Az autofág vakuólák alapvető jellegzetességei és elektronmikroszkópos felismerésük kritériumai

Az 1960-as évek során kialakultak a szempontok az autofág vakuólák felismerésére. Ezek némi kiegészítéssel ma is érvényesek és fontos lenne, hogy minden esetben precízen alkalmazzák őket új objektumoknak (sejttípusoknak) az autofágia kutatásába való bevonásakor. Az autofág elemek elektronmikroszkóppal történő azonosítása nélkülözhetetlen az újabban egyre többször használt fény- és elektronmikroszkópos markerek specificitásának igazolásához is. A bizonyítás alapja, mintegy az autofágia „conditio sine qua non”-ja (ami nélkül nem beszélhetünk autofágiáról), hogy a metszeteken membránnal teljesen körülhatárolt citoplazma területek forduljanak elő. A határoló (izoláló, szegregáló, szekvesztráló) membrán fontos és alapvető tulajdonsága, hogy felületén nincsenek riboszómák, tehát un. sima felszínű membrán (ld. az 1.10. ábrát).

Az 1960-as évek során sok minta gondos elemzésével megállapították, hogy a legkorábbi autofág vakuólák, amelyekben a citoplazma tartalom a morfológiai változás jeleit még egyáltalán nem mutatja, mind kettős membránnal burkoltak. Az így létrejött testet a de Duve és Wattiaux által eredetileg hipotetikusan javasolt kifejezéssel ma is autofagoszómának nevezzük (de Duve és Wattiaux, 1966).

A két membrán között rendszerint rés mutatkozott ami ciszternaszerű megjelenést adott a szekvesztráló membránnak (Ericsson, 1969b; Glinsmann és Ericsson, 1966). Elsősorban ennek alapján a kutatók többsége azt feltételezte, hogy a szegregáló membrán az ER ciszternából annak közvetlen transzformációja által keletkezik, bár szemben az előbbivel, az utóbbihoz riboszómák kapcsolódnak. Noha a legtöbb figyelmet és energiát is e lehetőség igazolásának szentelték, nem sikerült kellően meggyőző bizonyítékokat, pl. a kétféle membrán közötti direkt átmenetet találni az izoláló membrán eredetének egyértelmű eldöntéséhez.

Az 1960-as évek második felében véglegesen tisztázták, hogy az autofagoszóma lizoszómával való fúzió révén alakul át autolizoszómává, és beltartalma ezt követően morfológiailag szétesik (degradálódik), majd megemésztődik (Arstila és Trump, 1969; Ericsson, 1969b). A 1.12.-1.16. ábra a klasszikus, szekvesztrációval kezdődő autofág folyamat fő lépéseit mutatja.

Fekete vonalas ábra, a dupla szekvesztráló membrán körbevesz egy citoplazma területet amely így autofagoszómává válik, a középen felül lévő kis sötétszürke test, a primer lizoszóma egyesül a kép közepén lévő autofagoszómával. A jobboldalon ábrázolt vakuólában a lizoszomális emésztés révén már alig, vagy nem felismerhető a beltartalom, tehát ez a vakuóla autolizoszóma.

1.12. ábra A szekvesztrációval induló autofág folyamat fő lépései. A ma is vitatott eredetű és keletkezési mechanizmusú riboszóma mentes kétrétegű szekvesztrációs membrán „körbenövi” a citoplazma egy részét. A kettős membránnal határolt test az autofagoszóma, benne lebontás még nem folyik. Az autofagoszóma primer lizoszómával fuzionál, ennek révén lebontó enzimekhez jut, autolizoszómává alakul

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, a dupla szekvesztráló membrán körbevesz egy citoplazma területet.

1.13. ábra A szekvesztrációval induló autofág folyamat első lépése elektronmikroszkópos képen. A ma is vitatott eredetű és keletkezési mechanizmusú riboszóma mentes kétrétegű szekvesztrációs membrán „körbenövi” a citoplazma egy részét. (egér ondóhólyag hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, a dupla szekvesztráló membrán körbevesz egy citoplazma területet.

1.14. ábra A szekvesztrációval induló autofág folyamat korai fázisa elektronmikroszkópos képen. A ma is vitatott eredetű és keletkezési mechanizmusú riboszóma mentes kétrétegű szekvesztrációs membrán „körbenövi” a citoplazma egy részét. (egér ondóhólyag hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép. A dupla szekvesztráló membrán körbevesz egy citoplazma területet, amely így autofagoszómává válik. A jobboldalon ábrázolt és az 1.16. ábrán lévő vakuólában a lizoszomális emésztés révén már alig, vagy nem felismerhető a beltartalom, tehát ez a vakuóla autolizoszóma.

1.15. ábra Az autofágia elektronmikroszkópos képen. A kettős membránnal határolt test az autofagoszóma. Benne lebontás még nem folyik. (egér ondóhólyag hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, a vakuólában a lizoszomális emésztés révén már alig, vagy nem felismerhető a beltartalom, tehát ez a vakuóla autolizoszóma.

1.16. ábra Autofagoszóma primer lizoszómával fuzionál, ennek révén lebontó enzimekhez jut, autolizoszómává alakul. Az autolizoszómában zajlik a szekvesztrált citoplazmatikus anyag lebontása, ami által a szekvesztrált citoplazmatikus alkotórészek felismerhetetlenné válnak majd teljesen elemésztődnek (egér ondóhólyag hámsejt)

Fontos hangsúlyozni, hogy az autofágia elektronmikroszkópos kimutatásához önmagában nem elegendő, ha a metszetben (tehát síkban) kettős membránnal körülvett citoplazma részeket látunk. A teljes zártság bizonyítását minden igényt kielégítő módon sorozatmetszetek készítésével végezhetjük el (1.17-1.20. ábra). Ez azonban rutin vizsgálatok számára túlságosan fáradságos és hosszadalmas, ezért alkalmazására ritkán kerül sor.

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép egy autofág vakuóláról, mely éppen belekerül a metszetbe.

1.17. ábra Egy autofagoszóma sorozatmetszet első képe, a metszés síkja éppen eléri a vakuólát. Látszik, hogy az autofagoszómát határoló membrán a metszeten zárt; (C. elegans hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép egy autofág vakuóláról, közel teljes átmérőjével.

1.18. ábra Egy autofagoszóma sorozatmetszetéből az autofagoszóma közepéhez közel készült metszet. Látszik, hogy az autofagoszómát határoló membrán a metszeten zárt; (C. elegans hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép egy autofág vakuóláról, közel teljes átmérőjével.

1.19. ábra Egy autofagoszóma sorozatmetszetéből az autofagoszóma közepéhez közel készült metszet. Látszik, hogy az autofagoszómát határoló membrán a metszeten zárt; (C. elegans hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép egy autofág vakuóláról, mely még éppen belekerül a metszetbe.

1.20. ábra Egy autofagoszóma sorozatmetszetéből készült kép, ahol a metszési sík még éppen érinti a vakuólát. Az előző képekkel egybevetve látszik tehát, hogy az autofagoszómát határoló membrán minden metszeten zárt; (C. elegans hámsejt)

Újabban bizonyos mértékig segíthet ebben az un. háromdimenziós elektronmikroszkópia (3D electron microscopy) ami, bár nem egyszerűen, de lehetővé teszi a szokásosnál 2-3-szor vastagabb (250-300 nm) metszetek vizsgálatát.

A sorozatmetszetek hiányát pótolhatja a degradációs sorozatok létének bemutatása is. Ezek az emésztés előrehaladását közvetetten bizonyító, a membránnal körülvett szegregált citoplazma komponensek morfológiailag kimutatható fokozatos dezintegrációját mutató képsorok (1.21-1.24. ábra). A módszer lényegében a folyamat időbeli nyomon kísérését jelenti. Logikai alapja az, hogy ha a dezintegrálódás fokális marad, (azaz a határoló membránon belülre korlátozódik), az közvetve a három dimenzióban való zártságot bizonyítja (Ashford és Porter, 1962). A fokális degradációs jelleg annyira jellemző, hogy több szerző egyenesen „fokális citoplazmatikus degradációnak” nevezte magát az autofág folyamatot (Hruban és mtsai., 1963).

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, a kép közepén egy majdnem teljesen kész autofagoszóma látható.

1.21. ábra Egy csaknem teljesen zárt izoláló membránnal körülvett citoplazma rész (C. elegans hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, a kép közepén egy teljesen kész autofagoszóma látható.

1.22. ábra Kettős izoláló membránnal teljesen körülvett citoplazma rész amelynek beltartalma morfológiailag nem változott, a degradáció jeleit nem mutatja, tehát autofagoszómáról van szó; (C. elegans hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, a kép közepén egy egyöntetűen sötét beltartalmú vakuóla látható.

1.23. ábra Bár a belső membrán még helyenként felismerhető, az izolált citoplazma rész denzitása erősen megnőtt, a beltartalom már nem felismerhető, a morfológiailag kimutatható destrukció már elkezdődött, de a szerkezet még kompakt, az emésztés nem előrehaladott, itt tehát már korai autolizoszómával van dolgunk (C. elegans hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, a kép közepén egy világos területeket is tartalmazó inhomogén vakuóla látható.

1.24. ábra A beltartalom lazább heterogén, a belső membrán már lebomlott, az emésztés tehát előrehaladott, ami aktívan degradáló autolizoszómára vall (C. elegans hámsejt)

Amint arról fentebb már esett szó, fontos bizonyíték, hogy a membránnal határolt degradációs sorozatok egyes tagjaiban meg kell jelenniük a lizoszomális enzimeknek (1.25-1.26. ábra). Az enzimkimutatások nehézkessége miatt természetesen irreális követelmény lenne, ha ezt minden mintában ki kellene mutatni. Minden olyan esetben demonstrálni kell azonban az enzimműködés jelenlétét megfelelően kiválasztott mintákban, amikor új, szokatlan sejttípusról, vagy az autofágiával újonnan kapcsolatba hozott folyamatról van szó.

Éppen az enzimműködés kritériumának vizsgálata során derült ki, hogy a morfológiailag kimutatható változást még nem szenvedett, de már szegregált citoplazma területek, tehát az autofagoszómák nem tartalmaznak savas hidrolázokat. Ennek alapján vált általánosan elfogadottá az a felismerés, hogy a folyamat prelizoszómális (szekvesztrációs és autofagoszómális) szakasszal indul (Glinsmann és Ericsson, 1966) (Arstila és mtsai., 1972; Arstila és Trump, 1968; Pfeifer, 1976).

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, közepén egyetlen, sötét csapadékot tartalmazó vakuóla látható.

1.25. ábra Savas foszfatáz jelenlétét kimutató sötét csapadék autolizoszómákban (patkány eritroblaszt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, közepén három, sötét csapadékot tartalmazó vakuóla látható.

1.26. ábra Savas foszfatáz jelenlétét kimutató sötét csapadék autolizoszómákban (patkány hasnyálmirigy mirigy hámsejt)

Meg kell említenünk, hogy bizonyos sejttípusokban előfordulhatnak heterogén beltartalmú, a késői autolizoszómákhoz morfológiailag hasonlító vakuólák. Ezek lehetnek akár olyanok is amelyeknek a funkciójáról az irodalomban sem találunk adatokat. Ilyenkor ki kell derítenünk, hogy megtaláljuk-e a későinek látszó autofág vakuólának a feltételezett autofág folyamat korábbi szakaszában lévő képviselőit, azaz rekonstruálnunk kell az izolált beltartalom fokozatos degradációjának menetét. Ha ez nem lehetséges, akkor az összetéveszthető szerkezet nem autofág elem (pl. 1.27-1.28. ábra).

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, középen egy-egy sötét és világos foltot tartalmazó heterogén bennékű vakuóla.

1.27. ábra Heterogén beltartalmú autolizoszómához hasonló testek, amelyek valószínűleg szekréciós elemek (C. elegans hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, középen egy-egy sötét és világos foltot tartalmazó heterogén bennékű vakuóla.

1.28. ábra Heterogén beltartalmú autolizoszómához hasonló testek, amelyek valószínűleg szekréciós elemek (C. elegans hámsejt)

Külön említést érdemelnek a soksejtűek bizonyos szöveteiben elterjedt interdigitációk, tehát a szomszédos sejtek plazma membránnal körülvett egymásba tűrődései. Ezek metszetben az autofagoszómákhoz hasonlóan dupla membránnal határolt területekként mutatkozhatnak (1.29-30. ábra), holott a térben vizsgálva ujjszerű képződmények. Sorozatmetszetekkel itt is egyértelműen tisztázható a helyzet, ez azonban még egyetlen esetben is jelentős munkabefektetést igényel, minden egyes struktúra esetében pedig gyakorlatilag kivihetetlen. Szerencsére egyéb támpontokat is találhatunk a megkülönböztetésre. Bár első látásra nem szembetűnő, de az interdigitációk határoló membránja kimutathatóan különbözik az autofagoszómákétól. Az első különbség, hogy a plazmamebrán un. vastag típusú membrán, amely elektronmikroszkópban mérve kissé vastagabb (9-10 nm) az autofagoszóma membránjánál (7-8 nm). Egy másik diagnosztikus sajátosság, ami a figyelmes olvasónak már föl is tűnhetett az, hogy az izoláló membrán két rétege a szokásos aldehid fixálás után túlnyomórészt szétválik és így benne egy üres rés keletkezik. Ez a helyenként igen feltűnő rés nem mutatkozik a két szorosan egymásra fekvő plazma membrán között. Az itt felsorolt jellegzetességeket mutatjuk be a 1.29-1.35. ábrákon.

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép. A közepén két erőteljes kör alakú párhuzamos fekete vonalként jelentkező plazmamembrán citoplazma területet vesz körül.

1.29. ábra Interdigitáció autofagoszómához hasonló megjelenésű metszete. Jól látható, hogy a határoló membránok között nincs rés, és vastagságuk a belül lévő RER membránjáénál nagyobb (C. elegans hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, közepén két erőteljes köralakú párhuzamos fekete vonalként jelentkező plazmamembrán citoplazma területet vesz körül.

1.30. ábra Interdigitáció (C. elegans hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, a 1.30. ábra kettős membránjának egy része látszik kinagyítva, fentről jobbfelé ívesen haladva.

1.31. ábra Interdigitáció kinagyított része (C. elegans hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, közepén két közepesen erős köralakú párhuzamos fekete vonalként jelentkező izoláló membrán citoplazma területet vesz körül.

1.32. ábra Az autofagoszóma dupla membránjának két lemeze között változó szélességű rés van (C. elegans hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, 1.32. ábra kettős membránjának egy része látszik kinagyítva, fentről lefelé balra ívesen haladva.

1.33. ábra Az előző kép kinagyított részén látható, hogy az izoláló membrán és az ER membrán azonos vastagságú, vékonyabb membrán (C. elegans hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, közepén izolált citoplazma részt nagyrészt erősen tágult réssel bíró izoláló membránok veszik körül.

1.34. ábra Ebben az esetben az autofagoszóma dupla membránjának két lemeze között különösen nagy rés van (C. elegans hámsejt)

Szürke árnyalatos elektronmikroszkópos kép, a 1.34. ábra kettős membránjának egy része látszik kinagyítva a rés két oldalán fekete vonalként.

1.35. ábra A kinagyított részen jól látható a plazmamembrán és az izoláló membrán vastagságának különbözősége (C. elegans hámsejt)

További félreértéshez vezethet, hogy az autofagoszómához hasonló kettős membránnal határolt képlet jöhet létre pusztuló sejtek membránnal borított fragmentumainak (ún. apoptotikus testek) a fagocitózisa révén is (ld. később). Az így felvett idegen citoplazma részek a fagocitáló sejtben kettős membránnal határolt testek lesznek, azonban ezek is vastag plazma membránnal borítottak. Bonyolítja a helyzetet, hogy az interdigitációkkal ellentétben, ahol degradáció sohasem történik, a heterofágiával felvett apoptotikus testek szintén lebomlanak. A beltartalom tehát az autofágiához hasonlóan degradálódik. Az előrehaladott lebomlás fázisában már csak egy határoló membrán van, amely mindkét esetben vastag típusú. Ehhez hasonló gond vetődik fel a feladatuknál fogva erős fagocitotikus aktivitással bíró sejtekben zajló autofágia vizsgálatában. A problémákhoz ráadásul még hozzájárul az is, hogy az auto- és heterofág eredetű vakuólák a folyamat második szakaszában össze is olvad(hat)nak. Mindezek miatt fontos felismernünk azokat a kísérleti körülményeket amelyekben az autofágiával párhuzamosan fagocitózis is folyik és ilyenkor különös figyelemmel kell analizálnunk az eredményeket. A kérdésnek az izoláló membránt érintő néhány vonatkozására kitérünk még az 1.12 fejezetben.