Hogyan viszonyul egymáshoz az autofágia és a biokémiai módszerekkel mérhető lizoszomális fehérje lebontás?

A fejezetcímben megfogalmazott kérdés a hatvanas-hetvenes évek során egyre markánsabban rajzolódott ki. Láthattuk, hogy már 1960-as évek során világossá vált az, hogy az autofágia a lizoszomális lebontó folyamatok része, és nyilvánvalóan részt vesz a fehérjék intracelluláris degradációjában is. Ennek ellenére a két folyamat kutatása kezdetben jellemző módon egymástól függetlenül, egymással párhuzamosan folyt. Nagy szerepe volt ebben a vizsgálati módszerek különbözőségének. Az autofágiát szinte kizárólag elektronmikroszkópos morfológia segítségével, míg a fehérjék katabolizmusát sejtbiokémiai módszerekkel vizsgálták. A fehérjelebontás kutatásában eleinte a prokarióták és a magasabbrendű eukarióták fehérjedegradációs mechanizmusainak összehasonlítása iránt volt nagyobb érdeklődés. A párhuzamosan végzett munkában felhalmozódó eredmények, tapasztalatok, módszertani újítások és a felszínre kerülő új kérdések együttes hatására a hetvenes években már lehetségessé vált a két folyamat közötti kapcsolatra vonatkozó adatok gyűjtése, és konkrét kísérleti eredmények alapján történő diszkussziója. Jellemző maradt ugyan az adott terület sajátos metodikai arzenáljának a szinte kizárólagos alkalmazása, született azonban példája a komplex megközelítésnek is. Az 1970-es évek közepétől jelentős haladás történt mind a degradáció mechanizmusainak, mind a lebontó folyamatok szabályozásának megismerésében beleértve az autofagocitózist is.

A legnehezebb kérdést az jelentette, hogy amint azt már említettük, a sejteket alkotó különböző proteineknek egyedi fél-életideje van, ami percektől órákon át napokig, hetekig vagy akár még tovább terjed, ez pedig nem összeegyeztethető az autofág-lizoszómális rendszer alapvetően nem szelektív működésével. A szelektív turnover megtalálható volt a baktériumokban is, amelyek nem rendelkeznek lizoszómákkal (Goldberg és Dice, 1974).

Az 1970-es évek során izolált-perfundált májban Glenn Mortimore és munkatársai kimutatták, hogy aminosavak és inzulin hozzáadása a fehérjelebontással párhuzamosan csökkentette, míg megvonásuk növelte az endogén proteolízist, a lizoszómák ozmotikus fragilitását (ami méretükkel és membránjuk természetének megváltozásával függ össze), valamint a lizoszomális kompartmentum morfometriailag meghatározott méretét (Mortimore és Schworer, 1977; Neely és mtsai., 1974; Woodside és Mortimore, 1972). Ezzel összehangzó eredmények (protein degradáció és fragilitás fokozódás) születtek a glukagon hatásával kapcsolatban is (Deter és De Duve, 1967; Schworer és Mortimore, 1979; Woodside és mtsai., 1974), amelyről már a 60-as évek elején ismertté vált, hogy autofág vakuólák megjelenését idézi elő (Ashford és Porter, 1962).

Az endogén proteolízis és a lizoszómális aktivitás összefüggését vizsgálták Per Ottar Seglen (függelék 18. ábra) norvég kutató és munkatársai az 1970-es és 80-as évek során. A kutatások kiindulópontja az az eredmény volt, hogy izolált májsejtekben a glutamin deaminálásából származó (Seglen, 1975) és a kívülről adott ammónia egyaránt gátolja az endogén proteolízist, ugyanakkor növeli a lizoszómák méretét (Seglen és Reith, 1976).

Ezt követően kiderült, hogy a fehérjék radioaktív jelölése nyomán (1.3. ábra) az izolált májsejtekben éheztetés körülményei között (tehát aminosav hiányos médiumban tartott sejteken) mérhető teljes fehérjelebontásnak egy része gátolható volt lizoszómális támadáspontú gátlószerekkel (aminokkal, mint pl. ammónia, metilamin, propilamin, leupeptinnel, vinblasztinnal ld. később) a másik része pedig nem. A kísérleti adatok szerint a gátlásnak van egy jól reprodukálható maximális értéke, tekintet nélkül az alkalmazott gátlószerre (1.36. ábra).

Vonalas grafikon; az x tengelyen az idő (0-90perc), az y tengelyen a fehérje degradáció (%) látható; öt lineárisan növekvő vonal mutatja a fehérje degradáció időbeli növekedését, közülük a világos körrel ábrázolt kontroll 0-6,5 %-ig nő, míg a többi négy hasonló értéket ad és 0-1,6-2,5 %-ig nő; a kettő különbsége a lizoszomális (piros L), míg a maradék a nem lizoszomális (kék NL) degradáció

1.36. ábra Többféle gátlószer (fehér kör: kezeletlen kontroll, fekete kör: aminosavak, fekete háromszög: leupeptin, fehér háromszög: propilamin, fehér négyszög: vinblasztin) hatása az intracelluláris fehérjelebontásra izolált májsejtekben; a maximális hatást biztosító koncentrációban adott gátlószerek 65-70 %-ban gátolják a lebontást, ami a lizoszomális lebontás (L) mértékének felel meg, szemben a nem lizoszomális lebontás (NL) 30-35 %-os értékével.

Ezen eredmények szerint tehát különbséget lehet tenni a lizoszomális és nem lizoszomális lebontás között. Ilyen típusú kísérletekkel (amelyek további részletezésétől eltekintünk), azt is ki lehetett mutatni, hogy a teljes degradációban még több részfolyamat szerepel, mivel a nem lizoszomális degradáción belül energiafüggő és energia független komponensek is szerepelnek (1.37. ábra) (Gordon és mtsai., 1987).

Vonalas grafikon; az x tengelyen a hőmérséklet (15-40 oC), az y tengelyen a fehérje degradáció (%) látható; három növekvő meredekségű vonal mutatja a fehérje degradáció hőmérsékletfüggő növekedését, közülük a világos körrel ábrázolt kontroll 1,5-14,5 %-ig nő, a középső fekete körrel jelölt a propilamin által gátolt lizoszomális, az alsó fehér háromszöggel jelölt a propilamin+kimosztatinnal gátolt nem lizoszomális energia független, míg a megmaradó hányad a nem lizoszomális energia függő lebontás

1.37. ábra A teljes intracelluláris fehérje lebontás összetevőire bontása a degradáció differenciális gátlásával izolált májsejtekben. Radioaktív aminosavval való rövid (néhány órás) jelölés után a teljes lebontás (kontroll) 35%-a lizoszomális (a lizoszomális támadáspontú propilaminnal (prop) gátolható), 65%-a pedig nem lizoszomális; a nem lizoszomális lebontáson belül további propilamin + kimosztatinnal (kimo) gátolható 30 % nem lizoszomális és energia függő, a maradék 35 % pedig nem lizoszomális energia független. (Az energiafüggőség megállapításához további itt nem részletezett számításokra van szükség.)

Az előzőekben már szó volt arról, hogy milyen sokféle vegyülettel és behatással befolyásolható, stimulálható és gátolható az autofág vakuólák elektronmikroszkóppal kimutatható megjelenése különböző sejttípusokban. Az eredmények diszkutálása során a kutatók, természetes logikával, az autofág vakuólák mennyiségének csökkenését az autofág aktivitás csökkenésével, szaporodásukat az autofágia intenzitásának a növekedésével magyarázták. Hasonlóan, vizsgálatok sorozatát végezték el sejt biokémikusok az endogén fehérje degradáció mérésével. Nem történt azonban meg a kétféle adatsor összehasonlító elemzése.

Erre került sor ezen fejezet szerzőjének a Per Seglen laboratóriumában végzett munkája során, korrelatív biokémiai és elektronmikroszkópos morfometriai módszerek segítségével. A kísérletekben négy gátlószert alkalmaztunk, aminosavakat, vinblasztint, leupeptint és propilamint. Ezeknek a lizoszomális támadáspontú gátlószereknek a maximális hatása a teljes lebontásra nagyjából azonos volt. Ezek a szerek egy bizonyos, még toxikus koncentrációban egymással gyakorlatilag megegyező mértékben gátolták a lizoszomális degradációt. Ennek értéke adott jelölési feltételek mellett a lebontásnak közelítőleg 70 %-át teszi ki. Ezt az értéket tekintjük a lizoszomális degradáció mennyiségének.

A gátlószerek tehát egyformán hatottak a lebontásra, különbségek mutatkoztak azonban az autofág vakuólák mennyiségére gyakorolt hatásukban. Az aminosavak egyaránt csökkentették mind a fehérjelebontást, mind az autofagoszómák és autolizoszómák mennyiségét. Ez azzal magyarázható, hogy az aminosavak az autofág szekvesztráció gátlása révén csökkentik a fehérjelebontást.

A másik három szer, miközben az aminosavakkal lényegében azonos mértékben csökkentette a biokémiailag mérhető fehérjelebontást, egyúttal erősen megnövelte az autofág-lizoszómális rendszer citoplazmához viszonyított térfogatát. Ezek az eredmények világosan bizonyították, hogy az autofág vakuólák számának, az autofág-lizoszómális kompartmentum méretének növekedése paradox módon nemcsak a lebontás stimulálásával (Kovács és mtsai., 1981), de annak gátlásával is együtt járhat (Kovács és mtsai., 1982). Ennek magyarázata abban rejlik, hogy az utóbbi három szer az autofág-lizoszómális lebontást az autofagoszómák keletkezését követő lépésekben gátolják. Részletesebb morfológiai vizsgálatok hozzásegítenek ahhoz is, hogy megállapítsuk mely lépésekről lehet szó.

Morfológiai szempontból vizsgálva, az autofagoszómák minden kezelésben hasonló megjelenésűek voltak. Bennük nem, vagy alig változott a szekvesztrált organellumok, (pl. mitochondriumok, RER azaz a Riboszómás Endoplazmatikus Retikulum) struktúrája (1.38-1.40. ábra).

A kép közepén dupla membránnal határolt citoplazma részletet tartalmazó autofagoszóma látható, benne középszürke alap citoplazma, szekréciós vezikula és RER

1.38. ábra Autofagoszóma vinblasztin kezelés után (patkány izolált májsejt)

A kép közepén dupla membránnal határolt citoplazma részletet tartalmazó autofagoszóma látható, benne mitokondrium, középszürke alap citoplazma és RER.

1.39. ábra Autofagoszóma leupeptin kezelés után (patkány izolált májsejt)

A kép közepén dupla membránnal határolt citoplazma részletet tartalmazó autofagoszóma látható, benne középszürke alap citoplazma riboszómákkal és SER.

1.40. ábra Autofagoszóma propilamin kezelés után (patkány izolált májsejt)

A mikrotubulusok szétesését okozó vinblasztin kezelés után elsősorban az autofagoszómák mennyisége nőtt meg (1.41. ábra). A lizoszomális proteázgátló leupeptin hatására olyan autofág vakuólák halmozódtak fel a leginkább, amelyekben a szekvesztrált citoplazma részeket nehezen, vagy egyáltalán nem lehetett felismerni és beltartalmuk denzitása megnőtt (1.42. ábra). A propilamin hatására az autofág vakuólák erős duzzadást mutattak és bennük szétesett, de meg nem emésztett szekvesztrált fragmentumok halmozódtak fel (1.43. ábra) (Kovács és mtsai., 1982).

A képen alus szürke területként tűnik elő a sejt perifériás része, benne a citoplazmával megegyező denzitású autofagoszómák

1.41. ábra Vinblasztin kezelés esetében túlnyomó többségben vannak az autofagoszómák (patkány izolált májsejt)

Két nagy komplex heterogén denzitású autolizoszóma látható a képen, amelyekben már fel nem ismerhető részben degradálódott citoplazma részek vannak.

1.42. ábra Leupeptin kezelés esetében túlnyomó többségben vannak a komplex, fuzionált, jellemzően sötét részben degradált citoplazma részeket tartalmazó konstipált autolizoszómák (patkány izolált májsejt)

Több heterogén denzitású, de nagyrészt világos autolizoszóma látható a képen, amelyekben már fel nem ismerhető részben degradálódott citoplazma részek vannak.

1.43. ábra Propilaminin kezelés esetében túlnyomó többségben vannak a nagyrészt világos, kissé duzzadt, nem fuzionált, szétesett citoplazma részeket tartalmazó autolizoszómák (patkány izolált májsejt)

Ezeket az eredményeket a következőképpen magyarázhatjuk. A vinblasztin a mikrotubulusok szétesését okozza, ennek következtében gátolja a citoplazmatikus mozgásokat. Emiatt lecsökken az autofagoszómák és a lizoszómák találkozásának gyakorisága, tehát a szekvesztrált anyag autofagoszómákban halmozódik fel. A leupeptin és a propilamin, különböző mechanizmussal, a lizoszomális enzimeket gátolják az autolizoszómákban. Leuptetin esetében ez közvetlen proteináz gátlás. A beltartalom destrukciójának, sötét amorf anyaggá alakulásának a valószínű magyarázata az, hogy alacsony a pH és a proteinázokon kívül az egyéb lebontó enzimek működnek. Az aminok azt okozzák, hogy a savas pH-jú autolizoszómába jutva protonálódnak, és csapdába esve nem tudnak kijutni a lizoszómából. Ezzel csökkentik annak pH-ját, és emellett megnövelik ozmotikus koncentrációját. A pH növekedése megszünteti a lizoszomális enzimek számára szükséges pH optimumot, az ozmotikus hatás pedig az autolizoszóma duzzadásához vezet.

A fenti eredményekkel összhangban az autofág lebontást befolyásoló, annak gátlását okozó hatások és szerek ma is érvényes legjobb csoportosítása a folyamat fő lépéseire gyakorolt hatásuk szerint történik. Ezek szerint vagy a szekvesztrációra, vagy a fúzióra vagy a lizoszomális lebontásra hatnak, esetleg ezek közül egyidejűleg többre is.