Új szemlélet, a testfehérjék dinamikus állapotának felfedezése

A folytatódó fehérje metabolizmus furcsa jelenségének magyarázatában a döntő lépést az izotópokkal végzett kísérletek jelentették. Ebben úttörő munkát végzett a magyar származású Hevesy György (függelék 9. ábra) akit eredményeiért Nobel-díjjal jutalmaztak. A Hevesy által kidolgozott módszer alapján Rudolf Schoenheimer (függelék 10-11. ábra) az 1930-as években stabil [15N]-izotópot használt a fehérjék metabolizmusának vizsgálatára. Arra a következtetésre jutott, hogy a táplálékkal felvett és megemésztett fehérjékből lényegesen több [15N]-el jelzett aminosav épül a szervezetbe, mint amit az ürítés mutat (Schoenheimer, 1942). Schoenheimer hasonló kísérleteket végzett lipidekkel kapcsolatban is, és azt az általános következtetést vonta le, hogy a szervezet és a sejtek alkotórészei állandóan lebomlanak, anyaguk pedig frissen készült alkotók szintézisében azonnal újrahasznosul. Dinamikus egyensúly van tehát a felépítés (anabolizmus) és a lebontás (katabolizmus) között, ami az alkotórészek folyamatos megújulását (turnover) biztosítja. A folyamatot jól lehet illusztrálni egy szupermarket működésével. A polcokról a vásárlók folyamatosan és fajtánként változó sebességgel viszik el az oda kitett árut, az árufeltöltők pedig, ideális esetben a fogyás mértéke szerint, pótolják a termékeket. Eközben az egyes áruféleségek mennyisége a polcokon állandó marad. (Schoenheimer eredetileg a hadseregbe való besorozással és az onnan való leszereléssel szemléltette felfogását.) Az a gondolat, hogy a testalkotó fehérjék intracellulárisan lebomolhatnak, tehát létezik ún. endogén proteolízis, rendkívül szokatlan volt. A folyamat létezésére feltétlenül egzakt kísérleti bizonyítékokat kellett találni.

A továbbiak megértéséhez röviden ki kell térni a fehérjelebontás izotópok segítségével való mérésének módszerére. Az eljárás lényege, hogy megfelelő feltételek mellett egy jól megválasztott stabil, vagy radioaktív izotóppal jelzett aminosavat építünk a fehérjékbe, majd megmérjük annak a lebontás által felszabadított mennyiségét. Egy egyszerű in vitro végzett izotóp jelzéses kísérlet vázlatát mutatja az 1.3. ábra.

Piros x-ek jelzik a radioaktívan jelzett és fekete x-ek a nem jelzett aminosavakat. A folyamatos kék vonala fehérjeláncot jeleníti meg, amelybe az aminosavak beépülnek.

1.3. ábra A fehérjék izotópos jelzése és a lebontás mérése in vitro. Egy izotóppal (pl. b-sugárzó [14C]- el jelzett, jól kiválasztott (nem metabolizálódó) aminosavat (pl. máj esetében ilyen a valin) adunk a sejteknek. A hozzáadott aminosavnak nem az összes molekulája jelzett, a jelzettség arányát az un. specifikus aktivitás mutatja meg (egysége radioaktivitás/mM aminosav). A fehérjeszintetizáló apparátus a jelzett (x) és a nem jelzett (x) valint egyaránt beépíti a fehérjékbe (kék vonal) (1). Ezután BSS-el (fiziológiás puffer) mossuk a sejtjeinket, hogy a jelzett szabad (fehérjébe be nem épült) aminosavat eltávolítsuk (2). A sejtekhez új médiumot adunk, amiben a jelző aminosav sokszoros koncentrációban van jelen („chase” médium). Ebben a médiumban tovább működnek a sejtek, új fehérjéket szintetizálnak is, és le is bontanak (3). A lebontott fehérjékből felszabadul az aminosav. Mivel a nem jelzett aminosav sokszoros koncentrációban van jelen, a felszabadult jelzett aminosav molekulák nem épülnek be jelentős mennyiségben az újonnan szintetizált fehérje molekulákba, így az oldatban felhalmozódnak (3). Erős sav segítségével kicsapjuk fehérjéket (4), majd centrifugálással ülepítjük őket (5). A felülúszóban (6) mérhető a lebontott fehérjékből felszabadult radioaktív aminosav. Ennek mennyiségéből következethetünk a lebontás mértékére.

A fehérjék jelölését in vivo is el lehet végezni. Mivel olyan aminosav nincs amelyik valamilyen szervben ne metabolizálódna (ennek legföljebb a mértéke változik), számíthatunk arra, hogy a jelölés „szétszóródik” és in vivo az újra beépülés sem akadályozható meg, mivel nem alkalmazhatunk „chase” médiumot. Emiatt jelentős háttérjelölődést kapunk. A lebontás mérését in vivo jelölés után is jobb a kivett szerveken, vagy sejteken in vitro végezni, többek között azért, mert így könnyebb meggátolni az újra beépülést. Az in vivo jelölésből származó háttér jelölést a kísérlet indulásakor vett kontroll mintákkal lehet figyelembe venni.

Az egyes fehérjék jelölődésének intenzitása a turnoverük sebességével egyenesen arányos lesz. Mivel az egyes fehérjéket nem különítettük el, az itt ismertetett egyszerű módszerrel egy átlagos lebomlási értéket mérünk. Ebben a jelölés időtartamától (azaz a radioaktív aminosavnak a fehérjeszintézis számára való rendelkezésre állásának időtartamától) függően reprezentálják magukat a fehérjék. A rövidebb jelölési idő a nagyobb, a hosszabb pedig a kisebb turnoverű fehérjéket preferálja. Ahhoz, hogy egy bizonyos fehérje turnoverére kapjunk adatokat izolálnunk kell az adott proteint.