19.3. Hibridizációs technikák

A géntechnológiában a hibridizációs technikákkal valamilyen ismeretlen biológiai mintából vagy egy génkönyvtárból lehet kimutatni egy adott DNS vagy RNS szakaszt. A hibridizációs technikáknak köszönhetően nincs feltétlenül szükség szekvenálásra, ha a cél a például a genomban egy mutációt azonosítása. A könyvtárak szűrése kapcsán már említettünk egy hibridizációs eljárást, s arról is írtunk, hogy a hibridizáció a DNS két szálának komplementaritásán és reverzibilis denaturációján-renaturációján alapszik.

A hibridizáció során a vizsgált minta a templát, ehhez tapad hozzá a Watson-Crick bázispárosodási szabályoknak megfelelő komplementer próba. A minta lehet DNS vagy RNS, a próba elvileg bármilyen jelölt nukleinsav, amit ha oligonukleotid méretű, akkor szintetikusan, automatizált szilárdfázisú oligonukleotid szintézissel (szintetizátorban) állítanak elő. A jelenlegi technológiával maximum kb. 100 nukleotid hosszúságú, tetszőleges szekvenciájú DNS állítható elő. Ezeket nem csak kereső próbaként használják, hanem in vitro DNS szintézishez „primer”-ként olyan módszereknél, mint a DNS-szekvenálás, irányított mutagenezis és a polimeráz láncreakció (lásd 19.4.).

Amennyiben a minta DNS fragmentumokat tartalmaz, akkor a hibridizációt Southern-lenyomat (blot) módszerrel, ha a minta RNS, akkor viszont Northern-lenyomat módszerrel végzik. Szólunk a fejezetben röviden a DNS-chip technológiáról is, ami egyszerre nagyszámú minta vizsgálatát teszi lehetővé. Ebben a könyvben nem ismertetjük a fehérjék kimutatására szolgáló Western-blot módszert, amellyel specifikus fehérjéket antitestekkel lehet kimutatni, miután a poliakrilamid gélben szétválasztott mintát blottolással immobilizálták.

19.3.1. A Southern- és Northern-blot technika és az RFLP módszer

A Southern-blot (magyarul lenyomat) technika speciális DNS szakaszok kimutatására szolgál egy komplex DNS mintában. (Nevét a felfedezőjéről, Edwin Southernről kapta, aki 1975-ben kidolgozta a módszert.) A módszerrel például egy adott gén jelenlétét lehet vizsgálni különböző fajok teljes genomjában. Ezzel a technikával a gén mérete vagy szerkezetbeli megváltozása is kimutatható. A „lenyomatra” azért van szükség, mivel a gélből a DNS diffúzióval az oldatba kerülne a hibridizálás során, másrészt a gél törékeny és nehezen kezelhető.

Először az emésztett DNS mintát agaróz gélelektroforézissel szétválasztják, majd egy nitrocellulóz- vagy nylonmembránra „blottolják”, azaz diffúzióval a gélből a lenyomatra kerülnek a DNS molekulák és ott immobilizálódnak (lásd 19.20. ábra). A lenyomaton in situ denaturálják a DNS-t, majd hibridizálják egy radioaktív vagy fluoreszcens módon jelölt próbával. (Manapság már szinte kizárólag a veszélytelen fluoreszcens jelöléseket használják a géntechnológiában).

19.20. ábra: A Southern-lenyomat módszer

19.20. ábra: A Southern-lenyomat módszer

Southern-blot technika segítségével analizálják az RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism: restrikciós fragmentum hossz polimorfizmus) módszer alkalmazása során kapott DNS fragmentumokat is (lásd 19.21. ábra).

Az RFLP módszer segítségével homológ DNS molekulák variációit (pl. SNP: single nucleotide polymorphism, kiejtve „sznip”) lehet detektálni. A 19.21. ábrán egy bűntény elkövetőjének Southern-blot módszerrel előállított RFLP mintázat alapján történő azonosítását mutatjuk be.

19.21. ábra: Restrikciós fragmentum hossz polimorfizmus (RFLP) kimutatása Southern-blot módszerrel.A példában egy bűntény elkövetőjét az RFLP mintázat egyedisége alapján lehetett azonosítani.

19.21. ábra: Restrikciós fragmentum hossz polimorfizmus (RFLP) kimutatása Southern-blot módszerrel. A példában egy bűntény elkövetőjét az RFLP mintázat egyedisége alapján lehetett azonosítani.

Az eljárás során teljes genomból indulnak ki, melyet restrikciós endonukleázokkal kezelnek. A hasítás után kapott DNS fragmentumok száma az enzim által felismert szekvenciák számától, mérete pedig ezek távolságától függ. A restrikciós fragmentumokat ezt követően gélelektroforézissel szeparálják, és Southern-blot hibridizációval detektálják. RFLP abban az esetben jelenik meg, ha a vizsgált DNS szálon található inszerció, deléció vagy SNP egy meglévő restrikciós helyet tönkretesz vagy egy újat hoz létre. Ilyenkor gélelektroforézissel eltérő hosszúságú DNS fragmentumokat kapnak. Az RFLP analízis volt az első DNS „ujjlenyomatot” feltérképező, széles körűen elterjedt technika (DNA profiling, DNS tipizálás), amelyet bevezettek az igazságügyi orvostani és a bírósági gyakorlatba is. Az RFLP technika nagyon fontos eszköz volt a genomok fizikai térképezésében, különböző mutációk kimutatásában. Ezzel a módszerrel különböző betegségek, vagy az azokra való hajlam is kimutatható.

A Southern-blottal rokon technika a Northern-blot, csak ebben az esetben DNS helyett RNS molekulákat analizálunk. Ez az eljárás jóval nagyobb elővigyázatosságot igényel, mivel az RNS rendkívül bomlékony (lásd fentebb). Segítségével megállapítható egy adott sejt pillanatnyi génexpressziós állapota és annak változása például differenciálódás során vagy patológiás esetekben.

A Southern- és Northern-blot módszer helyett ma már egy sokkal több minta egyidejű analízisére alkalmas hibridizációs módszer is a kutatók rendelkezésére áll – a következő fejezetben bemutatott DNS-chip technika.

19.3.2. DNS-chip (microarray) technika

A hibridizációs technikák legújabb változata a DNS-chip vagy microarray. Egy kisméretű (1-2 cm2) szilárd hordozó (pl. szilikon, üveg) felületére szabályos elrendezésben több 10000, eltérő szekvenciájú DNS próbát rögzítenek. A próbák 20-5000 nukleotid hosszúságúak, génekre vagy cDNS-ekre specifikus oligonukleotidok vagy in vitro szintetizált DNS-fragmentumok. Az eljárás lényege, hogy mikroszkóp segítségével detektálják azokat a próbákat a chipen, amelyekkel komplementer DNS vagy RNS jelen van a mintában. Ennél a módszernél a mintát kell fluoreszcens módon jelölni. Vegyük észre, hogy a klasszikus hibridizációs módszerekhez képest a chip technológiánál megfordult a próba és a minta viszonya: itt a próbát, míg az előző módszereknél a mintát immobilizálják (blottolással).

A DNS microarray módszert széleskörűen alkalmazzák a funkcionális genomikában; génexpressziós változásokat, valamint az SNP-ktől kezdve a teljes genomot átfogó genetikai különbségeket lehet a módszerrel analizálni. Egy expressziós összehasonlító vizsgálat sémáját a 19.22. ábra mutatja be. Normál illetve rákos sejtekből izolált mRNS-ekről két eltérő színű fluoreszcens jelöléssel cDNS-eket szintetizálnak. A DNS-chipen a humán génekre specifikus próbák találhatók. Elegendő 12 nukleotid hosszúságú szekvenciákat használni, mivel ezek a kombinatorika törvényeit ismerve már bizonyosan specifikusak lesznek a humán genomméretét figyelembe véve (412 = 16,8 x 109, míg a genomméret: 3,2 x 109). A két mintát összekeverés után hozzáadjuk egy DNS-chiphez, amelyen a humán génekre specifikus próbák találhatók. Az előhívás után a csak egyik vagy másik mintában expresszálódó mRNS-ről készült cDNS a jelölési színnel látszik, míg a mindkét mintában jelenlevő cDNS a két szín keverékeként (piros és zöld mintajelölés esetén sárga) detektálható, ráadásul kvantitatív módon. A vizsgálatból kiderül, hogy az adott rákos mintában milyen gének fejeződnek ki nagyobb mértékben mint az egészséges sejtekben.

19.22. ábra: DNS-chip alkalmazása differenciális génexpresszió vizsgálatra.

19.22. ábra: DNS-chip alkalmazása differenciális génexpresszió vizsgálatra.