idegen DNS) már egyszálú DNS formában van jelen, ami templátként szolgál, tehát ehhez szintetikus oligonukleotid hibridizálható, és in vitro körülmények között új DNS szál szintetizálható. Az M13 alapú vektorok további előnye, hogy beépíthető inszerteknek gyakorlatilag nincs felső mérethatára.

Manapság olyan géntechnológiai módszerekhez, ahol egyszálú templátra van szükség, elsősorban ún. fágmid vektorokat használnak. A fágmidok a plazmidok és a fágok tulajdonságait ötvözik és a következő alfejezetben mutatjuk be őket.

19.2.4.3. Fágmidok

A fonalas fágok szaporodási mechanizmusára épülnek a „kettős természetű” fágmid vektorok. A fágmid név a fonalas (bakterio)fág és plazmid kombinációjára utalt. Ebből adódóan jellemzői az előbbi kettő tulajdonságainak keveréke.

Egyrészről tartalmaznak egy plazmid replikációs origót, másrészről megtalálható bennük az M13 rokon f1 fágból származó f1 origó is. Ez utóbbi biztosítja (az M13 fág origóval megegyező módon) azt, hogy a fágmidról egyszálú DNS is átíródjon, majd az virionba pakolódva, a későbbi gazda organizmusba átvihető legyen. A fágrészecskébe csomagoláshoz szükség van ún. segítő (helper) fágra is, amely az egyszálú DNS replikációját biztosítja és a virionba való pakoláshoz szükséges géneket kódolja. A fágmidok, a fonalas fágokhoz hasonlóan nem lítikusak, tehát kiszabadulásukkor nem ölik meg (nem lizál) a gazdasejt, hanem a sejtet folyamatosan új vírusrészecskék kiválasztására készteti.

A fágmidokat a gyakorlatban általános klónozó vektorként használják, illetve olyan célra, ahol egyszálú templátra van szükség: szekvenálásra (lásd 19.5) és irányított mutagenezishez (lásd 19.6) (ma már inkább csak az utóbbi célra). A 19.13. ábra egy fágmidba történő klónozás sémáját és az egyszálú templát DNS-t, amivel a bemutatott kísérletben helyspecifikus mutagenezist végeznek (lásd 19.6. ).

19.13. ábra: Klónozási séma fágmid vektorral és egyszálú templát DNS előállítása helyspecifikus mutagenezishez (ld.19.6. fejezet)

19.13. ábra: Klónozási séma fágmid vektorral és egyszálú templát DNS előállítása helyspecifikus mutagenezishez (ld. 19.6. fejezet)

Az egyik legismertebb klónozó fágmid a pBlueScript vektor (lásd 19.14. ábra), amely a pUC vektorcsaládra (lásd 19.7. ábra) nagyon hasonlít, de tartalmaz egy f1 replikációs origót is.

19.14. ábra: A Bluescript fágmid vektor térképe

19.14. ábra: A Bluescript fágmid vektor térképe

19.2.4.4. Mesterséges kromoszómák

A lambda vektorokhoz képest is sokkal nagyobb, 300 kbp méretű inszerteket lehet bakteriális mesterséges kromoszómákba (BAC: Bacterial Artificial Chromosomes) építeni. Ezek olyan speciális, a természetes F-plazmidról származó origót és egyéb szabályzó elemeket tartalmaznak, ami miatt a nagyméretű cirkuláris vektor DNS csak egy-két példányban lesz jelen a sejtben, és a sejttel tökéletesen szinkronizáltan osztódik. Ez a tulajdonság nagyméretű rekombináns DNS-ek esetében hasznosabb, mint a nagy kópiaszám, ugyanis így kisebb valószínűséggel történik homológ rekombináció, a konstrukció stabilabb marad a felszaporítás során. A BAC-ba 300 kbp méretű inszertek építhetők be.

A teljes emberi genomot néhány 10 ezer ilyen vektor-tartalmú klón lefedi, ami már kivitelezhető nagyságrendet jelent. Az elsődleges szelekciót ennél a vektortípusnál is antibiotikum rezisztencia biztosítja. Az idegen DNS beépülését (rekombináns DNS) itt is ki lehet mutatni a β-galaktozidáz enzim α-komplementációja, a „kék-fehér” szelekció alapján. A BAC klónok előállításának sémáját a 19.15. ábra mutatja be.

19.15. ábra: Bakteriális mesterséges kromoszóma (BAC) klónozási célra

19.15. ábra: Bakteriális mesterséges kromoszóma (BAC) klónozási célra

Létrehoztak eukarióta eredetű mesterséges kromoszómát is, ami a sörélesztő gomba, a Saccharomyces cerevisiae genom tulajdonságait örökölte meg. Élesztő mesterséges kromoszómákat (YAC: Yeast Artificial Chromosome) használtak eleinte a Humán Genom Program során is, mivel ezek akár több megabázispár nagyságú inszerteket is képesek tárolni, így az emberi genom teljes lefedéséhez elegendő kb. 10000 élesztő klón. Később azonban a YAC klónok instabilitása miatt teljesen elhagyták ezek használatát. A BAC-kal szemben a YAC nem cirkuláris, hanem lineáris felépítésű. Rendelkezik az eukariótákra jellemző centromer és telomer régiókkal is, amelyek megakadályozzák a vektor letörését és más DNS darabbal való kapcsolódását. A YAC tartalmaz minden olyan szakaszt, amely a kromoszóma replikációjához és az utódsejtbe kerüléshez szükséges. Ezeken a szakaszokon kívül a YAC vektorokban van a gazdasejtben működőképes replikációs origó és szelekciós markergén is. A YAC vektor hátránya a másik két mesterséges kromoszómával szemben, hogy mivel eukarióta gazdasejtben tartják fenn, így a természetes rekombinációs folyamatoknak jobban ki van téve (instabil), ezen kívül a konstrukció létrehozásakor gyakrabban alakulnak ki konkatamer inszertek. (A konkatemer kifejezés jelentése: egy inszert egymás mögé több kópiában épül be a vektorba.)

Végül meg kell említenünk a humán mesterséges kromoszómákat (HAC: Human Artificial Chromosome) is, mint a legkomplexebb vektor típust, amely ígéretes eszköz a génterápia számára (lásd 19.8.3), mint „génszállító” molekula. Méretük 1-10 Mbp között lehet, és a HAC-ba beépíthető inszertnek potenciálisan nincs mérethatára.

19.2.5. Rekombináns DNS könyvtárak

A rekombináns DNS technológiák nemcsak egyedi gének és fehérjék vizsgálatára alkalmas rendszerek létrehozására használhatóak. Ugyanezek a technikák alkalmasak rekombináns DNS könyvtárak létrehozására is. Ezek a könyvtárak hatalmas mennyiségű DNS-ben kódolt információt tartalmazhatnak. A könyvtár létrehozása során először a klónozni kívánt DNS megfelelő méretű fragmentumait állítják elő, majd ezeket a fragmentumokat klónozzák a választott vektorba.

A DNS forrása alapján kétféle génkönyvtárat lehet létrehozni. A genomiális könyvtárak klónjainak összessége egy adott élőlény teljes genomját, vagy annak egy-egy jól körülhatárolt részét, például egy kromoszómát tartalmazzák. A cDNS (complementary DNS) könyvtárak egy adott sejttípusban egy adott pillanatban kifejeződő fehérjéket kódoló érett mRNS-ek szekvenciáit tartalmazzák, de DNS formában.

A rekombináns DNS könyvtárból a vizsgálni kívánt gént tartalmazó klónt vagy klónokat különböző, később részletezett technikák segítségével ki lehet választani, és a többi klóntól el lehet különíteni. Ez az eljárás a könyvtárak szűrése (angol eredetű kifejezéssel szkrínelés). Ezáltal a vizsgálatokat tiszta klónokon lehet elvégezni. Az egész DNS könyvtár vagy az egyes kiválasztott klónok a megfelelő gazda rendszerben szaporíthatóak, azaz a DNS könyvtár bizonyos értelemben állandó forrása a specifikus klónoknak is.

19.2.5.1. Genomiális DNS könyvtárak

A genomból származó DNS molekulák feldarabolása és DNS fragmentumok vektorba építése az eddig bemutatott módszerekkel történik (lásd 19.16. ábra).

19.16. ábra: Genomiális könyvtár elkészítési sémája

19.16. ábra: Genomiális könyvtár elkészítési sémája

A könyvtár elkészítéséhez használt vektor típusát a genom mérete és befogadni képes inszert mérete dönti el. A genomiális könyvtárakhoz korábban főleg lambda vektorokat használtak, manapság a genom programoknál leginkább a bakteriális mesterséges kromoszómákat részesítik előnyben hordozó DNS-ként. A bennünket érdeklő klón megtalálása az esetenként százezres nagyságrendű rekombináns DNS közül nem tűnik egyszerű feladatnak. Szerencsére a DNS reverzibilis hibridizációs képességén (lásd 12.3.4. fejezet) és a komplementaritás elvén alapuló hibridizációs technikák (lásd 19.3) segítenek nekünk. A lambda-fág könyvtárak szűrésére alkalmas módszer, a plakk-hibridizáció sémája a 19.17. ábrán tekinthető meg. A hibridizációhoz használt „próba”, a keresett DNS szekvenciával komplementer egyszálú szintetikus oligonukleotid, amit előzetesen megjelölnek radioaktív vagy fluoreszcens módon.

19.17. ábra: Az úgynevezett plakk-hibirdizációval lehet egyedi klónokat azonosítani egy génkönyvtárban

19.17. ábra: Az úgynevezett plakk-hibirdizációval lehet egyedi klónokat azonosítani egy génkönyvtárban

Hogyan lehet megtalálni a könyvtárban olyan géneket, aminek nem ismerik a szekvenciáját? Ha az adott gén által kódolt fehérje legalább részleges fehérjeszekvenciája ismert, akkor a genetikai kód ismeretében, visszafelé átfordítható az aminosavak sorrendje kodonok sorrendjére. Egy aminosavszekvenciát a kódszótár degeneráltsága miatt ugyan többféle oligonukleotid szekvencia kódolhat, de ez nem probléma, mert redundáns oligonukleotid keveréket is könnyen elő lehet álltani szintetikusan módon, s ezek használhatók próbaként a könyvtár szkrínelésére (lásd 19.18. ábra).

19.18. ábra: Aminosav szekvencia alapján a bemutatott módon lehet szintetikus nukleinsav próbát készíteni

19.18. ábra: Aminosav szekvencia alapján a bemutatott módon lehet szintetikus nukleinsav próbát készíteni

19.2.5.2. cDNS könyvtárak

A cDNS könyvtárak készítésének célja és az elkészítésük módja alapvetően más, mint a genomiális könyvtárak esetében. A cDNS könyvtárak a könyvtárkészítés során használt sejttípusban kifejeződő fehérjék érett mRNS szekvenciáiról reverz transzkripcióval készült komplementer DNS-t tartalmazzák. Ez utóbbiak neve cDNS, azaz komplementer DNS (complementary DNA).

Míg egy fajból csak egyfél genomiális könyvtár, viszont nagyon sokféle cDNS könyvtár készíthető. Gondoljunk bele, minden sejttípus más és más géneket expresszál, azon kívül egy soksejtű szervezet a fejlődése során, különböző fiziológiás körülmények között, egészséges és kóros állapotban is különböző mRNS készlettel rendelkezik – ezért egy élőlényből számtalan különféle cDNS könyvtár állítható elő.

A cDNS könyvtár készítésének első, az eddigiektől eltérő lépése a reverz transzkripció. Ha eukarióta cDNS könyvtár létrehozása a cél, először az sejtekből kivont teljes RNS mintából izolálni kell a csak néhány százalékot képviselő mRNS-t. Egy igen hatékony elválasztási mód az eukarióta mRNS-ekre általánosan jellemző 3’-végi poli-A farok kihasználása – egy lépésben affinitás kromatográfiával (lásd 6.3.4. fejezet), egy poli-T oligonukleotiddal módosított kromatográfiás tölteten lehet szeperálni az mRNS molekulákat. (Jegyezzük meg, hogy RNS-ekkel nehéz a laboratóriumban dolgozni, mert igen könnyen degradálódik a preparátum a mindenütt jelen levő és szinte tönkretehetetlen ribonukleáz enzimek miatt. Inaktiválásukra speciális, itt nem ismertetett eljárásokat dolgoztak ki.)

A cDNS könyvtárak elkészítésének egy sémáját a 19.19. ábra mutatja be. A reverz transzkriptáz (RT-áz), a retrovírusok enzime, egy RNS-függő DNS-polimeráz, tehát szüksége van egy indító primerre. A cDNS szintézisnél, amennyiben eukarióta mRNS-sel dolgoznak, ez oligodezoxitimidin (oligo-dT). Az RT-áz egy RNS/DNS hibrid molekulát szintetizál, amiről egy ribonukleáz (RN-áz-H) és egy DNS-polimeráz segítségével készülnek el a cDNS molekulák, amiket restrikciós helyeket tartalmazó ún. linkereknek a végekre történő ligálása után lehet beépíteni a megfelelő vektorba.

A cDNS könyvtárakhoz általában expressziós vektort használnak, azaz a sejtekben az inszertek egy promóterről átíródnak. Ezt a tényt lehet kihasználni a cDNS könyvtárak ún. expressziós szűrésére. Ennek során az in situ, a sejtekben termelődő fehérjéket specifikus antitestek segítségével mutatják ki.

Az izolált cDNS szekvenciákból jelölt próbák készíthetők. A próbák segítségével vizsgálható az adott gén expressziójának szintje különböző szövetekben, vagy az expresszió megváltozása patológiás állapotban vagy különböző kezelések, beavatkozások hatására. Ezeket a vizsgálatokat valamilyen hibridizációs módszerrel végezik, amelyeket a következő fejezetben ismertetünk.

19.19. ábra: cDNS könyvtár előállításának vázlatos sémája

19.19. ábra: cDNS könyvtár előállításának vázlatos sémája