9.7. Eukarióta típusú fehérjeszintézis a citoplazmában

A valódi sejtmaggal bíró szervezetek citoplazmájában végbemenő fehérjeszintézis néhány vonatkozásban jelentősen eltér a prokariótákétól. A fő eltérések a következők:

Az iniciáció folyamatának bonyolultsága ugyanakkor lehetőséget nyújt az iniciáció szintjén megvalósuló regulációs folyamatokra.

9.7.1. Az iniciáció

Az iniciáció az mRNS AUG iniciátor kodonjának felismerése, mely folyamatban mRNS, riboszóma, iniciátor tRNS és iniciátor faktorok vesznek részt és ATP, valamint GTP energiája használódik fel. A reakciósor végén aktív 80S iniciációs komplex képződik, mely a riboszóma P helyén lokalizált és az mRNS iniciátor kodonjához antikodonjával kötődő Met-tRNSi-t tartalmaz, de iniciátor faktoroktól mentes. Az iniciációs komplex kialakulása számos intermedieren át megvalósuló folyamat, melyben több mint 10 iniciátor faktor vesz részt és melynek során ATP és GTP hidrolizál. Az iniciációs komplex kialakulásának lépései a következők:

  1. A 80S riboszóma disszociációja.

  2. Az eIF2-GTP-Met-tRNSi hármas komplex kialakulása és kötődése a 40S riboszomális alegységhez, mely a 43S iniciációs komplex kialakulását eredményezi.

  3. Az mRNS kötődése az iniciációs komplexhez, melynek következtében kialakul a 48S iniciációs komplex, majd megtörténik az iniciátor kodon megkeresése.

  4. A 60S riboszomális alegység kötődése a 48S iniciációs komplexhez, melynek eredménye az elongációra alkalmas 80S iniciációs komplex kialakulása.

Az iniciációban résztvevő faktorokat osztályokba soroljuk annak alapján, hogy az iniciáció melyik szakaszában vesznek részt. Vannak közöttük több funkciót is ellátó faktorok. Az eIF1 osztály faktorai pleiotrop módon stimulálják az iniciációs komplex kialakulását. Az eIF2 osztály faktorai az iniciátor metionil-tRNS kapcsolódását teszik lehetővé a natív 40S riboszomális alegységhez, kialakítva a 43S iniciációs komplexet. Az eIF3 osztályba csak a többfunkciós eIF3 faktor tartozik, mely a riboszóma disszociáltatásában és az mRNS megkötésében játszik szerepet Az eIF4 faktorok az mRNS-t kapcsolják a 43S iniciációs komplexhez, melynek eredményeként a 48S iniciációs komplex képződik. Az eIF5 faktorok elsődleges szerepe a 48S iniciációs komplex stabilizálásának, a 60S alegység kötődésének és az első peptidkötés kialakulásának elősegítése. Végül az eIF6 faktor megakadályozza a riboszomális alegységek asszociációját.

9.7.1.1. A riboszóma disszociációja

Az asszociált és disszociált alegységek között az eIF1A, az eIF1, az eIF3, és az eIF6 fehérje faktorok befolyásolják az egyensúlyt. Az eIF1A mind a 80S riboszómához, mind a 40S alegységhez képes kötődni, mindkét irányban növelve a kicserélődési rátát. Az eIF3 csak a kis alegységhez kötődik, megakadályozva az asszociációt. Az eIF6 a nagy alegységhez kapcsolódva szintén antiasszociátor hatású.

Az eIF3 jelenléte feltétele annak, hogy a riboszóma megfelelő konformációban legyen az eIF2-GTP-Met-tRNSi hármas komplex bekötődésekor, valamint szükséges az mRNS kötődéséhez is. Részt vesz a preiniciációs komplex kialakulásában még egy kis moltömegű fehérje, az eIF1, mely az iniciáció folyamán kialakuló különböző komplexek stabilizálásában játszik szerepet.

9.7. ábra Az eukarióta fehérjeszintézis iniciációját mutatja

9.7. ábra Az eukarióta fehérjeszintézis iniciációja

9.7.1 2. Az iniciátor tRNS kötődése a kis riboszomális alegységhez és a 43S iniciációs komplex kialakulása

Eukarióta szervezetek sejtjeiben a metionil-tRNS az iniciátor, mely eIF-2-Met-tRNSi-GTP hármas komplex formájában kötődik a 40S riboszomális alegységhez. Kapcsolódása megelőzi az mRNS-ét, tehát az események sorrendje itt eltér a prokariótáknál megismertektől. Ugyancsak az mRNS bekötődése előtt kapcsolódik az eIF5 iniciációs faktor, melynek a GTP hidrolízis szabályozásában van szerepe. A 43S preiniciációs komplex képződése a következőképpen összegezhető:

eIF2-GTP-Met-tRNSi + 40S-eIF1A-eIF1-eIF3 + eIF5 <==> 40S-eIF2-GTP-Met-tRNSi-eIF1A-eIF1-eIF3-eIF5

9.7.1.3. Az mRNS kötődése, a 48 S iniciációs komplex kialakulása

Az eukarióta mRNS riboszómához kötődésének feltétele a 43S iniciációs komplex kialakulása, melyben jelen van az iniciátor tRNS, tehát a prokarióta riboszómán lejátszódó folyamatoktól eltérő az események sorrendje. Az mRNS-ek jellegzetes sajátosságainak jelentősége van a fehérjeszintézis szempontjából. Ezek az mRNS-ek monocisztronosak, 5’ végi sapkát és 3’ végi poli-A szekvenciát tartalmaznak és az 5’ végi nem transzlálódó régiójukban nem található Shine-Dalgarno-szekvencia (mely prokariótákban pontosan megszabja az mRNS riboszómához kötődésének helyét), ennek következtében nem az mRNS és az rRNS között, hanem csupán az iniciátor AUG kodon és a riboszómára már az mRNS kapcsolódása előtt bekötődött Met-tRNSi antikodonja között jön létre nukleinsav-nukleinsav kölcsönhatás az iniciáció során. Vagyis a kötőhely kialakításában, valamint az mRNS sajátságainak felismerésében nagy szerephez jutnak az iniciátor faktorok.

Az mRNS riboszómához kötődéséhez szükséges faktorok az eIF4 faktorcsaládba tartoznak. Az eIF4F növényeknél két különböző alegységből álló fehérje, melynek a kis alegysége az eIF4E, a nagy alegysége az eIF4G. Növényeknél izoformájuk is van (eIFiso4E, és eIFiso4G). Az eIF4E faktorok, melyeket sapkakötő fehérjéknek is neveznek, közvetlenül kapcsolódnak az mRNS 5’ végi sapkastuktúrjához. Az eIF4E az egyszerű metilált sapkát és a nem transzlálódó régióban hajtűszerű struktúrákat tartalmazó mRNS-eket, az eIF4isoE pedig a többszörösen metilált sapkát és a lineárisabb nem transzlálódó régióval rendelkező mRNS-eket részesíti előnyben. Az eIF4G az mRNS 3’ végi poliA szekvenciájához kötődő (PAB = PoliA Binding) fehérjékkel lép kölcsönhatásba, melynek következtében az mRNS gyűrűt alkot, amely a transzláció során fennmarad. Ezt követően az eIF4A és eIF4B faktorok is kapcsolódnak az mRNS sapka struktúra közelében és egyben kötődnek a cirkularizációt kialakító eIF4G faktorhoz is.

A 43S iniciációs riboszóma komplex kötődése az mRNS-en az 5’ végi sapka stuktúra közelében történik. Az mRNS stabil kapcsolódása a 43S preiniciációs komplexszel egy újabb intermedier, a 48S iniciációs komplex kialakulását eredményezi. Az iniciátor kodon ettől mintegy 50–100 nukleotidnyira található a molekulán 3’ irányban haladva. Ahhoz tehát, hogy az iniciátor kodont megtalálja, a riboszómának el kell mozdulnia az mRNS mentén. Ezt a folyamatot pásztázásnak nevezik (scanning). A pásztázás ATP-igényes folyamat, melyben az ATPáz és helikáz aktivitással rendelkező eIF4A és eIF4B faktorok vesznek részt. A pásztázás során az IF5 faktornak az a szerepe, hogy megakadályozza az irreverzibilis GTP hidrolízist az eIF2-GTP-Met-tRNSi hármas komplexben mindaddig, amíg az iniciátor kodon és a Met-tRNSi között a kodon – antikodon kölcsönhatás létre nem jön. Ezt követően az eIF1, eIF3 iniciátor faktorok leválnak, az eIF5 pedig áthelyeződve az eIF1A-ra lehetővé teszi az irreverzibilis GTP hidrolízist az eIF2 felszínén.

9.7.1.4. A 80S iniciációs komplex kialakulása

A 60S riboszomális alegység kötődése szükséges ahhoz, hogy a 48S preiniciációs komplex transzlációra alkalmas 80S iniciációs komplexszé alakuljon át. Az iniciációnak ebben a szakaszában az események sorrendje a következő:

  1. a GTP hidrolízise,

  2. az iniciációs faktorok felszabadulása,

  3. a 60 S alegység stabil kapcsolódása és a 80 S iniciációs komplex kialakulása.

A 60S alegység kötődésében központi szerepet játszik a már említett eIF5 iniciációs faktor azáltal, hogy katalizálja a kis alegységen a kodon-antikodon kölcsönhatás kialakulása után a hidrolízishez megfelelő pozícióba kerülő, Met-tRNSi-eIF2-GTP hármas komplexben kötött GTP hidrolízisét. Ezt segíti elő az eIF5-höz átmenetileg kapcsolódó eIF1A faktor is. A GTP hidrolízise után az iniciációs faktorok felszabadulnak és lehetővé válik a 60 S alegység stabil kötődése, ami a 80 S iniciációs komplex kialakulását eredményezi.

A GTP hidrolízise után az eIF2- GDP disszociál a riboszómáról és az eIF2B reciklizáltató faktor segítségével, vagy spontán, GTP felhasználásával újra eIF2-GTP komplexszé alakul.

A 60S riboszomális alegység az eIF6 antiasszociátor faktorral együtt található a sejtben. Az alegység kötődésekor, melyet az eIF5B faktor segít elő, az eIF6 felszabadul. Az így kialakult aktív 80S iniciációs komplex iniciátor faktorokat nem tartalmaz, a P helyén iniciátor tRNS található, mely antikodonjával az mRNS AUG kodonjához kötődik, az A helye pedig üres. Tehát képes fogadni a következő kodon által meghatározott aminoacil-tRNS-t és részt venni az elongációban.

Eukariótáknál az első peptidkötés kialakulásához további konformációváltozások szükségesek, melyeket egy újabb fehérje faktor, az eIF5A kötődése idéz elő. Az eIF5A faktor egy különleges aminosavat, a hipuzint tartalmazó fehérje, melynek nem csak a transzláció, hanem az mRNS készlet (részben transzport függő) szabályozásában, ezáltal a sejt életképességének regulálásában is fontos szerepe van.

9.7.2. A peptidlánc elongációja

Az iniciátor és terminátor kodonok közti mRNS lánc transzlációja, vagyis a láncközi kodonok dekódolása a prokarióták transzlációjához hasonlóan történik. A ciklusos folyamatban az eEF1A elongációs faktorhoz és GTP-hez kötött tRNS-ek sorban belépnek a riboszóma A helyére, majd egy minőség-ellenőrzés után kialakul a peptidkötés. A peptidil-transzferáz reakció után a riboszóma és a pep-tRNS elmozdulnak egymáshoz képest egy triplettnyit a transzlokációs eEF2 faktor segítségével úgy, hogy az A helyre új kodon kerül, és egyben szabaddá válik a következő aminoacil-tRNS bekötődéséhez. Az elongáció folyamatát három részre oszthatjuk:

  1. az aminoacil-tRNS kötődése a riboszóma A helyére,

  2. a peptidkötés kialakulása,

  3. a peptidil-tRNS transzlokációja a P helyre.

9.7.2.1. Az aminoacil-tRNS kötődése a riboszomális A helyre

A prokariótáknál leírtakhoz hasonlóan magasabb rendű szervezetekben is hármas komplex formájában történik meg az aminoacil-tRNS kapcsolódása a riboszómához. A hármas komplex az eEF1 összetett fehérje faktor egyik alegysége, az eEF1A, GTP és aminoacil-tRNS részvételével jön létre. A kodon-antikodon stabilitáson alapuló minőségellenőrzést követően a GTP hidrolizál és a GDP-eEF1A komplex disszociál a riboszómáról. Az eEF1 faktor másik három alegysége, melyeket együttesen eEF1B-vel jelölnek, az eEF1A-GDP komplex GDP-jét cseréli ki GTP-re (9.8. ábra).

9.7.2.2. A peptidkötés kialakulása

Az aminoacil-tRNS a GTP hidrolízise és az eEF1A leválása után az A helyen megfelelő konformációba kerül ahhoz, hogy kialakuljon a peptidkötés. Prokarióták transzpeptidációjához hasonlóan a folyamathoz sem oldható faktorok,sem nukleotid trifoszfátok jelenlétére nincs szükség. A peptidil-transzferáz központ a 60S alegységen található, de a 40S alegység fehérjéi is részt vesznek a kialakításában. A katalitikus aktivitásban a riboszomális RNS-ek játszanak szerepet. A peptidkötés kialakulása után a peptid átkerül a P helyen levő tRNS-ről az A helyen levő tRNS-re úgy, hogy annak antikodon vége még az A helyen marad, a peptidet hordozó vége pedig a már elmozdul a P helyre. Ugyanakkor az aminosavát elvesztett dezacilált tRNS 3’ vége is eltolódik az E hely felé, antikodon vége azonban még a P helyen lévő kodonnal kapcsolódik (9.8 ábra). Ezt az átmeneti kötődési állapotot szünteti meg a transzlokáció.

A 9.8. ábra az eukarióta fehérjeszintézis elongációját mutatja

9.8. ábra Az eukarióta fehérjeszintézis elongációja

9.7.2.3. A peptidil-tRNS transzlokációja

A transzlokáció során peptidil-tRNS átkerül a P helyre, a dezacilált tRNS pedig az E helyre, majd utóbbi leválik a riboszómáról. A transzlokáció egyben az mRNS és a riboszóma egymáshoz viszonyított egy triplettnyi elmozdulását is jelenti az mRNS 3' vége irányába. A peptidil-tRNS transzlokációját a P helyre eukariótáknál az eEF-2 GTPáz családba tartozó fehérje faktor katalizálja. Az eEF-2-t számos növényi és állati szervezetből izolálták. Egyszerű polipeptid, mely egy diftamidnak nevezett, speciálisan módosított hisztidint tartalmaz. (A diphtamid elnevezés onnan ered, hogy az eukarióta fehérjeszintézist gátló diftéria toxin katalizálja NAD-ról ADP-ribóz átvitelét erre az aminosavra, ezáltal inaktívvá teszi a fehérjét transzlokációs reakcióban.)

A transzlokáció befejeztével a GTP hidrolizál, az eEF2-GDP komplex leválik a riboszómáról, majd GTP-vel reagálva regenerálja az eEF2-GTP aktív komplexet. A riboszóma készen áll a következő elongációs ciklusra (9.8. ábra).

9.7.3. A polipeptid lánc terminációja

Az elongációs ciklus addig folytatódik, míg a riboszóma A helyére terminátor kodon (UAA, UGA vagy UAG) kerül. Ilyenkor GTP jelenlétében a terminátor faktor, eRF kötődik az A helyre, majd

- a peptidil-tRNS észterkötése hidrolizál,

- a kész polipeptid, az mRNS és a dezacilált-tRNS felszabadul a riboszómáról.

Az eukarióták terminációját egyetlen release faktor katalizálja. Működéséhez GTP-t igényel, kodonspecifitást nem mutat.

A termináció a következőképpen történik: az A helyen található terminátor kodonhoz az eRF-GTP komplex kötődik és elősegíti, hogy a riboszóma peptidil-transzferáz központja a peptidil-tRNS észterkötését hidrolizálja. A reakciót követően a GTP hidrolizál, a terminátor faktorok, a dezacilált-tRNS és az mRNS leválik a riboszómáról (9.9. ábra).

A 9.9. ábra az eukarióta fehérjeszintézis terminációját mutatja

9.9. ábra Az eukarióta fehérjeszintézis terminációja

Eukariótáknál is jól ismert az a folyamat, melynek során egyes tRNS-ek a terminátor kodont értelmes kodonként ismerik fel és helyére aminosavat építenek be a fehérjeláncba, melynek következtében hosszabb fehérjék keletkeznek.

Növényeknél a természetes szupresszió számos esetét figyelték meg. Növényi vírusok ezt a lehetőséget használják fel arra, hogy ugyanazon RNS-ről két vagy több fehérjét szintetizáljanak. Jól dokumentált példája ennek a dohánymozaik vírus RNS-e, melyről egy 126 kDa-os és egy 180 kDa-os fehérje szintetizálódik. A "readthrough" fehérje szintézisében a gazdanövény két természetes izoakceptor tRNS-e vesz részt, melyek tirozinként olvassák le a stop kodont. Számos növényből (pl. búzából, csillagfürtből) kimutattak ilyen tRNS-eket.

A természetes tRNS-ek egy másik csoportja specifikusan az opal (UGA) kodont ismeri fel. Prokariótáktól az állatokig számos szervezetben szükséges funkcióképes fehérjék kialakításához az UGA szupressziója. Emlős sejtekben glutation-peroxidáz aktív enzim kialakulásához szükségesek olyan szupresszor tRNS-ek, melyek szerinnel acilálhatók, majd a szerin foszfoszerinné, ezt követően pedig szelenociszteinné módosul. A stop kodonnál a szelenocisztein beépül a fehérjébe. A folyamatban járulékos fehérjefaktorok vesznek részt és az mRNS megfelelő konformációja is szükséges (SECIS = SEleno-Cysteine-Insertion-Sequence) a szupresszálandó stop kodon felismeréséhez.