19.6. Irányított in vitro mutagenezis

Géntechnológiai módszerekkel lehetőség nyílt arra is, hogy a DNS-szakaszok információtartalmát tervezetten, irányítottan megváltoztassuk. A változtatás folyamatát irányított (hely-specifikus) mutagenezisnek nevezzük. Ezzel beköszöntött a „reverz genetika” korszaka. Ettől kezdve nem kell a véletlen mutációkra hagyatkozni, amelyek segítségével – miután azonosítottuk a mutáns gént – az elromlott gén funkciójára következtethetünk, hanem fordított sorrendben, először kitaláljuk, hogy melyik gén funkciójára vagyunk kíváncsiak, majd azt célzottan megváltoztatjuk.

E változtatásokat leggyakrabban a gének szabályozó szakaszain vagy a gének kódoló régióján végzik, s a cél a gének vagy az általa kódolt RNS molekulák illetve fehérjék működésének vizsgálata. Az irányított mutagenezis segítségével tetszőleges mutációkat vihetünk be rekombináns fehérjék génjébe, bármilyen aminosavat bármilyen másikra cserélhetünk (szubsztitució), kihagyhatunk (deléció) vagy betoldhatunk (inzerció) előre megtervezett módon (racionális fehérjemérnökség). A mutációk hatásának vizsgálatával megérthetjük azt, hogy ezek a fehérjék hogyan működnek. Ez az egyik legelterjedtebb módszer annak vizsgálatára, hogy egyes aminosav oldalláncok milyen szerepet játszanak adott fehérje térszerkezetének stabilizálásában, egy enzimatikus reakció hatásmechanizmusában, egy kölcsönhatás kialakításában és így tovább (ezek a kísérletek tehát a fehérjék szerkezet-funkció összefüggéseinek feltárására irányulnak).

A mutációk révén megváltozott tulajdonságú fehérjék hozhatók létre, melyek valamilyen szempontból előnyösebbek lehetnek, mint az eredeti forma. Említsünk meg egy „fehérjemérnöki” módon előállított fehérje példát. A mosóporokban használt fehérjebontó enzim, a szubtilizin egy bakteriális proteináz. Az enzimben van egy metionin, melynek oxidációja tönkreteszi a működését. A mutáns enzim, melyben a metionin helyett alanin vagy szerin van, ellenáll az oxidációnak, ezért fehérítőszerekkel együtt is használható.

A rekombináns DNS-en történő változtatások közül deléciót restrikciós enzimek (és DNS-ligáz) alkalmazásával lehet egyszerűen létrehozni. A másik két mutációs lehetőség, az inszerciós illetve a szubsztitúció is könnyen végrehajtható az ún. kazetta mutagenezis segítségével (lásd 19.27. ábra).

A mutálandó DNS fragmentumot egy dupla szálú plazmid tartalmazza. Két restrikciós endonukleáz emésztésével hasítjuk ki a mutálandó DNS szakasz környezetét, majd a megfelelő ragadós véggel rendelkező, mutációt tartalmazó szintetikus oligonukleotidokkal elkészített DNS kazettát T4 DNS-ligáz segítségével a plazmidba ligáljuk és E. coli baktériumba transzformáljuk.

19.27. ábra: A kazetta mutagenezis sémája

19.27. ábra: A kazetta mutagenezis sémája

Hely-specifikus mutációk bevitelére egy ennél általánosabb módszert dolgozott ki Michael Smith 1978-ban (amiért 1993-ban Nobel-díjat kapott, megosztva Kary Mullis-szel a PCR felfedezőjével), amihez egyszálú templát DNS-re, mutációt tartalmazó oligonukleotid primerre és DNS-polimerázra van szüksége.

Smith egyszálú templátot állított elő M13-alapú rekombináns DNS-ről, amihez olyan oligonukleotid primert adott, amely mutációt tartalmazott. A hibridizáció megtörténik akkor is, ha a templát és a szintetikus oligonukleotid között nem 100%-os a komplementaritás (azaz ha van „mismatch”), s a DNS-polimeráz is primerként tudja használni a mutáns oligonukleotidot, feltéve, hogy a 3’-végen legalább 8-10 nukleotid Watson-Crick bázispárosodással kapcsolódik a templáthoz. A DNS-polimeráz megszintetizálja az új szálat úgy, hogy gyakorlatilag körbeírja az egyszálú templát rekombináns DNS-t (lásd a 19.28. ábra első lépéseit).

Viszont van még egy probléma, nevezetesen, hogy egy olyan DNS-t keletkezett, aminek az egyik szála vad-típusú (az eredeti szekvencia), a másik mutáns (ez egy heteroduplex DNS). Kérdés, hogyan lehet ezek után előnyt biztosítani az újonnan készült mutáns szálnak a templát, vadtípusú szállal szemben?  Számos módszert kidolgoztak az elmúlt évtizedekben, amelyek mind az eredeti templát szál szelektív lebontásán alapszanak. Közülük a ma már klasszikusnak számító Kunkel-módszert mutatjuk be.

19.6.1. Hely-specifikus mutagenezis Kunkel-módszerrel

A helyspecifikus mutagenezis ugyan egyik legrégebbi, de néhány területen még a ma is használatos módszerét Thomas Kunkel 1985-ben közölte. A módszer a következő lépésekből áll (lásd 19.28. ábra).

Az inszertet tartalmazó M13-alapú vagy fágmid konstrukcióról egyszálú DNS-t hoznak létre, ami a mutagenezis során templátként fog szolgálni. Ezek a konstrukciók E. coli sejtekben képesek kétszálú DNS plazmidként szaporodni (ez a replikatív forma, lásd 19.2.4.3), egy helper fág hatására azonban egyszálú DNS másolatok jönnek létre. A második lépésben a fentebb ismertetett módon mutáns oligonukleotid primer és DNS-polimeráz használatával heteroduplex DNS-t hoznak létre, amit E. coli sejtekbe transzformálnak.

A sejten belül a mutáns szál szelekciójának az alapja, hogy a templátként szolgáló vad-típusú egyszálú fágmid timin helyett nagyrészt uracilt tartalmaz. Ezt úgy érik el, hogy az egyszálú DNS templátot olyan E. coli törzsben szaporítják, amiben hibás adUTP-áz és uracil-N-glikozidáz gén (dut--, ung-- törzs, lásd 19.28. ábra).

A két enzim azért felelős, hogy egyrészt a sejtben a bioszintetikus utakon keletkező, de a nukleinsavak szintéziséhez nem szükséges dUTP-t eltávolítsa (dUTP-áz), másrészt a DNS-be véletlenül beépült vagy mutációval keletkezett uracilt egy hibajavító mechanizmus első lépéseként (lásd 13.12.3.2. fejezet) eltávolítsa (uracil-N-glikozidáz). A két enzim hiányában uracil is beépül a DNS-be, s végső soron a rekombináns vírusrészecskékben található egyszálú rekombináns DNS is uracil tartalmú lesz.

19.28. ábra: A Kunkel-féle helyspecifikus mutagenezis módszer

19.28. ábra: A Kunkel-féle helyspecifikus mutagenezis módszer

A mutációt tartalmazó második szál T7 DNS-polimerázzal történő in vitro elkészítéséhez dUTP-t nem használnak fel, ezért az újonnan szintetizált szál uracilt nem tartalmaz. A következő lépésben a vad típusú, uracilt tartalmazó, és a mutáns, uracilt nem tartalmazó heteroduplex DNS-t normál E. coli törzsbe transzformálják, amiben az uracil-N-glikoziláz enzim hatására a vad-típusú DNS lebomlik, s szelektáltan csak a mutáns szálról készülnek replikatív formák, amiket izolálni lehet, mint hely-specifikus mutáns rekombináns DNS-t. Természetesen a mutáció meglétét szekvenálással ellenőrizni kell.