19.7. Rekombináns fehérjék előállítása

A rekombináns DNS technológia egyik legfontosabb vívmánya, hogy a kutatások tárgyát képező fehérjéket nagy mennyiségben, viszonylag egyszerűen lehet előállítani géntechnológiai úton. A vektorokat bemutató alfejezetben volt róla szó, hogy ehhez expressziós vektorokat kell használni, amely segítségével az inszertek kódolta szekvencia kifejezhető.

Az expressziós vektoron olyan DNS elemeknek kell lenniük, amelyeket felismer a gazdasejt transzkripciós és fehérjeszintetizáló apparátusa. Bakteriális gazdasejt esetén ezek a transzkripcióhoz szükséges bakteriális promóter és transzkripciós terminátor szakasz, iiletve a transzlációhoz szükséges, az mRNS riboszómához való kötődését biztosító Shine-Dalgarno-szekvencia (RBS: ribosome binding site). A genetikai kód univerzális volta miatt intron-mentes eukarióta cDNS-ek is expresszálhatók baktériumban. A rekombináns DNS-ről keletkezett fehérjét (akkor is, ha a szekvenciája megegyezik az eredeti a természetes forrásból kivont fehérje szekvenciájával) rekombináns fehérjének nevezzük.

A gazdasejt nem csak baktérium lehet, hanem eukarióta élesztő (pl. S. cerevisiae) vagy más eukarióta sejtvonal vagy akár transzgenikus állat és növény is. Ezek a gazdasejtek is képesek heterológ expresszióra, vagyis arra, hogy nem a saját, hanem más fajból származó fehérjéket termeljenek. Mindegyik rendszernek vannak előnyei és hátrányai, valamint megvannak a saját expressziós vektorai. Hozzátesszük még, hogy léteznek in vitro expressziós rendszerek is, ahol sejtmentes rendszerben, de sejtkivonatokból származó riboszómák segítségével lehet rekombináns fehérjéket előállítani, bár az in vivo módszereknél kisebb mennyiségben (sőt, ezek a rendszerek időben megelőzték a heterológ rendszereket, lásd a genetikai kód feltörésénél használt kóli sejtkivonatot).

19.7.1. Prokarióta expressziós rendszerek

Egy tipikus prokarióta expressziós vektor térképét és a lényeges DNS elemeket az 19.29. ábra mutatja be.

19.29. ábra: Egy expressziós vektor térképe

19.29. ábra: Egy expressziós vektor térképe

A legtöbb DNS-elemről a korábbiakban már volt szó. A legfontosabb a promóter, hiszen ez fogja eldönteni a transzkripció mennyiségét (gondoljunk rá, hogy az esetek többségében a fehérjét „túltermeltetni” (overexpression) akarjuk, vagyis olyan nagy mennyiségben előállítani, amit még a gazdasejt elvisel. Ez a legjobb expressziós rendszereknél akár a teljes fehérjemennyiség 50%-a is lehet. Korábban gyakran használták a laktóz operon promóterét is, de a legnépszerűbb vektorokban egy, a T7 bakteriofágok által használt promóter található. A T7 promótert kizárólag a T7 fág RNS-polimeráz enzime ismeri fel, a kóli saját RNS-polimeráza nem, ezért amíg a sejt nem termel T7 RNS-polimerázt, a gén nem expresszálódik. Azt számos különböző módon lehet biztosítani, hogy a gazdasejtben jelen legyen a T7 RNS-polimeráz génje, mégpedig indukálható formában.

A promóter mellett az expressziós vektorok további szabályozó elemeket is tartalmaznak. Az 19.29. ábra szerepel egy operátor régió, ami leggyakrabban a laktóz operonból származik. A szabályozott expresszióval, a rekombináns fehérje expresszióját akkor lehet bekapcsolni a szintetikus és nem-metabolizálódó induktor, az IPTG hozzáadásával, amikor a gazdasejtet már nagy mennyiségben felszaporodott. Ezzel ki lehet védeni az idegen fehérje esetleges toxikus hatását. Vegyük észre, hogy a bemutatott expressziós vektor térképén a lac-represszor gén is szerepel, tehát extra mennyiségben termelődik a sejtben a represszor fehérje, s ezáltal gátolni tudja nem csak a bakteriális kromoszóma lac-operonját, hanem a több kópiában jelen levő expressziós vektor transzkripcióját is, a lac-oporátorokhoz kötődve.

A legelső, gyógyászati célra használható rekombináns humán fehérjét E. coli sejtekben állították elő. Ez a rekombináns inzulin volt (lásd 19.30. ábra), amelyet a Genentech géntechnológiai cég 1978-ban állított elő, majd egy nagy gyógyszeripari cég Humulin néven hozott gyógyszerként forgalomba 1982-ben. Korábban a cukorbetegek sertés inzulint kaptak a humán inzulin pótlására, ami egyeseknél immunreakciót váltott ki.

Genetikailag módosított baktériumokkal terápiás célra használható sok másfehérjét is előállítanak, így például véralvadási faktorokat, vagy növekedési hormonokat.

19.30. ábra: Rekombináns humán inzulin előállításaE. colisejtekben

19.30. ábra: Rekombináns humán inzulin előállítása E. coli sejtekben

19.7.2. Rekombináns fehérjék előállításának további lehetőségei

Ahogy említettük, rekombináns fehérjét eukarióta expressziós rendszerben, sejtkultúrában, de transzgenikus élőlényekben (lásd a következő alfejezet) is elő lehet állítani. Mikor használnak az olcsón és egyszerűen tenyészthető baktériumsejtek helyett komplikáltabb és drágább expressziós rendszereket?

Ennek számos oka lehet. Amennyiben a cél a fehérje túltermeltetése, nem biztos, hogy egy emlős fehérje a prokarióta sejtben natív formában fog termelődni – lehet, hogy a feltekeredése nem lesz megfelelő (például a baktériumból hiányzó eukarióta dajkafehérjék hiányában), vagy nem készülnek el azok a poszttranszlációs módosulások (például glikoziláció), amelyek az eukarióta fehérje működéséhez szükségesek.

Gazdasejtnek szóba jöhetnek élesztő, rovar és emlőssejtek. A rovarsejt-specifikus bakulovírus vektorok segítségével igen hatékony fehérjetermelő rendszereket hoztak létre. Nemcsak sejteket, hanem molylepkék lárváit is lehet velük fertőzni, s a bábokból, mint fehérjegyárból lehet kinyerni a rekombináns fehérjéket.

Miben különböznek az eukarióta expressziós vektorok a prokariótákétól? Először is a klónozás mindig baktériumban történik, tehát olyan vektorokat használnak, amelyek tartalmaznak bakteriális replikont is. Az inszert expressziójához szükséges promóternek természetesen eukarióta eredetűnek kell lennie. Túltermeltetésre kiválóan alkalmasak az erős vírus promóterek (leggyakrabban citomegalovírus promótert használnak). A vektorok tartalmazhatnak további szabályozó elemeket, így például enhanszer elemet is.

Egy másik kísérleti ok, amiért eukarióta rendszert választanak gazdának az, hogy a rekombináns fehérjét a saját környezetében akarják tanulmányozni. További, már említett előny, hogy a fehérje esetleges poszttranszlációs módosulásai a prokariótában nem, vagy nem megfelelően mennek végbe.

Amennyiben sejten belül akarják tanulmányozni egy fehérje működését, nagy segítséget nyújt, ha a vizsgált fehérjét ún. fúziós fehérjeként GFP-vel összekapcsolva expresszáltatják.

A GFP (Green Fluorescence Protein) egy zöld színben fluoreszkáló fehérje, „molekuláris lámpásként” használható. Ez az eredetileg egy, a Csendes-óceánban élő medúzából (Aequoria victoria) származó 27 kDa tömegű fehérje, amelynek felfedezéséért és a géntechnológiába történő bevonásáért három kutató, Osamu Shimomura, Martin Chalfie és Roger Tsien 2008-ban Nobel-díjat kapott. A GFP a feltekeredése után a levegő oxigénjének hatására olyan kovalens módosuláson megy keresztül, ami egy intramolekuláris, kizárólag a polipeptidlánc három aminosavmaradékából kialakuló fluorofórt hoz létre. Ez kék színű fénnyel gerjesztve zöld fényt emittál. A zöld béta-hordó szerkezetű fehérje (lásd 19.31. ábra) nagyon stabil, s majdnem minden fehérjével fúziós formában összekapcsolva is megőrzi fluoreszcenciáját.

A fúziós fehérje a rekombináns DNS szintjén valósul meg úgy, hogy a GFP kódoló régiója és a vizsgált fehérje kódoló régiója egy transzlációs egységet alkot. A fúziós konstrukciót úgy alakítják ki, hogy az N-terminális fehérje kódoló régiójának végéről a stop kodont eltávolítják, s azonos leolvasási keretben a fúziós partner start kodonjával kapcsolják össze. Így egy közös nyitott leolvasási keret (ORF: open reading frame) alakul ki, amiről egy fúziós (más néven kiméra) fehérje keletkezik. A két fehérje kódoló régiója közé sokszor egy flexibilis linkert kódoló szakaszt építenek be, ami lehetővé teszi, hogy a riboszómán történő szintézis után a két lánc önállóan tekeredjen fel és mindkettő funkcióképes legyen az adott gazdasejtben.

19.31. ábra: A GFP (zöld fluoreszcens fehérje) térszerkezete.A három aminosavból autokatalízissel kialakuló fluorofórt zöld golyókkal jelöltük (PDB: 1EMA)

19.31. ábra: A GFP (zöld fluoreszcens fehérje) térszerkezete. A három aminosavból autokatalízissel kialakuló fluorofórt zöld golyókkal jelöltük (PDB: 1EMA)

Léteznek olyan vektorok is, amelyek a GFP hely-specifikus mutagenezissel előállított, különböző színű variánsait (pl. YFP: sárga, CFP: ciánkék színű), illetve a GFP-vel nem rokon, más színű fluoreszcens fehérjét (pl. DsRed: vörös) kódolják fúziós címkeként. Ezek a fúziós címkék más-más hullámhosszú fénnyel gerjeszthetők, és máshol van az emissziójuk. Segítségükkel akár két különböző színnel jelölt fehérje együttes expressziója (koexpressziója) és a sejten belüli lokalizációja, akár kölcsönhatásuk (kolokalizáció) könnyen nyomon követhető. Egy ilyen kísérlet eredményét (egy zöld- és egy vörös-fúziós fehérje kolokalizációja, ami a képen sárga színnel jelenik meg) mutatja be a 19.32. ábra.

19.32. ábra: Két, különböző fluoreszcens festékkel megjelölt fehérje sejten belüli kolokalizációja.A bal oldali és a középső ábrán a két fehérjét külön-külön transzfektálták egy emlős sejtvonalba. A jobb oldali ábrán koexpressziót végeztek, s a két szín „keveréke” a két fehérje együttes lokalizációjára utal.

19.32. ábra: Két, különböző fluoreszcens festékkel megjelölt fehérje sejten belüli kolokalizációja. A bal oldali és a középső ábrán a két fehérjét külön-külön transzfektálták egy emlős sejtvonalba. A jobb oldali ábrán koexpressziót végeztek, s a két szín „keveréke” a két fehérje együttes lokalizációjára utal.