4.4 A redukált koenzimek oxidációja

A glikolízis és a trikarbonsavciklus működése során létrejött redukált kofaktorokban, a NADH2 és a FADH2-ben, valamint a pentózfoszfátciklusban képződött NADPH-ban nagy mennyiségű energia tárolódik. Ezek visszaoxidálásával így jelentős mennyiségű energia szabadul fel. A NADPH nagyobbrészt a bioszintézisek reduktív folyamataiban vesz részt.

A redukált koenzimek visszaoxidálásának lehetőségei a növényekben az alábbiak:

Mitokondriális oxidációk:

- citokróm út (citokróm-a-a3)

- alternatív út (cianidrezisztens út, alternatív oxidáz)

Extramitokondriális oxidáció (direkt végoxidázok)

A következőkben ismertetésre kerülnek a fenti oxidatív utak a növényi specialitások részletesebb bemutatásával. A mitokondriális elektrontranszport és a kapcsolt ATP-szintézis folyamatait, mivel ezek valamennyi mitokondriummal rendelkező élőlényben nagyon hasonlóan játszódnak le, és biokémia könyvekben ezekről részletesebb leírások találhatók, így csak röviden, összefoglaló jelleggel tekintjük át. Fontos megemlíteni, hogy a mitokondriális elektrontranszport és a kapcsolt ATP-szintézis nagyfokú hasonlóságot mutat a fotoszintetikus elektrontranszportlánc és a kapcsolt ATP-szintézis folyamataival és struktúráival, melyeket a 3.5.7. fejezet részletesen ismertet.

4.4.1 Mitokondriális elektrontranszport a citokrómokon keresztül és kapcsolt ATP-szintézis

A folyamat során a redukált kofaktorokban tárolt energia az ATP-szintézishez kapcsolt mitokondriális elektrontranszportláncon keresztül szabadul fel, miközben az O2 vízzé redukálódik. A lánc négy, a mitokondriális membránhoz kapcsolt sok alegységből álló fehérjekomplexet foglal magába. A komplexek között az elektronokat az ubikinon (UQ) és redukált formája az ubikinol (UQH2) szállítja.

Az I. Komplex számos polipeptidből épül fel, NADH-dehidrogenáz funkciót lát el, a NADH-ról az elektronokat az ubikinonra juttatja. A II. Komplex egy szukcinát-dehidrogenáz, mely kovalensen kötött FAD-ot tartalmaz. A III. Komplexet citokróm-c1 és különböző citokróm-b-k építik fel, kötött hem kofaktorral rendelkezik. Az I., II. és III. Komplexek mind tartalmaznak Fe-S centrumokat. A III. Komplex az elektronokat a UQH2-ről kapja és ezek a citokróm-c-re kerülnek. A IV. Komplex egy citokróm-oxidáz(a-a3), mely az elektronokat a citokróm-c-ről kapja és az O2-t vízzé redukálja.

Az elektrontranszport folyamán az I., II. és IV. Komplexek protonokat pumpálnak a belső membránon keresztül a mátrixból az intrakrisztális térbe és ez hajtja az oxidatív foszforilációt, az ATP ADP-ből és Pi-ból történő szintézisét. A III. komplex esetében a protonok membránon keresztüli szállítása a UQ-ciklus mechanizmusával történik (lásd 4.5 ábra, vesd össze 3.5.1. fejezet). A teljes UQ-ciklus 2 fordulatból áll, melyek során 2 molekula UQH2 oxidálódik, 4 proton transzportálódik, 2 elektron kerül át a IV. Komplexre, és egy molekula UQ redukálódik. Az elektrontranszport során az intermembrán térben akkumulálódott protonok hajtják meg a sokegységből álló F0F1-ATP szintáz komplexen folyó ATP-szintézist. Az F0 hidrofób egység membránba ágyazott és proton csatornaként működik. Az F1 fejrész a belső membrán mátrix felőli oldalán található és ATP-t szintetizál egy a pH-változással összefüggő konformáció változási mechanizmussal, három szubsztrátkötőhellyel rendelkezik. Az intakt mitokondriumban általában 10 proton kerül átpumpálásra minden 2 elektronnak a láncon, a NADH-tól az O2-ig történő transzportja során, mialatt körülbelül 2,5 ATP molekula képződik. A II. Komplexen kötött FADH-nak az oxidációja 1.5 körüli ATP termeléssel jár.

A normálisan működő mitokondriumokban az elektrontranszport és az ATP-képzés szorosan kapcsoltak, vagyis elektronszállítás csak akkor mehet végbe, ha egyidejűleg ATP is képződik. Az ATP-képzés intenzitása ilyenkor a meghatározó, limitáló tényezője az elektrontranszport sebességének. A két folyamat szétkapcsolható, például mechanikai hatásokkal (sebzés, mitokondriumok izolálása), vagy speciális, a membránt a protonok számára átjárhatóvá tevő szétkapcsolószerekkel (2-4-dinitrofenol, dikumarol, egyes zsírsavak és antibiotikumok). Ekkor az elektrontranszport gyorsabbá válik és az oxigénfelvétel is gyorsul.

Mind az ATP-képzés, mind az elektrontranszportlánc reakciói megfordíthatók, így ATP adagolása (és a citokróm-oxidáz gátlása) mellett a NAD+ redukálható.

4.5. ábra A belső mitokondriális membrán a beépült alternatív oxidázzal és a mitokondriális növényi elektrontranszportlánc komponenseivel, az I-IV. Komplexekkel és az ATP-szintázzal, két további rotenon-rezisztens NAD(P)H-dehidrogenázzal és egy külső NAD(P)H-dehidrogenázzal. Az elektrontranszport folyamán az I., II. és IV. Komplexek protonokat pumpálnak a belső membránon keresztül a mátrixból az intermembrán térbe és ez hajtja az oxidatív foszforilációt, az ATP ADP-ből és Pi-ból történő szintézisét. A III. komplex esetében a protonok membránon keresztüli szállítása az UQ ciklus mechanizmusával történik. A teljes UQ ciklus 2 fordulatból áll, melyek során 2 molekula UQH2 oxidálódik, 4 proton transzportálódik, 2 elektron kerül átküldésre a IV. komplexre, és egy molekula UQ redukálódik. Az elektrontranszport során az intermembrán térben akkumulálódott protonok hajtják meg a sokegységből álló F0F1-ATP szintáz komplexen folyó ATP-szintézist. Az F0-rész membránba ágyazott és proton csatornaként működik. Az F1 perifériásan található és ATP-t szintetizál egy konformáció változási mechanizmussal három szubsztrátkötőhely bevonásával. Általában 10 proton kerül átpumpálásra minden 2 elektronnak a láncon, a NADH-tól az O2-ig történő transzportja során, mialatt körülbelül 2,5 ATP molekula képződik. A II. Komplexen kötött FADH-nak az oxidációja 1.5 körüli ATP termeléssel jár. A növényi mitokondriumok számos NAD(P)H dehidrogenázzal rendelkeznek a I. Komplex mellett, mely a mitokondriumon kívül képződött NAD(P)H-t hasznosítja. A matrix orientált NAD(P)H dehidrogenáz nem érzékeny a Komplex I rotenon inhibitorára. Az elektronok protonpumpák környékére irányításával, ezek az un. összekötő dehidrogenázok a NAD(P)H oxidáció ATP hozamát körülbelül 1.5-re csökkentik.

4.5. ábra Az alternatív oxidáz kapcsolata a mitokondriális növényi elektrontranszportlánc felépítésével a belső mitokondriális membránon. Láthatók az alternatív oxidáz és két további rotenon-rezisztens NAD(P)H-dehidrogenáz együtt egy külső NAD(P)H-dehidrogenázzal, az I-IV. Komplexek és az ATP-szintáz. (Jones et al., 2012 után) Az ábra nagy méretben ide kattintva tölthető le.

4.4.2 A mitokondriális oxidáció alternatív útja (cianidrezisztens légzés)

A növényi mitokondriumok tartalmaznak egy utat az elektronok UQ-ról O2-re történő szállítására, mely elkerüli a citokróm-c oxidázt (IV. Komplex) (4.5 ábra). Ez az alternatív oxidáz megtalálható a szárazföldi növényekben, sok algában és gombában, és néhány protozoában. Az alternatív oxidáz inszenzitív a III. és IV. Komplexek inhibitoraira, így az alternatív oxidázon keresztüli elektronáramlás intenzívvé válik a citokróm-oxidáz klasszikus gátlóinak (cianid és szénmonoxid) alkalmazásakor és a III. Komplex gátlásakor (antimycin-A). Ugyanakkor, ez az alternatív út specifikusan gátolható szalicilhidroxámsavval és propilgalláttal. Az alternatív oxidáz erősen kötődik a belső membránhoz és elektronokat terel el az elektrontranszport útról az UQ-pool szintjén. Az elektronokat a UQH2-ről veszi fel és direkten az O2-re juttatja, miközben termékként víz képződik. Az alternatív oxidáz protonokat nem mozgat, sőt ez az út elterelheti az elektronokat a háromból kettő proton tanszlokációs helyről. Ezért, az alternatív oxidáz működtetésekor kevesebb ATP keletkezik (vagy egyáltalán nincs foszforiláció), és több energia veszik el hőként. A citokróm típusú és az alternatív út tehát párhuzamosan működik, arányuk a növény élettani állapotától függ. Magas ADP-koncentrációk esetén a citokróm út teljes intenzitással működik, az alternatív út ilyenkor alig vagy egyáltalán nem aktív. Ha azonban az ADP koncentrációja csökken (az ATP koncentrációja pedig nő), az alternatív útra kerülnek az elektronok.

Több növény kihasználja az alternatív oxidáz termogén (hőt generáló) hatását, melyek közül különösen az Arum nemzetség fajait tanulmányozták. Számos fajnál a kifejlődő virágokban képződött hő növeli meg a megporzó rovarokat vonzó illatok kibocsátását.

Az alternatív oxidáz bizonyos fokú működését a legtöbb növény szövetei mutatják, de aktivitása széles skálán mozoghat. Így például az alternatív oxidáz szintézisét gyakran stimulálják stressz hatások, mint a tápanyagok hiánya vagy a szárazság, melyek reaktív oxigénformák létrejöttét indukálják (lásd 10.6. fejezet). Az alternatív légzést folytató szövetek minden esetben élénk bioszintézist folytatnak. Úgy tűnik, hogy az alternatív oxidáz út a kinon-pool túlredukálásának megelőzésére szolgáló út lehet, melynek egyben alapvető feladata a veszélyes reaktív oxigén-formák képződésének kontrollja.

4.4.3 Extramitokondriális oxidáció (direkt végoxidázok)

A növényi sejtekben a mitokondriumon kívül is számos végoxidáz található. Direkt végoxidázoknak azért nevezik őket, mert nem kapcsolódnak membránhoz kötött elektrontranszporthoz. Ezek úgy oxidálnak el légzési szubsztrátokat, hogy ATP nem képződik, a felszabaduló energia hő formájában távozik el. Kisebb részük a citoplazmában szolubilis formában található, többségük sejtszervecskékhez, vagy a sejtfalhoz kötött. Szubsztrátspecificitásuk és így biokémiai szerepük is változatos. Felépítésükre az jellemző, hogy prosztetikus csoportjuk valamilyen átmeneti fémion vagy flavin nukleotid.

A továbbiakban röviden tárgyaljuk a legfontosabb direkt végoxidázokat.

Fenol-oxidázok

A növényi szövetek sérülésekor megfigyelhető barnulási reakciók ezen enzimek működésének köszönhetők, mivel a fenol-oxidázok által képzett kinonok egymással és egyéb molekulákkal igen stabil melanin-jellegű színes polimerekké oxidálódnak össze.

A legismertebb közülük a katekol-oxidáz, vagy polifenol-oxidáz, mely difenolokból O2 felhasználásával kinonokat és vizet képez. Monofenolokat is elfogad szubsztrátként, melyeket első lépésben O2 felhasználásával difenolokká, majd kinonokká alakít át.

A képződött kinonokat a NAD(P)H-kinon-oxidoreduktáz enzimek visszaredukálhatják fenolokká NAD(P)H redukált koenzimek oxidációjával

Fotoszintetizáló szövetekben a kloroplasztiszokban, nem fotoszintetizáló szövetekben a peroxiszómákban lokalizált. Az enzim négy alegységből épül fel, s alegységenként 1-1 Cu-iont tartalmaz.

A fenol-oxidázok részt vesznek a növényi rezisztencia kialakításában. Az általuk katalizált enzimreakciókban keletkező igen reaktív kinonok képesek a vírusokat inaktiválni, sőt a vírusfertőzött területeken a sejtek teljesen eloxidálódhatnak (hiperszenzitív reakció), így jellegzetes lokális léziók keletkeznek. A fenoloxidázoknak szerepük van a sebzések után kialakuló légzésnövekedésben, a gesztesedésben és feltehetően az indolecetsav szintézisében is.

Aszkorbinsav-oxidáz

A szintén Cu-tartalmú enzim O2 jelenlétében az aszkorbinsavat dehidro-aszkorbinsavvá oxidálja:

L-aszkorbinsav +1/2 O2 +H+ → dehidro-aszkorbinsav + 2 H2O

A dehidro-aszkorbinsav visszaredukálását glutation oxidálása mellett a glutation-dehidro-aszkorbinsav-oxidoreduktáz végzi. Az oxidált glutationt pedig a NADPH oxidációjával a NADPH-glutation-oxidoreduktáz enzim redukálja vissza.

Az aszkorbinsav-oxidáznak kiemelkedő szerepe van a sejt redoxpotenciáljának beállításában az aszkorbinsav/dehidro-aszkorbinsav és a glutation/oxidált glutation arányok beállításán keresztül, így a bioszintetikus folyamatokra éppúgy hatása van, mint az érés és az öregedés folyamataira.

Glikolsav-oxidáz

Az enzim O2 felhasználásával a glikolsavat glioxálsavvá oxidálja, de sok más savat is elfogad szubsztrátként.

glikolsav +O2 → glioxálsav + 2 H2O

Mivel prosztetikus csoportja FMN, az oxidáció során nem víz, hanem hidrogénperoxid keletkezik. A glioxálsav a NADH-specifikus vagy a NADPH-specifikus glioxálsav reduktáz enzim segítségével. A glikosav-oxidáz peroxiszómákban és glioxiszómákban található. Szintézise fitokróm kontroll alatt áll. A fénylégzésben is fontos szerepe van.

Peroxidázok

Működésük során hidrogéndonorokat oxidálnak el hidrogénperoxid felhasználásával:

Donor (red) + H2O2 → Donor (ox) + 2 H2O

Protohem prosztetikus csoportot tartalmaznak. A H-donorra vonatkozó kicsi specificitásuk is hozzájárul, hogy számos anabolikus (pl. lignin és etilén bioszintézise) és katabolikus (pl. flavonoidok lebontása) folyamatban játszanak szerepet és részt vesznek a rezisztencia kialakításában is. A zöld szövetek kloroplasztiszában a glutation és az aszkorbinsav specifikus oxidációját végzi, a nem fotoszintetizáló szövetekben viszont a citoplazmában található.

Kataláz

Általánosan előforduló, elsősorban a peroxiszómákban és a glioxiszómákban lokalizált. 4 alegységből áll és hem prosztetikus csoporttal rendelkezik. A sejtekben, lúgos közeg esetén, a flavin enzimek működése során keletkezett hidrogénperoxid bontását végzi:

2 H2O2 → 2 H2O + O2

Savas közegben viszont peroxidatív aktivitással bír.

Szuperoxid-dizmutáz

A sejtekben keletkező szuperoxid (O2-) eliminálását végzi:

2 O2- + 2 H+ → 2 H2O2 + O2

A rendkívül reakcióképes szuperoxid-ion keletkezik enzimreakciókban (xantin-oxidáz, aldehid-oxidáz, flavoprotein-dehidrogenázok), illetve a fotoszintézis fényszakaszában, amennyiben az elektronakceptor foglalt. Két alegységből épül fel, mindkettőben található Cu2+ és Zn2+ is.