19.5. DNS-szekvenálás

Egy rekombináns DNS akkor használható további géntechnológiai eljárásokhoz, ha már ismert az információtartalma, azaz szekvenálták. Definíció szerint a DNS-szekvenálás az a folyamat, melynek során meghatározzák a DNS molekula nukleotidsorrendjét.

Napjainkban a DNS-szekvenálás a molekuláris biológia egyik legmeghatározóbb eszközévé vált. A modern szekvenáló technikákkal már számos élőlény teljes genomját, köztük az emberét is sikeresen meghatározták (különböző élőlények genomméretét, amelyeket már szekvenáltak, lásd a 1.3. táblázatban).

Az 1970-es évektől kezdve két módszert fejlesztettek ki, amelyek közül a Sanger-féle láncterminációs (enzimatikus) módszer szinte egyeduralkodóvá vált (lásd 19.5.1). A fluoreszcens detektálás megjelenésével és automatizálásával könnyebbé és gyorsabbá vált a DNS-szekvenálás (lásd 19.5.2). Végül az ezredfordulón jelentek meg a teljesen más mechanizmuson alapuló, még nagyobb hatékonyságú és olcsóbb ún. új-generációs szekvenáló módszerek (next-generation sequencing), amelyek az információszerzés mennyiségét tekintve újabb forradalmi változást indítottak el a molekuláris biológiában (lásd 19.5.3). Jelenleg ez utóbbi módszereket és az automata láncterminációs szekvenálást párhuzamosan használja a géntechnológia. A fejezetben ezeket a módszereket tekintjük át.

19.5.1. A Sanger-féle láncterminációs (didezoxi-) szekvenálás

Frederick Sanger 1977-re dolgozta ki azt a szekvenálási elvet, ami a láncterminációs- vagy didezoxi-szekvenálás elnevezést kapta. Sanger a szekvenálást forradalmasító módszeréért megkapta a fehérjeszekvenálás kidolgozásáért 1958-ban odaítélt első Nobel-díja után a másodikat is, 1980-ban.

Az eljárás során a szekvenálni kívánt kettősszálú DNS-t magas hőmérsékleten denaturálják, majd a szétváló szálak közül a leolvasni kívánt templát szálhoz (a leolvasandó szekvenciától 5’-irányban) komplementer, rövid egyszálú DNS-szálat, primert (szekvenáló oligonukleotidot) párosítanak. Ezután négy párhuzamos szekvenáló reakciót állítanak össze. Minden reakcióelegybe kerül templát DNS és szekvenáló primer, valamilyen DNS-polimeráz enzim és azonos mennyiségben négyféle dezoxinukleotid-trifoszfát (dNTP). A négy párhuzamos reakció mindegyikéhez egyféle didezoxinukleotid-trifoszfát (ddNTP) molekulát kevernek. A ddNTP-k cukorrészének – szemben a dNTP-molekulákkal – 3’-szénatomjához az -OH csoport helyett -H atom kapcsolódik (lásd 19.24. ábra).

Példaként vegyük azt a reakciót, mely ddATP-t tartalmaz. A polimeráz enzim a primer 3’-végétől indulva megkezdi a komplementer DNS-szál szintézisét, felhasználva egyaránt a dNTP és ddATP-molekulákat. A leolvasni kívánt DNS-szakaszban található timin bázisokkal szemben a szintetizálódó új szálba dATP vagy ddATP épülhet be (a két nukleotid koncentrációjának arányától függő valószínűségekkel). Amennyiben dATP épül be, a szálszintézis folytatódik; viszont ha ddATP épül be, az új szál szintézise leáll a reaktív 3’-OH-csoport hiánya miatt. Ez a lánctermináció, amit a 19.24. ábra szemléltet.

19.24. ábra: Egy didezoxi-nukletid (ddATP) szerkezete és a lánctermináció sémája

19.24. ábra: Egy didezoxi-nukletid (ddATP) szerkezete és a lánctermináció sémája

A reakció során tehát különböző hosszúságú új DNS-szakaszok keletkeznek, melyek hossza tükrözi a timin bázisok távolságát a primer 5’ végétől. A ddGTP-vel, ddCTP-vel illetve ddTTP-vel végzett párhuzamos reakciók esetében a szintetizált szálak hossza rendre a citozin, guanin és adenin bázisok pozíciójától függ.

A DNS-láncok méret szerinti elválasztása eredetileg poliakrilamid gélen történt: A négy különböző szekvenáló reakció során keletkező új DNS-láncok méreteinek ismeretében a templát DNS-szál bázissorrendjét le lehet olvaasni (ez a szekvenáló létra). Fontos tudnunk, hogy a láncterminációs szekvenálás során max. 1000 nukleotid hosszúságú láncok keletkeznek, s ezeket lehet felbontani ezzel a módszerrel (az agaróz gélektroforézis nagyobb méretű DNS fragmentumok szétválasztására szolgál, ezért kell itt poliakrilamid géleket használni). A szekvenáló létra előhívása α-32P-dATP vagy α-35S izotóppal jelölt (az α-foszfát-csoport egyik oxigénjét lehet kénre cserélni) dCTP beépülése után autoradiográfiával történik.

A szekvenáló létra létrejöttének sémáját a 19.25. ábra és a 13. animáció mutatja be.

19.25. ábra: A Sanger-féle láncterminációs szekvenálás sémája, a szekvenáló létra kialakulása

19.25. ábra: A Sanger-féle láncterminációs szekvenálás sémája, a szekvenáló létra kialakulása

19.5.2. Automata fluoreszcens szekvenálás

Az automata fluoreszcens szekvenálás kidolgozása és a szekvenátorok megjelenése (a technika kidolgozása Leroy Hood nevéhez fűződik) tette lehetővé a genom projektek megszületését, mivel nagymértékben felgyorsította a Sanger-féle szekvenáló reakciók kivitelezését.

További újítás volt, hogy a reakció „fokozása” érdekében egy PCR készülékben zajlik a láncszintézis, ezáltal kevesebb templáttal lehet indítani a reakciót, illetve több jelölt új DNS fragmentum keletkezik, így a detektálás is könnyebbé válik. Az automata fluoreszcens szekvenálás során radioaktív jelölések helyett kizárólag fluoreszcens festéket alkalmaznak. A fluorofórt vagy a ddNTP-kre vagy a szekvenáló primerekre lehet bevinni.

A módszer egyszerűségét az adja, hogy négy reakcióelegy helyett elegendő eggyel dolgozni, köszönhetően a négyféle fluoreszcens festékkel jelölt didezoxi-nukleotidoknak. A jelölt DNS fragmentumokat kapilláris gélelektroforézissel választják szét. Ennél az elektroforetikus eljárásnál egy 50-70 cm hosszú, 50-100 µm belső átmérővel rendelkező kapillárisban található a térhálós gélmátrix. A futtatni kívánt mintát a kapillárisba töltik, majd a kapilláris végeire elektromos feszültséget kapcsolnak, így a DNS az anód felé fog vándorolni. A vándorlás közben érvényesül a gélmátrix szűrőhatása, így a kisméretű molekulák haladnak a leggyorsabban. A kapilláris anód felőli végén folyamatosan történik a négyféle dideoxinukleotidhoz kötött fluoreszcencia-jel detektálása, amelyet számítógép rögzít. A folyamatos detektálás eredménye egy kromatogram (másnéven szekvenogram) lesz, melyen időben láthatjuk, hogy adott időpillanatban mely fluorofór haladt át a detektor előtt, így meghatározhatjuk a templát DNS szekvenciáját. Négy szín reprezentálja a különböző nukleotidokat: piros = T, zöld = A, sárga = G, kék = C. Egy automata szekvenálás eredményét a 19.26. ábra mutatja.

19.26. ábra: Automata láncterminációs szekvenálás eredménye (szekvenáló kromatogram)

19.26. ábra: Automata láncterminációs szekvenálás eredménye (szekvenáló kromatogram)

Szekvenátortól függően egyszerre akár 96 mintát is tudnak analizálni kapilláris géllel, és egy futással körülbelül 900-1000 nukleotidig lehet leolvasni a szekvenciát.

Elvárás minden DNS szekvenáló projekt esetében, függetlenül a módszertől, hogy mindkét DNS szálat szekvenálni kell, mivel így, ha a két független információ a komplementaritásnak megfelelő lesz, biztosak lehetünk benne, hogy a templát valós szekvenciáját olvastuk le.

19.5.3. Új-generációs szekvenálás

Az elmúlt évek során megjelentek az úgynevezett új-generációs szekvenálási technikák (next-generation sequencing), amelyek nagy előrelépést jelentettek a szekvenálás területén azáltal, hogy lehetővé teszik egy kísérletben akár 105-106 különböző DNS-minta párhuzamos és gyors, automatizált leolvasását (nagy áteresztőképességű, HTP: high-throughput módszer). Ezen eljárások során nincs szükség a DNS-láncok időigényes, méret szerinti elválasztására. Szintén enzimatikus módszerekről van szó, de már nem csak az új szál szintézisén alapulnak (a részletekre ebben a könyvben nem térünk ki). Hátrányuk, hogy valamivel több hibát ejtenek, mint a Sanger-módszer, és egy reakció során viszonylag rövid (néhány 100 bázis) DNS-darabot lehet csak szekvenálni.

Elsősorban a funkcionális és a környezeti genomika (metagenomika, azaz mikrobiális genomok elválasztását nélküli együttes analízise környezeti mintákból), valamint a transzkriptomok vizsgálata területén alkalmazzák őket. Fontos megjegyezni, hogy ezek a módszerek nem csak DNS-szekvenálására, hanem mRNS, kis RNS-ek és az ún. kromatin immunoprecipitációval előállított génexpresszió szabályozásban résztvevő DNS régiók szekvenálására is alkalmasak.

A második generációs szekvenátorok gyártása és fejlesztése különálló iparággá nőtte ki magát. Számos biotechnológiai cég kínál egymástól eltérő módszereken alapuló szekvenátorokat.