19.4. Polimeráz láncreakció (PCR)

A polimeráz láncreakció (PCR: polymerase chain reaction) segítségével egyetlen vagy kisszámú DNS-molekula meghatározott szakasza (célszekvencia) amplifikálható in vitro enzimatikus reakció révén, gazdaszervezet igénybevétele nélkül. A reakció során amplifikált DNS-szakasz mérete jellemzően a 100 bázispár és 10 kilobázispár közötti tartományba esik.

A PCR-t Kary Mullis 1983-ban fedezte fel, és mivel ez a technológia forradalmasította a molekuláris biológia szinte minden eljárását, Nobel díjat kapott érte (1993-ban). Az eljárás lényege: ha tökéletesen ismert egy adott DNS szekvencia, akkor a szekvencia alapján egy in vitro DNS szintézisen alapuló, ciklikusan ismétlődő módszerrel „ki lehet erősíteni” az adott szekvenciájú DNS szakaszt. Két szintetikus oligonukleotidot használnak, melyek az amplifikálandó DNS komplementer szálaihoz hibridizálnak úgy, hogy 3’ végeik egymás felé néznek. Ezek az oligonukleotidok primerként szolgálnak a DNS szintézis során.

A PCR-t három, ciklusosan ismétlődő lépésben hajtják végre. Először a templát DNS-t tartalmazó mintát 90ºC fölé melegítve a két DNS szál elválik (denaturációs fázis), majd az oldatot lehűtve kb. 50ºC-ra a nagy koncentrációban alkalmazott primerek mindkét szálhoz hibridizálnak (anellálási fázis). A harmadik lépésben a mintát 72ºC-ra felmelegítve, ezen a hőmérsékleten nagy felesleg dNTP jelenlétében egy DNS-polimeráz mindkét szálra megszintetizálja az új, komplementer DNS szálat (polimerizációs vagy elongációs fázis). A reakcióban olyan DNS-polimerázt (pl. Taq-polimeráz) használnak, mely hőforrásokban élő baktériumból (pl. Thermus aquaticus) származik, és hőmérsékleti optimuma 72ºC-on van, sőt, 90ºC-on sem denaturálódik. Végül a mintát újból 90ºC-ra melegítik, ahol a két kétszálú DNS négy szálra esik szét, és a ciklus kezdődik elölről. A három hőmérséklet, 90-50-72ºC ciklikus váltogatásával egy olyan DNS-termék szaporodik exponenciális ütemben, melynek két végét az alkalmazott primerek jelölik ki. 25 ciklus után kb. egymilliószor annyi adott szekvenciájú DNS molekula keletkezik, mint amennyi a templátban volt! A végtermék neve az amplikon (bár megjegyzendő, hogy a szakirodalomban néha a PCR-hez használt kiindulási DNS-t is amplikonnak nevezik). A módszer hallatlanul érzékeny, mivel a kiindulási mintában elegendő egyetlen DNS molekula, az amplifikáció akkor is megtörténik. Az eljárás sémáját a 19.23. ábra és a 12. animáció mutatja be.

19.23. ábra: A polimeráz láncreakció sémája

19.23. ábra: A polimeráz láncreakció sémája

A PCR termék szigorúan vett értelemben nem molekuláris klón, hiszen nem sejtklónokból származik. Ennél fontosabb tény, hogy az amplifikáció során csak az alkalmazott DNS-polimeráz saját hibajavító (korrektor) aktivitása képes a DNS szintézis másolási hűségét növelni, a sejtekben erre a célra szakosodott hibajavító enzimek hiányoznak. Tovább rontja a helyzetet, hogy a leggyakrabban használt Taq-polimeráznak hiányzik a korrektor hibajavító aktivitása, ezért átlagban 10000 beépített nukleotidonként hibázik. (Megjegyezzük, hogy használhatunk a PCR-hez hibajavító aktivitással rendelkező hőstabil enzimet is, ilyen pl. a Pfu-polimeráz.) Összehasonlításképpen, egy emlős genom replikációjakor a hibavalószínűség 1/109 nagyságrendű. A fentiek miatt sokszor a PCR terméket beépítik egy vektorba, s valódi molekuláris klónt (hívják angolul hard copy-nak is) készítenek belőle, mielőtt további géntechnológiai célra használnák.

A PCR alkalmazása igen sokrétű, mind az alap, mind az alkalmazott molekuláris biológiai kutatásokban.

Az amplikon könnyen klónozható, mivel a PCR oligók 5’-végére restrikciós hasítóhelyeket lehet beépíthetni (a primereknek elég, ha a 3’-régiójuk komplementer a templát szállal). A DNS-szekvenálása és mutagenezise is történhet PCR-rel.

A templát amplifikáció fluoreszcens jelekkel történő valósidejű követésével kvantitatív PCR-t lehet végezni, aminek a segítségével például az mRNS templát mennyiségét, és ezen keresztül a génexpresszió mértékét is meg lehet határozni (reverz transzkripció és PCR kombinálásával).

Mivel nyomnyi mennyiségű DNS is amplifikálható, ezért pl. fosszíliákból származó DNS-t is ki lehet erősíteni (és szekvenálni) például múmiákból, jégbefagyott mammutokból, borostyánba zárt rovarokból stb., ami evolúciós és genetikai kutatásokhoz ad óriási segítséget (ez az „ős-PCR” vagy archeológiai PCR, hiszen alkalmas mintákat lehet kinyerni régészeti lelőhelyekről származó csontokból is).

Az „ős-PCR” egyik csúcsteljesítménye, hogy a neandervölgyi embertől származó csontmintákból kinyert töredezett DNS-ből PCR-rel annyit sikerült felszaporítani, hogy az ún. új-generációs szekvenálási módszerekkel (lásd 19.5) a teljes Homo neanderthalensis genomot meg tudták szekvenálni.

Az igazságügyi orvostanban ma már PCR-rel végzik azokat a vizsgálatokat, melyek eredményeként egyénre jellemző „DNS ujjlenyomat” készül (a módszer felváltotta az RFLP technikát). A módszer lényege, hogy megfelelően választott primer párokkal az emberi genomból olyan szakaszokat erősítenek ki, melyek mérete a bennük levő repetitív elemek számától függ. Az elemek száma egyénenként eltérő, és mint allél öröklődik. Sok génterület együttes kierősítésével és gélelektroforézisével egyénre jellemző DNS fragmentum mintázat kapható. A módszert alkalmazzák áldozatok azonosítására (pl. az 1918-ban meggyilkolt orosz cári család maradványait is így azonosították), illetve elkövetők azonosítására vagy kizárására. A fragmentum mintázat Mendel törvényei szerint öröklődik, vagyis rokonsági kapcsolatokat is kimutatható, ezért alkalmazzák pl. apasági perekben, vagy fosszíliák rokonsági kapcsolatainak megfejtésében is.

A PCR nyomnyi mennyiségben jelenlevő, betegséget okozó vírusok vagy mikrobák kimutatására is használható. Számos speciális alkalmazása létezik környezeti minták mikrobáinak analízisére (metagenomika), igaz, hogy itt is előtérbe kerültek új generációs szekvenálási módszerek (lásd 19.5.3).