19.9. Célzott génmódosítás in vivo: génkiütés és géncsendesítés

A molekuláris szintű biológiai kutatások egyik fő célja, hogy az élő rendszeren belül derítsék ki a gének és a fehérjék szerepét és működését. Van-e lehetőség arra, hogy a hely-specifikus mutagenezis kapcsán már említett fordított genetikai megközelítést ne csak egy-egy sejt, hanem egy soksejtű organizmus szintjén is alkalmazzák? Az előző fejezetben láttuk, hogy egy állat vagy növény genetikai összetételét meg tudjuk változtatni egy-egy transzgén bevitelével, azonban a transzgenikus technológia hátránya, hogy az esetek döntő többségében a transzgén beépülését a genomba nem lehet kontrollálni (bár a módszerrel egy-egy gén dózishatása vizsgálható több, bárhová beépült gén esetén is – lásd pl. az első, a patkány növekedési hormonra transzgenikus egér esetét a 19.8.1. fejezetben). A 1980-as években, a transzgén technika megjelenésével párhuzamosan megjelentek az in vivo célzott génmódosításra alkalmas módszerek is, ami viszont már az organizmus szintjére emelte a reverz genetikai megközelítést.

Az in vivo célzott génmódosítások, amelyek a kromoszóma DNS-t célozzák meg, ugyan kis hatékonysággal működő homológ rekombináción alapszanak, de alkalmasak egyetlen gén inaktiválására is. Az alapmódszer az, amikor a megcélzott gént inaktiválják. Ez a célzott génkiütés, angolul knockout módszer, amit a magasabbrendű élőlények közül jó hatékonysággal például egereken lehet kivitelezni (KO egér).

A génkiütést technikailag nem könnyű kivitelezni (főleg a homológ rekombináció alacsony hatékonysága és a nem-homológ rekombinációk viszonylag nehéz kiküszöbölése miatt), de van más lehetőség is a gén, pontosabban a már átírt mRNS célzott eltávolítására. Ez pedig az RNS interferencián alapuló ún. géncsendesítés (lásd 19.9.2), amit az1990-es évek végén alkalmaztak először. A módszer alapvetően abban különbözik a génkiütéstől, hogy nem a DNS-t, hanem a génátiratokat, az mRNS molekulákat tesszük tönkre (amiből egy sejtben sok van a DNS-sel ellentétben, ezért a módszer csak erősen lecsökkenti a génexpresszió szintjét, ezért hívjuk géncsendesítésnek). A módszer az egyszerűsége és a génkiütéshez képes olcsósága miatt nagy népszerűségnek örvend a kutatók körében, s a géncsendesítéssel ma már gyakorlatilag az összes emlős gén fenotípus hatását vizsgálni lehet, legalábbis sejtkultúrák szintjén (soksejtű állatok közül pl. a C. elegans fonalféregben nagyon egyszerűen kivitelezhető a módszer az egész állat szintjén).

A következő fejezetben a génkiütésről és a géncsendesítés lesz szó.

19.9.1. Génkiütés (knockout) egérben

A célzott génkiütéses módszer kifejlesztésében kulcsszerepet játszó Mario Capecchi, Oliver Smithies  és Martin Evans  2007-ben Nobel-díjat kapott. Bizonyították, hogy az emlős sejtekben lejátszódó homológ rekombináció felhasználható arra, hogy adott géneket célzottan módosítsanak a genomban. A módszer egy kettős pozitív-negatív szelekción alapszik, melynek segítségével tesztelhetővé vált a homológ rekombináció sikeressége bármely megcélzott DNS szakasz esetén embrionális őssejtbe bejuttatva a megfelelő rekombináns DNS konstrukciót.

A módosítás nem feltétlenül jelenti a megcélzott gén inaktiválását (knockout); lehetséges a megcélzott helyre egy teljes, funkcióképes új gén beépítése is (knockin). A módszerrel lehetőség nyílt bármely gén funkcióját közvetlenül, a teljes élőlényben vizsgálni és elsősorban KO egereket felhasználva emberi betegség kutatásához elengedhetetlen modellállatokat lehetett létrehozni.

Egy emlős homológ rekombinációra alkalmas rekombináns DNS konstrukciót és a rekombináció sémáját a 19.38. ábra mutatja be.

19.38. ábra: A homológ rekombinációra alkalmas, egy pozitív (antibiotikum rezisztencia gén) és egy negatív („érzékenyítő” gén) szelekciós markert tartalmazó rekombináns DNS konstrukciós és a rekombináció sémája

19.38. ábra: A homológ rekombinációra alkalmas, egy pozitív (antibiotikum rezisztencia gén) és egy negatív („érzékenyítő” gén) szelekciós markert tartalmazó rekombináns DNS konstrukciós és a rekombináció sémája

A nem-célzott génbevitellel ellentétben, – amire a transzgenikus állatok létrehozásánál leírt megtermékenyített petesejtbe történő mikroinjektálás a példa – a célzott génmódosításhoz pluripotens embrionális őssejtteket (ES: embryonic stem cells) használunk sejttenyészetben (a kétféle módszer összehasonlítását a 19.39. ábra mutatja be). Ezek a sejtek egérből származnak, mivel már jeleztük, hogy technikailag az emlősök közül KO egeret a legkönnyebb és a leghatékonyabb előállítani. Az ES sejtekbe a DNS konstrukciót elektroporálással vagy liposzómákba csomagolva juttatjuk be.

Hogyan kell megtervezni az ún. targeting („célzó”) rekombináns DNS-t? Először is lineáris DNS konstrukcióra van szükség, mivel a prokariótákkal ellentétben itt nem egy autonóm replikálódó DNS-t kell a sejtbe juttatni, hanem egy önálló replikációra nem képes DNS-t, aminek be kell épülnie az eukarióta sejtek genomjába. A homológ rekombináció lineáris DNS-sel jobb hatásfokkal megy végbe. A homológ rekombináció érdekében a célgén mindkét oldalán viszonylag hosszú (1-2 kbp) homológ szakaszoknak kell lennie. A pozitív szelekciót a két homológ „kar” közé helyezett antibiotikum rezisztencia gén biztosítja. A rezisztencia génnek legalább egy exont kell a tönkretenni tervezett gén kódoló régiójából helyettesítenie.

Olyan antibiotikumot kell használni, ami emlős sejtekben is hatékony (pl. genticin). A pozitív szelekciós marker azonban önmagában nem elegendő. A homológ karokon túlnyúló végekre kell legalább egy negatív szelekciós marker, hogy a jóval gyakoribb nem-homológ rekombinációs eseményeket megpróbálják kiszűrni. A homológ rekombináció a rezisztenciát hordozó kazetta két végén lévő homológ karokon fog bekövetkezni, így a negatív szelekciós marker, az “érzékenyítő gén” ilyenkor kiesik (lásd 19.38. ábra).

A leggyakrabban használt érzékenyítő gén emlős rendszerekben a herpeszvírus timidilát-kináz (TK), ami ganciklovir jelenlétében a sejtek pusztulásához vezet. A ganciklovir egy dezoxi-guanidin analóg, ami a sejtben dGTP-analóggá alakul, kompetitív módon gátolja a normál dGTP beépülést, s végső soron a sejt szaporodását gátolja (ezzel a TK gént nem-homológ rekombinációval felvett sejteket ki lehet szelektálni).

A következő lépésben az embrionális őssejteket 3,5 napos blasztociszta stádiumú embriókba mikroinjektálják (lásd 19.39. ábra), majd álvemhes befogadó nőstény egér méhébe ültetik be.

19.39. ábra: Célzott génmódosítás, „génkiütés” (bal oldal) és célzás nélküli génmódosítás létrehozása egérben (jobb oldal).Az utóbbi eljárással transzgenikus egeret hoznak létre.

19.39. ábra: Célzott génmódosítás, „génkiütés” (bal oldal) és célzás nélküli génmódosítás létrehozása egérben (jobb oldal). Az utóbbi eljárással transzgenikus egeret hoznak létre.

A születő kisegerek genetikai kimérák lesznek, amelyek szerencsés esetben a csíravonalukban is hordozzák a módosított sejtek utódait. Az egerek pároztatásával, majd (szükség esetén) beltenyésztésével hozhatóak létre a tisztán KO egerek (az állatokat természetesen genotipizálni kell, pl. Southern-blottal vagy PCR-rel).

19.9.2. Géncsendesítés (gene silencing, knockdown)

Ahogy már jeleztük, az RNS interferencián alapuló géncsendesítés (knockdown) nagyon fontos módszer, mellyel gének működésének célzott módosítására van lehetőség.

A RNS interferencia felfedezését és molekuláris mechanizmusát a 18.5. fejezetben már bemutattuk, itt a géncsendesítés néhány lehetőségére hívjuk fel a figyelmet.

Az RNS interferenciát kiváltó kétszálú RNS molekulák sejtbe juttatatására több módszer létezik. Kezdjük egy olyan példával, ahol az egész szervezeten belül kiváltható egy adott gén „csendesítése”, azaz a róla átírt mRNS degradációja (és/vagy bizonyos esetekben közvetlenül a transzláció gátlása). Ilyen szisztémás RNS-interferencia megvalósulhat a C. elegans modellállatban. Mivel rendelkezik kettős szálú RNS-sek felvételére szolgáló receptorokkal és a szállításukhoz szükséges fehérjékkel, az RNSi válasz az állat kettős szálú RNS-sel való etetésével (a fonalférgek baktériumot fogyasztanak, amelyek expressziós vektorokról átírják az siRNS két szálát) is kiváltható. Gerincesekben azonban nincs ehhez hasonló szisztémás RNS interferencia: a kétszálú RNS hatása az egyes sejtekre korlátozódik.

Emlőssejteket transzformálhatunk olyan rekombináns DNS konstrukcióval, amibe erős promóter (pl. a spliceoszóma egyik snRNS génjének promótere, lásd 14.9.2. fejezet) mögé építjük be a hajtűkanyar-képző szekvenciát. Ezeket a rövid hajtű RNS-seket (shRNS: short hairpin RNA) kódoló plazmidokat széles körben alkalmazzák géncsendesítésre. A kis hajtűkanyart a Drosha és Pasha endonukleázok vágják ki a hosszabb RNS-szakaszból, akárcsak a természetes miRNS gének esetén. Ezután a Dicer endonukleáz lehasítja a hurkot, így az siRNS dimerré válik. A méretre vágott (nagyjából 21 nukleotid hosszú) siRNS-darabka végül a RISC komplexbe kerül. A komplex magját alkotó Argonauta endonukleáz a két siRNS szál egyikét (guide strand) stabilan megköti, a másik szálat (passanger strand) pedig kiveti. A komplex ezután a megkötött siRNS-szállal komplementer mRNS szálat, és azt az Argonauta elhasítja. Ezzel megakadályozza a transzlációt.

Az RNS-interferenciára egy másik lehetőség, hogy szintetikusan előállított siRNS-eket jutattunk a sejtekbe.

A fejezet végén megemlítjük, hogy a géncsendesítésnek van egy „klasszikus” változata az ún. antisense (az mRNS-sel komplementer) oligonukleotidok használata. Azt már régen feltételezték, hogy az mRNS-eket – ismerve a transzláció mechanizmusát – feltehetően inaktiválni lehet, ha a komplementer szállal (ez az antisense szál) kétszálú RNS molekulák alakulnak ki (mivel a kétszálú RNS-t a riboszóma nem tudja kiolvasni). Ezek a kétszálú RNS-ek is, ha nem is minden esetben, de bekerülhetnek a RISC komplexbe és RNS interferencián keresztül gátolhatják a transzlációt.

Érdekességként megemlítjük, hogy antiszensz RNS technológiával állították elő az első forgalomba került GMO-t (1994-ben az USA-ban), egy hosszabb eltarthatósági idejű paradicsomot. A poligalakturonáz enzim génjét csendesítették, amely enzim a paradicsom érésekor a sejtfalban lévő pektint bontja le, így a paradicsom puhul és sérülékenyebb lesz.

A géncsendesítés RNS interferencián alapuló lehetőségeit a 19.40. ábra foglalja össze.

19.40. ábra: Az RNS interferencián alapuló géncsendesítés három lehetséges mechanizmusa

19.40. ábra: Az RNS interferencián alapuló géncsendesítés három lehetséges mechanizmusa