19.8. Transzgenikus élőlények és génterápia

A genetikailag módosított élőlények (GMO: Genetically Modified Organism) magukba foglalják az összes olyan szervezetet, melyek genetikai anyagát módosították valamely géntechnológiai módszerrel. A transzgenikus élőlény pedig egy olyan GMO, melybe egy másik szervezetből izolált gént juttatunk be, amit eredetileg az nem tartalmazott. Az így „kívülről” bejuttatott, exogén eredetű transzgén öröklődik az utódokban, ha az a csíravonalba került be.

19.8.1. Transzgenikus állatok

Transzgenikus állatok előállítása többféle módszerrel történhet. Emlősök frissen megtermékenyített petesejtjébe, a még nem fuzionált hímivarsejt pronukleuszba (ami nagyobb, mint a petesejt nukleusza) mikorinjektálással be lehet juttatni néhány pikoliter DNS-t (lásd 19.33. ábra), és az véletlenszerűen beépülhet a genomba. Egerek petesejtjével elvégezve a kísérletet, a sejtek kb. 2%-ában az új gén beépül valamelyik kromoszómába. Néhány osztódás után a transzgént tartalmazó korai embriót egy álvemhes nőstény méhébe ültetik, amelyből szerencsés esetben transzgenikus állat születik. A transzgén beépülését a fiatal egér levágott farokvégéből izolált DNS-sel végzett Southern-lenyomat kísérlettel ellenőrzik.

19.33. ábra: Megtermékenyített petesejt mikroinjektálása (balra támasztó pipetta, jobbra kapilláris, a transzgén DNS oldattal; a DNS-t a hím pronukleuszba injektálják)

19.33. ábra: Megtermékenyített petesejt mikroinjektálása (balra támasztó pipetta, jobbra kapilláris, a transzgén DNS oldattal; a DNS-t a hím pronukleuszba injektálják)

Az első transzgenikus állatot Brinster és Palmiter 1982-ben állították elő, amikor is egy egér megtermékenyített petesejtjének pronukleuszába mikroinjektálással patkány növekedési hormon (GH) transzgént juttattak. A híres egér ikerpár a Nature folyóirat címlapjára is rákerült (lásd 19.34. ábra). 1985-re nyúl, bárány illetve sertés megtermékenyített petesejtjébe is sikerült mikroinjektálással transzgént bevinni.

Megjegyzendő, hogy a patkány GH transzgént tartalmazó egér nem azért lett nagyobb, mert a patkány GH az állat méretét szabja meg, hanem az ún. dózishatás miatt, azaz több patkány transzgén épült be véletlenszerűen az egér genomba. A transzgént a nehézfémekkel szabályozott metallotionein gén promótere mögé építették be a rekombináns DNS konstrukcióba.

19.34. ábra: A patkány növekedési hormon transzgént tartalmazó egér (bal) és vad típusú testvére (jobb) a Nature folyóirat címlapján(Vol. 300,1982. december 16 ; a Nature Publishing Group engedélyével)

19.34. ábra: A patkány növekedési hormon transzgént tartalmazó egér (bal) és vad típusú testvére (jobb) a Nature folyóirat címlapján (Vol. 300,1982. december 16 ; a Nature Publishing Group engedélyével)

A módszer tehát lehetőséget teremtett arra, hogy bármilyen gént bejuttassanak az állatok genomjába úgy, hogy az minden szövetben és sejtben jelen legyen. Az így módosított organizmusban a gént szabályozó régiók megfelelő megválasztásával lehetséges indukált, vagy konstitutív fehérjeexpressziót létrehozni, akár szövet-, vagy sejtspecifikus módon.

Számos rekombináns fehérjét termelnek emlőmirigy specifikus promóterrel rendelkező génkonstrukciókkal transzgenikusemlősben (kecskében, juhban, sertésben). Az így termelt α-antitripszin (az emfizéma, tüdőtágulás gyógyszere lehet), antitrombin-III (véralvadási gyógyszer) és a szöveti plazminogén aktivátor (TPA; többek között szívinfarktus után közvetlenül a vérrögök feloldására szolgáló gyógyszerfehérje) gyógyszerként történő alkalmazását már engedélyezték vagy engedélyezés alatt állnak.

19.8.2. Transzgenikus növények

A transzgenikus növények előállítására is többféle módszer áll a rendelkezésünkre. A legrégebben ismert, és ma is az egyik leggyakrabban használt eljárás egy különleges növényi parazita, az Agrobacterium tumefaciens tumor indukáló (Ti) plazmidját használja. Ez a baktérium többféle kétszikű növény gyökerén élősködik, s képes a plazmid egy darabját (T-DNA; tumor-okozó DNS) egy, a bakteriális konjugációhoz hasonló folyamattal a gazdanövény sejtjeibe bejuttatni (lásd 19.35. ábra).

A transzgént egy ún. köztes vektorba klónozzák (a Ti plazmid ~200 kbp méretű, ezért közvetlenül nem lehet klónozásra használni), amiről aztán E. coli sejtekben homológ rekombinációval kerül át a Ti plazmid-alapú vektorba, a daganatképző és a baktériumot ellátó tápanyagok szintéziséért felelős gének helyére. (Ez utóbbiak közé tartozik a nopalin-szintáz, aminek a promótere eukarióta típusú – mivel a természetes plazmiddal kerül át a növénybe és ott is aktív –, ezért mögé kerül a transzgén.)

A konstrukciót Agrobacterium sejtekbe transzformálják, majd a baktériumokkal megfertőznek megsebzett leveleket. A baktérium Ti plazmidjából a növényi sejtekbe konjugációval bekerült rekombináns T-DNS, mely tartalmazza a transzgént is, a növényi sejtek genomjába véletlenszerűen beépül. A megfelelő plazmiddal transzformált növényi sejtek antibiotikum jelenléte mellett szelektálhatóak (a 19.35. ábrán bemutatott kísérletben neomicinnel szelektálnak, mivel a T-DNS-be a transzgén mellett neomicin-foszfotranszferáz gén van).

A transzgént felvett sejtekből a transzgenikus növényt regenerációval állítják elő (a növények jó részét szomatikus sejtekből is regenerálni lehet növényi hormonok, auxinok jelenlétében).

19.35. ábra:Agrobacterium-közvetített génátvitel növényi sejtbe.A transzgenikus növények előállításának egyik típusa azAgrobacterium tumefacienstalajbaktériummal történő fertőzés, mely segítségével a növényi genomba beépülő T-DNS-ről történik a transzgén átírása.

19.35. ábra: Agrobacterium-közvetített génátvitel növényi sejtbe. A transzgenikus növények előállításának egyik típusa az Agrobacterium tumefaciens talajbaktériummal történő fertőzés, mely segítségével a növényi genomba beépülő T-DNS-ről történik a transzgén átírása.

Egyszikű növényi sejtekbe is be lehet transzgént juttatni elektroporációval, miután a sejtfalat celluláz enzimmel eltávolították (ezáltal protoplasztot hoztak létre).

Végül megemlítünk egy szellemes génbejuttatási módszert, amit manapság leginkább használnak transzgenikus kultúrnövények (szójabab, kukorica, rizs) előállítására. Ez az ún. génpuska (lásd 19.36. ábra). A bejuttatandó DNS-t arany vagy volfrám részecskék felszínén lövik be (400 m/s-os sebességgel) növényi protoplasztokba, meglepően jó hatékonysággal.

A következőkben bemutatunk néhány példát arra, hogy milyen transzgéneket juttatnak be növényekbe. Az elsők között (1987-ben) rovarra toxikus fehérjét termelő transzgént tartalmazó dohánynövényt állított elő. Ez volt a Bt dohány, amibe Bacillus thuringiensis baktériumban termelődő endotoxin génjét vitték be, ami rovarölő hatású fehérjét termel. A Bt növények alkalmazhatóságával kapcsolatban az az aggály, hogy mivel az ilyen növényeket nemcsak a kórokozók, hanem a közelben élő más rovarok is elfogyaszthatják, a toxin ezek populációit is pusztíthatja.

2000-ben állították elő az első olyan transzgenikus növényt, az aranyrizst, melynek a tápértékét sikerült javítani. Nevét sárgás színéről kapta, mely β-karotin termelésének köszönhető. A cél a főleg a harmadik világot érintő A-vitamin hiány miatti nagyfokú elhalálozás (és vakság) visszaszorítása volt. Habár humanitárius célokat szolgál, negatív visszhangot váltott ki a közvéleményben elsősorban transzgenikus volta miatt. (A β-karotin előállításához, ami az A-vitamin prekurzora (lásd 11.3.2. fejezet), két enzim hiányzik a rizs terméséből, ezeket vitték be transzgénként.)

19.36. ábra: Génpuska, egy új DNS génbeviteli eszköz működési sémája

19.36. ábra: Génpuska, egy új DNS génbeviteli eszköz működési sémája

19.8.3. Génterápia

A génterápia célja, hogy genetikailag hibás testi sejtek genomját módosítsa emberben, a helyes gén bevitelével pótolva az „elromlott” gén szerepét. Az emberi zigóta, vagy az ivarsejtek genetikai módosítása etikai normákat sért, ezért a génterápia csak a szomatikus sejtek genetikai állományát célozza meg. Kétféle szomatikus sejttípust használhat a génterápia: őssejteket és differenciált, nem osztódó sejteket.

A génterápia legfontosabb kérdése, hogy milyen hordozó vektorral juttassák be a terápiás gént a célsejtekbe. Erre a célra többféle vírus-alapú vektorral kísérleteznek, amelyek közül megemlítjük a retrovírusokat, adenovírusokat és az adeno-asszociált vírusokat.

Az őssejtek esetében a terápiás gént hordozó vektor általában retrovírus, ami beépül a genomba, így osztódást követően is jelen van az utódsejtekben. Génterápiára jelenleg kétféle forrásból származó őssejtet használnak, az egyik a csontvelőből származó hematopoetikus őssejt, a másik egy, a bőr alsó rétegében található őssejttípus. Ezek az őssejtek viszonylag könnyen hozzáférhetőek, és ex vivo is fenntarthatók. A génterápia másik célpontja - differenciált, nem osztódó sejtek - esetében, a vektor nem feltétlenül kell, hogy beépüljön a genomba, ezért a retrovírus vektorok mellett DNS vírusokkal is kísérleteznek.

A retrovírusok egyszálú RNS genommal rendelkeznek, mely a fertőzött sejtben a virális reverz transzkriptáz és integráz enzimek segítségével kétszálú DNS-sé íródik, és beépül a fertőzött sejt genomjába. A terápia egyik eleme egy olyan vektor DNS, melyben fontos virális géneket cserélnek le a terápiás gén beépítésekor (rekombináns vírus). A vektor tehát önálló vírusként nem funkcionál. A másik elem egy helper (segítő) vírus, mely képes termelni az összes szükséges virális fehérjét (reverz transzkriptáz, integráz, burokfehérjék stb.), de hiányzik a genomjából egy szakasz, ami a genom virális részecskébe pakolásához kell. A két elem együttes alkalmazásával olyan vírusok keletkeznek, melyek tartalmazzák a terápiás gént, hordoznak reverz transzkriptázt és integrázt, vagyis a DNS beépülhet a genomba, de a beépült vektor DNS már nem funkcionál többé vírusként.

A jelenleg rendelkezésre álló retrovírus vektorok esetében a vektor genomba integrálódása nem specifikus, és a véletlenszerű beépülés más gének tönkremeneteléhez vezethet. A véletlenszerűen beépült vektor érintetlenül hagyja az eredeti hibás gént, vagyis csak akkor ígéretes a terápia, ha a hibás gén funkciókiesést jelentett, nem pedig funkcióváltozást. A helyspecifikus rekombináció lehetővé tenné a hibás gén cseréjét, tehát megoldaná ezt a gondot – de egyelőre ilyen vektorok nem állnak rendelkezésünkre.

Az első génterápiás kísérletet 1990-ben végezték, egy adenozin-dezamináz (ADA) enzimhiányos, súlyos kombinált immundeficiencia (SCID: severe combined immunodeficiency) betegségben szenvedő pácienssel. A betegből eltávolított csontvelői őssejteket retrovírus konstrukcióval fertőztek, amely funkcionális ADA gént tartalmazott, majd a sejteket visszajuttatták a szervezetbe. Azóta sok száz hasonló, retrovíruson alapuló génterápiát alkalmazó klinikai tesztről számoltak be, különböző, elsősorban immunsejtek kóros működésével összefüggő betegségek gyógyításával kapcsolatban, egyelőre felemás eredménnyel, a már jelzett okok miatt.

A adenovírusok kétszálú DNS genommal rendelkeznek és nem épülnek be a genomba. A sejtmagban extrakromoszómálisan átmenetileg fennmaradnak, de a sejtosztódás után „kihígulnak”, tehát az ilyen alapú vektor konstrukciókat folyamatosan újra be kell juttatni szervezetbe. Előnyük viszont, hogy a nem-specifikus integráció miatti problémák ennél a vektor típusnál nem állnak fenn. Egy ilyen, adenovírussal-közvetített génterápiás kísérletet mutat be a 19.37. ábra. A rekombináns vírus receptor-közvetített endocitózissal jut be a sejtekbe. A sejt belsejében a vezikulum lebomlik, a vírusvektor kiszabadulása után a sejtmag pórusaihoz asszociálódik. A sejtmagba a rekombináns vírus DNS-ről a terápiás gén átíródik, a mRNS visszajut a citoplazmába és szintetizálódik a terápiás célú fehérje.

19.37. ábra: Egy lehetséges génterápiás hordozó vektor, az adenovírus célsejt fertőzési lépései(forrás: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Gene therapy.jpg)

19.37. ábra: Egy lehetséges génterápiás hordozó vektor, az adenovírus célsejt fertőzési lépései (forrás: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Gene_therapy.jpg)

Az adeno-asszociált vírus viszont egy adott helyre integrálódik a 19-es kromoszómán. Ezzel a betegséget nem okozó és csak gyenge immunválaszt kiváltó vektorral szintén számos génterápiás kísérletet hajtottak már végre. Az egyszálú DNS genommal rendelkező vírusból olyan vektorokat hoztak létre, amelyekbe (itt nem ismertetett módon) helper vírusok segítségével lehet bevinni a terápiás gént. A vírus különböző szerotípusai különböző és már nem osztódó gazdasejteket fertőznek – mind a két tulajdonságuk ígéretes génterápiás vektorrá teszi őket.

Végül megemlítünk egy olyan lehetőséget is, ahol vírus-alapú génbejuttatás helyett a terápiás gént transzpozonnal viszik be a gazdasejt genomjába. A magyar kutatók közreműködésével kifejlesztett Sleeping Beauty (Csipkerózsika) nevű transzpozon is ígéretes génterápiás eszköz lehet. (A transzpozonok olyan genetikai elemek, „ugráló gének” amelyek mindössze egy gént tartalmaznak, a transzpozázt, ami képes kivágni a transzpozont a genomból és áthelyezni akár sok kópiában is a genomban. Barbara McClintock fedezte fel őket kukoricában 1951-ben, de csak jóval később tárták fel, hogy az élővilágban általánosan elterjedtek. Ezzel is magyarázható, hogy a felfedező csak 1983-ban kapott Nobel-díjat.)