Az autofágia folyamatának felfedezése és elektronmikroszkópos vizsgálatának kezdetei

A teljes kép felvázolásához ezen a ponton vissza kell térnünk az 1950-es évek sejtbiológiai vizsgálataihoz. Az 1950-es évek második felében következett be az a korszak, amikor a biológiai minták elektronmikroszkópos vizsgálatának módszerei elég fejlettek lettek ahhoz, hogy megkezdődjék a sejtek finomszerkezetének (ultrastruktúrájának) rendszeres vizsgálata. Az elektronmikroszkóp nagy felbontása révén a sejtek alkotórészeinek megfigyelése a nm-es tartományig tágult. Leírhatóvá váltak a sejteket felépítő legfontosabb organellumok és makromolekuláris komplexumok elektronmikroszkópos finomszerkezeti tulajdonságai. Megkezdődhetett ezeknek az alkotórészeknek a sejtbiokémiai módszerekkel kapott adatokkal való összevetése és funkciójuk felderítése. Ennek a kutatási trendnek Christian de Duve mellett két további képviselője (Albert Claude és George E. Palade) szintén megkapta a Nobel-díjat 1974-ben.

A sejtek elektronmikroszkópos szerkezetét tanulmányozó kutatók 1954-ben (Rhodin, 1954) majd 1957-ben (Clark, 1957) szokatlan jelenségre lettek figyelmesek vese tubulusok hámsejtjeiben. Megfigyelték, hogy a citoplazmában található membránnal határolt sötétebb beltartalmú un. „densz” testek (dense bodies, sötét testek) belsejében különös módon néha mitochondriumok fordulnak elő. Újabb éveknek kellett eltelniük ahhoz, hogy 1959-ben Alex Novikoff, a kor legkiválóbb citokémikusa újra felfigyeljen erre a jelenségre. Novikoff azt találta, hogy az ureter lekötése után nagy számban jelennek a vese hámsejtjeiben, vagy májsejtekben Triton-WR1339-el kezelt állatokban nemcsak mitochondriumot, hanem a sejt saját citoplazmájának egyéb részeit is tartalmazó membránnal határolt testek. Azt is kimutatta, hogy ezekben lizoszomális enzimek találhatók (Novikoff és Essner, 1962) (1.6. ábra).

szürke árnyalatos ábra, benne szabadon középszürke mitochondriumok a citoplazmában szabadon, egy másik membránnal határolt testben, két további membránnal határolt testben erősen fekete csapadék van.

1.6. ábra A membránnal határolt, citoplazma alkotókat tartalmazó vakuólákban savas foszfatáz enzim jelenlétét mutatja a fekete csapadék. M: mitokondrium; a nyilak a vakuólákban lévő mitokondrium krisztáira mutatnak (patkány izolált májsejt)

Levonta tehát azt a helyes következtetést, hogy a megfigyelt képek a lizoszomális autolízis jeleit mutatják (Novikoff, 1959). Ezeknek az önemésztő testeknek a megnevezésére a „cytolysome” kifejezést használta (Novikoff, 1960). Ashford és Porter májsejtekben, glukagon kezelés nyomán találtak citoplazma komponenseket tartalmazó, membránnal határolt testeket, melyeket fokális autolízist végző lizoszómáknak tartottak (1.7. ábra) (Ashford és Porter, 1962).

szürke árnyalatos ábra, benne szabadon és autofág vakuólákban mitochondriumok; több sötétebb heterogén beltartalmú membránnal határolt test is látható amelyekben már nem ismerhető fel a beltartalom.

1.7. ábra Citoplazma részek membránnal határolt testekben glukagont tartalmazó médiummal perfundált patkány májban. 1: jól felismerhető mitokondrium a membránnal határolt testben; 2: degradálódó anyagot tartalmazó membránnal határolt test: fokális autolízis (patkány májsejt)

Mindezek azt bizonyították, hogy maguk a sejtek képesek saját citoplazmájuk kisebb-nagyobb részeit a lizoszomális rendszerük segítségével megemészteni.

Mivel a funkcionális háttér eleinte még nem volt világosan tisztázott, Jan L. E. Ericsson és Benjamin Trump (függelék 17. ábra) kizárólag morfológiai kritériumok alapján bevezette a „cytosegresome” (szegregáló citoplazmatikus organellum) kifejezést (Ericsson és Trump, 1964). Az ilyen önemésztő citoplazmatikus organellumokra de Duve javasolta az „autofág vakuóla” elnevezést (de Duve, 1963; de Duve, 1964). Ez a kifejezés a membránnal határolt, morfológiailag azonosítható citoplazma alkotókat tartalmazó test megnevezésére szolgál, tekintet nélkül arra, hogy a benne zajló lebontás mennyire előrehaladott. Ugyancsak de Duve állította párhuzamba a sejt által kívülről felvett anyagok emésztését a saját citoplazma részek emésztésével, és javasolta a heterofágia és autofágia kifejezést az előbbi, illetve az utóbbi intracelluláris emésztő folyamat megnevezésére (de Duve és Wattiaux, 1966).

Az első megfigyeléseket az 1960-as évek közepén rendszeres elektronmikroszkópos vizsgálatok sorozata követte. Kezdetben az egyik leginkább izgalmas kérdés az volt, hogy hogyan kerül be egy membránnal határolt térbe a citoplazmán belül magának a citoplazmának egy része? Másképpen fogalmazva, hogyan történik a lebontandó citoplazma rész membránnal való elkülönítése a citoplazma többi részétől. (Erre a folyamatra ma is több kifejezést használnak úgymint izolálás, szegregálás, szekvesztráció; isolation, segregation, sequestration.) Ennek a kiderítése során meg kellett küzdeni a hagyományos, metszetekkel dolgozó elektronmikroszkópia azon alapvető problémájával, hogy kétdimenziós adatokból négydimenziós következetéseket kell levonni. Ennek ellenére az 1960-as évek második felének végére széles körben elfogadott leírása született az autofágia számos alapvető jellegzetességének. Ericsson 1969-ben közölt összefoglalójában többféle, spekulatív úton felvetett elvi lehetőséget mutat be az autofág vakuólák keletkezéséről (Ericsson, 1969a) (1.8-1.11. ábra).

Fekete vonalas ábra balról jobbra mutatja az autofág szekvesztráció feltételezett lépéseit: 1: a plazma membránból vezikula fűződik le, 2: ellapul és ráhajlik egy mitochondriumra, 3: kettős membránként körbeveszi azt, 3: végei egyesülnek és bezárul 4: a szekvesztrációs membrán szimpla membránná alakul körül

1.8. ábra Egy vagy több endocitózis vakuóla lapul el és veszi körbe a citoplazma egy részét

Fekete vonalas ábra balról jobbra mutatja az autofág szekvesztráció feltételezett lépéseit: 1: a plazma membránból vezikula fűződik le, 2: egy mitokondrium áthatol a vezikula membránján, 3: ezáltal kialakul egy szimpla membránnal körülvett mitokondrium

1.9. ábra A mitokondrium áthatol egy már meglévő endocitózis vakuóla membránján lévő résen

Fekete vonalas ábra balról jobbra mutatja az autofág szekvesztráció feltételezett lépéseit: 1: a kettős szekvesztrációs membrán növekszik egy mitokondrium körül, 2: a kettős szekvesztrációs membrán körbevett egy mitochondriumot, 3: a szekvesztrációs membrán szimpla membránná alakul

1.10. ábra A citoplazmában már meglévő, vagy újonnan (de novo) keletkezett ciszterna hajtja végre a szekvesztrációt

Fekete vonalas ábra balról jobbra mutatja az autofág szekvesztráció feltételezett lépéseit: 1: a szimpla szekvesztrációs membrán ráhajlik egy mitochondriumra, körbeveszi és 2: végei egyesülnek és így bezárul

1.11. ábra Egymásra hajló membrán lemezek végzik a szekvesztrációt melyek végül összetapadnak

A kiigazodást erősen zavarta, hogy egyetlen membránnal határoltak mellett, viszonylag nagy számban fordulnak elő kettős membránnal burkolt autofág vakuólák is. Az ilyen kettős határoló membrán ciszternaszerű megjelenést mutat (1.8. és 1.11. ábra). Mivel az autofág vakuólák inkább a sejt belsejében jelentek meg mint a sejtmembrán mellett, valószínűbbnek látszott a határoló membránnak az endoplazmás retikulumból való származás (Ericsson, 1969a). Ez a vélekedés azonban továbbra is hipotetikus maradt, mert nem volt rá meggyőző bizonyíték.

A későbbiek során egyértelműen tisztázódott, hogy az 1.10. ábrán bemutatott lehetőség hasonlít legjobban a valósághoz. Ezzel azonban még nem igazolódott a határoló membránnak az ER-ből való származása, tehát nem oldódott meg a probléma amelynek, lényeges kérdései ma is válaszra várnak. Az erre vonatkozó vitával a továbbiakban is foglalkozunk.