2. Az ubiquitin szerkezete, feladatai, és az ubiquitiniláció enzimrendszere

Az ubiquitin a fehérjebontási útvonalak általános jelzőmolekulája

A szubsztrátok célba juttatásában emlős sejtekben az ubiquitin a közös nevező a proteaszóma, az endoszóma-lizoszóma, és az autofagoszóma által történő fehérjebontás, azaz a három fő protein degradációs útvonal esetén (2.1. ábra).

Barnás hátterű egyszerűsített rajz a sejt lebontó rendszereiről és a köztük levő kapcsolatról.

2.1. ábra Az ubiquitin a közös nevező a proteaszóma, az endoszóma-lizoszóma, és az autofagoszóma által történő fehérjebontás, azaz a három fő protein degradációs útvonal esetén

Mindegyik egyedi lebontó útvonalra irányító jel egy jellegzetes hosszúságú és kapcsolódású ubiquitin lánc, mely specifikusan kötődik az adott útvonal receptorához vagy különös érzékenységet mutat az útvonalhoz kapcsolódó deubiquitináz aktivitásra. Mindegyik útvonalnak megvan a maga specifikus receptora (Clague és Urbe, 2010). Ahhoz, hogy egy fehérje letekeredjen és bejusson a proteaszóma belső, fehérjebontó részébe a szabályozó rész Rpn10 és Rpn13 alegységeinek kell felismerniük a rajta lévő ubiquitin láncot (Finley, 2009). Az escort komplexek (ESCRT - endosomal sorting complexes required for transport) segítségével speciális ubiquitiniláció irányítja a kívülről felvett fehérjéket a lizoszomális lebontás felé (Clague és Urbe, 2006). Fontos szerepet játszik az ubiquitin a szelektív autofágiában is (Kirkin és mtsai., 2009). A lebontandó sejtszervecske vagy fehérje előbb ubiquitinilálódik majd a p62/sequestosome 1 vagy az NBR1 (Neighbor of BRCA1 gene 1) adapter fehérje hozzáköti a formálódó pre-autofagoszomális membránhoz. Ezek az adapter fehérjék egyaránt rendelkeznek ubiquitin felismerő UBA doménnel (ubiquitin-interacting domain) és a membrán jellegzetes fehérjéjéhez kapcsolódó LIR motívummal (LC3-interacting region) (Pankiv és mtsai., 2007).

Az ubiquitin közvetítette fehérjebontás felfedezése

A bevezetőben leírtuk, hogy a múlt század közepére a kutatók rájöttek, hogy a sejtekben a fehérjék dinamikus egyensúlyban vannak, azaz az éppen működő készlet az állandó felépítő és lebontó folyamatok eredője. Azt is felfedezték, hogy a sejten belüli fehérjebontás energia igényes, annak ellenére, hogy a peptidkötés felnyílása exoterm folyamat (Simpson, 1953). Ennek a kérdésnek a tisztázására törekedett Etlinger és Goldberg az 1970-es években. Kidolgoztak egy erre a célra nagyon alkalmas, egyszerű kísérleti rendszert: nyúlból retikulocitákat izoláltak és ezekből ozmotikus sokkal sejtmentes rendszert állítottak elő. A retikulociták a fejlődő vörösvértestek előalakjai, melyekben még megtalálhatók a citoplazmatikus enzimek, de már hiányzik a sejtmagjuk és kevés sejtszervecske van bennük. Ezen a rendszeren azt tapasztalták, hogy az ATP serkenti a fehérjebontást (Etlinger és Goldberg, 1977). Hershko és Ciechanover néhány évvel később ugyanezt a rendszert használta kísérleteihez. A retikulocita-lizátumot DEAE cellulóz oszlopon két frakcióra választották szét: az egyikben egy hőstabil polipeptid, az általuk APF-1-nek (ATP-dependent proteolysis factor 1) nevezett fehérje volt, a másikban a specifikus fehérjebontáshoz szükséges enzimek (Ciechanover és mtsai., 1978). További munkájuk során azt találták, hogy az APF-1 ATP-t igénylő reakcióban kovalensen (izopeptid kötéssel) kötődik a fehérjékhez, egy vagy akár több példányban is (Ciechanover és mtsai., 1980). Radioaktívan jelölt (125I) fehérjét (lizozimet) használva a gélelektroforetikus képen több sávot lehetett megfigyelni, melyek egy vagy emelkedő számú a fehérjéhez kötött APF-1 molekulát tartalmaztak (2.2. ábra).

Fehérje gélelektroforézis fekete-fehér autoradiogramja.

2.2. ábra Kovalens kötés képződése az APF-1 és a lizozim között ATP-függő reakcióban. Az 1-5 sávban az APF-1, a 6-7-es sávban a lizozim volt radiokatívan jelölve. C1-C5 - 1-5 APF-1-et hordozó lizozim fehérje csíkok. Az 1-es és a 6-os sávban hiányzott az ATP a reakcióelegyből, itt nem láthatók a csíkok, azaz nem kötődött az APF-1 a lizozimhoz.

A reakció megfordíthatónak bizonyult, vagyis az APF-1 visszanyerhető volt a konjugátumokból (Hershko és mtsai., 1980). A kutatók már a rendszert összekapcsoló reakciókat is megjósolták (2.3. ábra).

Az APF fehérjéhez kapcsolódásának feltételezett lépései, a kiindulási anyagok és termékek nyilakkal összekötött folyamatábrája.

2.3. ábra Az ATP-függő fehérjebontás 1980-ban feltételezett lépései: 1, APF-1-protein amid szintetáz (lizin -NH2 csoporton hat). 2, Amidáz, mely javítást tesz lehetővé, ha n 1 vagy 2. 3, Peptidázok, melyek az (APF-1)n származékokat bontják, ha n 1 vagy 2. 4, Amidáz az APF-1-X bontására; X lizin vagy kis peptid.

Később kiderült, hogy az APF-1 azonos a már korábban leírt ubiquitinnel (Wilkinson és mtsai., 1980). Az ubiquitin közvetítette fehérjebontás felfedezéséért Aaron Ciechanover, Avram Hershko és Irwin Rose 2004-ben megosztott kémiai Nobel-díjban részesült.

Az ubiquitin szerkezete

  • 76 aminosav, 8,6 kDa

  • Minden eukarióta sejtben előfordul

  • Globuláris, kompakt, ellenálló szerkezet

  • C-terminális: -Leu-Arg-Gly-Gly

  • 7 Lys-ből 2 alkalmas izopeptid kötés létesítésére

Az ubiquitin (ejtsd: ubikvitin) egy 76 aminosavból álló, pontosan 8565 Da molekulatömegű, kis fehérje, mely nagy mennyiségben van jelen az eukarióta sejtekben (ubique (lat.) = mindenütt). Az ubiquitin tömör, gombolyag alakú (globuláris) térszerkezetének (2.4. ábra) három, eltérő kémiai sajátságú oldala van: egy bázikus, egy savas és egy hidrofób.

Az ubiquitin fehérje lila színű térkitöltő modellje.

2.4. ábra Az ubiquitin fehérje térkitöltő modellje

A globuláris molekulán belüli kiterjedt hidrogén-híd rendszer (két α-hélix és öt β-réteg terület) merev szerkezetet ad, ami jól magyarázza az ubiquitin jelentős hőstabilitását és széles pH tűrését. A globuláris magból kilóg a molekula karboxi-terminális vége, ezen keresztül tud más fehérjékhez kapcsolódni (2.5. ábra).

Az ubiquitin fehérje másodlagos szerkezetét mutató rajz, molekulában kialakuló α-hélixek kékek, a β-rétegek zöldek, a 48-as lizin oldallánc rózsaszín.

2.5. ábra Az ubiquitin másodlagos szerkezetét mutató modell. A molekulában kialakuló α-hélixek kékek, a β-rétegek zöldek. A 48-as lizin oldallánc rózsaszín, ez a következő ubiquitin molekula normális kapcsolódási helye a poliubiquitin lánc képzéséhez.

Az ubiquitin rendkívül konzervatív fehérje, az evolúció során aminosav sorrendje alig változott: az élesztő és az ember ubiquitinje mindössze 3 helyen tér el egymástól. Mindez azt mutatja, hogy a rendszer már a korai evolúció során kialakult és majdnem változatlanul fennmaradt (2.6. ábra).

Különböző fajok ubiquitin aminosav sorrendje kék, egybetűs aminosav jelölésekkel egymás alatt felsorolva. Az eltérések türkizkékkel kiemelve.

2.6. ábra Különböző fajok ubiquitin aminosav sorrendjének egybevetése (a türkizkék jelölésű aminosavak az eltérőek)

Ubiquitin gének

  • I., II. osztály (normális körülmények között aktív): Ub-riboszómális fehérje

  • III. osztály (stressz körülmények között aktív): polyubiquitin

  • A keletkező fúziós fehérjéket izopeptidázok darabolják fel

Az ubiquitint kódoló géncsalád igen sokféle tagból áll és mindegyik gén ubiquitin elő-fehérjeként, prekurzor proteinként íródik át. (Géncsaládnak nevezzük az egyszeres génkészletben [monoploid genomban] kétszer vagy többször előforduló, azonos, vagy nagyon hasonló bázissorrendű, egyetlen ősi gén megkettőződésével létrejött géneket.) Az ubiquitin géneknek majdnem minden eukariótában három osztálya fordul elő. Az I. és II. osztályba tartozó gének riboszomális fehérjékkel fuzionált poli-proteineket kódolnak (élesztőben: az UBI1 és az UBI2 a nagy (60S), az UBI3 a kis alegységhez (40S) kapcsolódó gének). Normális körülmények között ezek működnek, azaz ilyenkor a fehérje szintézis és lebontás segédfehérjéi egyszerre keletkeznek. A III. osztályba a poliubiquitin gének tartoznak, melyekben több, azonos állású ubiquitint kódoló szakasz kapcsolódik lineárisan (élesztőben: UBI4, 5 Ub + 1 aa). Ez utóbbiak stressz körülmények között aktiválódnak, vagyis ilyenkor csak a hibás vagy felesleges fehérjék lebontását elősegítő ubiquitin szintetizálódik, méghozzá emelt mennyiségben.

Ubiquitint emberben négy gén kódolja (UBC, UBB, UBA52 and UBA80) és itt is vagy az többszörösen egymásután kapcsolt ubiquitin egységekből álló lineáris fúziós fehérjeként vagy egy-egy riboszomális fehérje (40S riboszomális fehérje L40 (L) vagy 60S riboszomális fehérje S27a (S)) N-terminálisához kapcsolva fordítódik át. A poliubiquitin gének egy vagy több aminosav hosszúságú toldalékot is kódolnak a C-terminálison (2.7. ábra).

Az ubiquitin gének által kódolt fúziós fehérjék stilizált ábrája, kékszínű körök az ubiquitin egységeket , sárga tömbök a túllógó peptideket, zöld tömbök a riboszomális fehérjéket jelölik.

2.7. ábra Az ubiquitin gének által kódolt fúziós fehérjék

Transzláció után a prekurzor molekulákból, a fúziós fehérjékből az ubiquitint a deubiquitiniláló enzimek (DUB) közé tartozó ubiquitin C-terminális hidrolázok (UCH) hasítják le. Ez a folyamat a célfehérjére kötődés előkészítő aktiváló lépéseként is értelmezhető.

Az ubiquitin feladatai

Minden faj ubiquitinjének C-terminális aminosava glicin (2.6. ábra). Ennek karboxil csoportja tud kovalens kötést létesíteni a módosítandó fehérje egyik alkalmas lizin oldalláncának ε-amino csoportjával. A folyamatot, mely megfordítható, ubiquitinilációnak nevezzük a foszforiláció mintájára. Az ubiquitin többféleképpen is kapcsolódhat a megjelölendő fehérjére.

Monoubiquitiniláció

Monoubiquitiniláció esetén csak egy ubiquitin molekula kapcsolódik a célfehérjéhez (… ábra). Ez megváltoztathatja a fehérje aktivitását, sejten belüli helyét vagy kölcsönhatását más fehérjékkel. Számos példa bizonyítja, hogy stabil, monoubiquitinilált fehérjék vannak az élő sejtekben. A magasabbrendű eukarióták sejtmagjában a nukleoszómális hisztonok (H2A, H2B) nagy része monoubiquitinilált formában látja el feladatát (uH2A, uH2B), itt kötődik a sejten belüli ubiquitin 10%-a. A hiszton ubiquitiniláció kapcsolatban van a gén kifejeződés szabályozásával. Az ubiquitin riboszomális fehérjékhez kötődése (ld. ubiquitin gének I. és II. osztálya) elősegíti a riboszómák összeszerelődését, valószínűleg a szubsztrát fehérjék átmeneti stabilizálása által. Ubiquitin kötődik egyes sejtfelszíni receptorokhoz is (pl. limfocita homing receptor), ami azt mutatja, hogy az ubiquitin a receptor molekulák módosítása által részt vesz a sejtfelszíni folyamatokban (sejt-sejt kölcsönhatás, összetapadás). Az endocitózissal felvett integráns membránfehérjék citoplazmatikus vége mindig monoubiquitinilált. Ecetmuslicában ubiquitin kötődhet az aktinhoz. A repülőizomzat vékony filamentumaiban a monoubiquitiniláció periodikus, minden hetedik aktin molekulához kapcsolódik egy ubiquitin. Ezt a stabil, 55 kDa-os aktin-ubiquitin konjugátumot arthrinnak hívják (arthrin – arthropoda actin). A periodikusság az ubiquitin strukturális és/vagy izomműködést befolyásoló szerepére utal.

Multiubiquitiniláció

Az ubiquitin molekulában is van hét lizin (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, Lys63, 2.6. ábra), melyek közül kettő izopeptid kötés létesítéséhez megfelelő helyzetben van (Lys48, Lys63, 2.8. ábra).

Az ubiquitin térszerkezetét mutató modell az α-hélixek kék, a β-rétegek zöld, valamint a lizin oldalláncok sárgaszínű feltüntetésével.

2.8. ábra Az ubiquitin másodlagos szerkezetét mutató modellje. Az α-hélixek kék színűek, a β-rétegek zöldek. A molekulában levő 7 lizin oldalláncai narancssárga pálcikákként vannak feltüntetve. A multiubiquitin láncképzésben részt vevő két leginkább ismert kapcsolódási pont (48-as és 63-as lizinek) külön is meg vannak jelölve.

Így egy, már a célfehérjére kapcsolódott ubiquitin maga is ubiquitinilálódhat, ez a multiubiquitiniláció jelensége (Kirkpatrick és mtsai., 2005). Ilyenkor minden újabb ubiquitin egység C-terminálisa az előző ubiquitin egy specifikus lizin oldalláncához kapcsolódik. Az ubiquitin egyik fő feladata a hibás, sérült, rosszul hajtogatódott fehérjék lebontásra kijelölése. Emellett a szabályozó fehérjék gyors és specifikus lebontásában és a feleslegessé vált, nagy mennyiségű citoplazmatikus fehérjék megjelölésében is részt vesz. A 48-as helyzetű lizinen (Lys-48, K48) keresztül felépülő multiubiquitiniláció szolgál jelként a fehérje proteolitikus útra lépéséhez. Egy másik lizin (Lys-63, K63) is lehet receptora a multiubiquitinilációs folyamatnak, így más, szokatlan, elágazó, Y-alakú multiubiquitinilált fehérjeformák is keletkezhetnek. Ezek könnyen felismerhetők más molekulák számára és nem a lebontást szolgálják (2.9. ábra).

Egy zöld gombolyaggal jelölt fehérje szubsztrát ubiquitinilálódásának lehetséges formái és a Lys 48-on keresztül multiubiquitinilált fehérjék proteaszómális lebontása.

2.9. ábra Az ubiquitiniláció formái

Bár az ubiquitin egy kis fehérje (76 aminosav, 8,6 kDa), ha lebontási jelként akár 4-20 példányban is egy fehérjéhez kötődik, a jel már nagyobb lesz, mint maga a szubsztrát (2.10. ábra).

Tetra-ubiquitin lánc kötődésének térkitöltő modellje. A szubsztrát fehérje kék, az ubiquitin molekulák élénk és halvány rózsaszínűek.

2.10. ábra Az SCR fehérjéhez (kék) kötött négytagú ubiquitin lánc (váltakozva halvány és élénk rózsaszín) és egy kapcsolódás előtt álló ötödik egység (halvány rózsaszín) (vö.: 2.4. ábra)

Az ubiquitiniláció enzimrendszere

Tekintsük át részleteiben az ubiquitin konjugáló enzimkaszkád három enzimjét:

E1 – ubiquitin aktiváló enzim

Az ubiquitin aktiváló enzimből (UBA – ubiquitin activating enzyme) fajonként csak egy típus található a sejtekben. Viszonylag nagy fehérje: hozzávetőlegesen 1.000 aminosavból áll és 115-125 kDa a molekulatömege. Jellegzetessége az ubiquitin kötő zsebben található aktív cisztein, melyhez az ubiquitin molekula C-terminális glicinje tud ideiglenesen kötődni (2.11. ábra).

Egy ubiquitin aktiváló enzim kék színű térkitöltő modellje, a kötött ATP piros, az ubiquitin világos naranscsárga, az enzim aktív ciszteinje zöld.

2.11. ábra Egy ubiquitin aktiváló enzim (E1) térkitöltő modellje. ATP (piros) energiáját felhasználva az ubiquitin (világos naranscsárga) C-terminálisán az enzim aktív ciszteinjére (zöld) kerül

A sejtmagban is megtalálható ez az enzim, tehát valójában sejtenként kétféle molekula fordul elő. Az egyiken van sejtmagi lokalizációs jel (NLS – nuclear localisation signal), a másikon nincs. Élesztőben UBA1-nek hívják az E1-es enzimet.

E2 – ubiquitin konjugáló enzim

Az ubiquitin konjugáló enzimet más néven ubiquitin szállító fehérjének (UBC - ubiquitin carrier protein) hívják, hiszen ez fogja a már aktivált ubiquitin molekulát a célfehérjéhez szállítani. Egyes esetekben az E2-ről közvetlenül kerülhet az ubiquitin a szubsztrátra. Az E2 enzimek jellemzője az UBC domén, mely egy 150 aminosavból álló, 16-18 kDa molekulatömegű egység, ebben található az aktív cisztein oldallánc (2.12. ábra).

Egy ubiquitin konjugáló enzim kék színű térkitöltő modellje, az ubiquitin világos naranscsárga, az enzim aktív ciszteinje sárga.

2.12. ábra Egy ubiquitin konjugáló enzim (E2) térkitöltő modellje. Az ubiquitin aktiváló enzimről az ubiquitin (világos narancssárga) C-terminális vége átmenetileg az ubiquitin konjugáló enzim aktív ciszteinjéhez (sárga) kapcsolódik.

Méretük és felépítésük alapján négy osztályba sorolhatók: Az I. osztályba a csak egy UBC domént tartalmazó enzimek tartoznak (ilyen az élesztő UBC4 és UBC5 E2-es enzime). A II. osztályba kerülőknél a C-terminálison, a III. osztályba soroltaknál az N-terminálison van a fehérje meghosszabbítva. Végül a IV. osztályba tartozóknál az UBC domén mindkét végén ki van egészítve a fehérje.

E3 – ubiquitin ligáz

Az ubiquitin ligázok általában nagyon nagy molekulák. Lehetnek egyetlen polipeptid láncból felépülők, de több alegységből álló összetett rendszerek is. Két altípusuk fordul elő:

1. a RING-finger (RING = really interesting new gene) típus – nem képez tioészter kötést az ubiquitinnel. Feladata, hogy ideiglenesen megköti a célfehérjét és az aktivált ubiquitin molekulát hordozó ubiquitin konjugáló enzimet (E2), alkalmas közelségbe hozza őket és elősegíti az ubiquitin átkerülését a célfehérjére (2.13. ábra, bal oldala).

Az ubiquitiniláció folyamatábrája, melyen az enzimek színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.13. ábra Az ubiquitin ligáz (E3 enzim) két típusa

2. a HECT-domén (HECT = homologous to E6-AP C-terminus) típus – tioészter kötést alakít ki az ubiquitinnel. Ebben az esetben az ubiquitin először a megfelelő E2 enzimről az ubiquitin ligáz aktív cisztein oldalláncára kerül. Ez az E3-ubiquitin tioészter a donor a célfehérjével történő amid kötés kialakításánál (2.13. ábra, jobb oldal).

Az ubiquitin aktiválás és a multiubiquitiniláció lépései

Nézzük most meg részletesebben, hogyan is kötődik az ubiquitin a lebontásra kerülő fehérjére! Az ubiquitin konjugáció többlépcsős folyamat, melyhez fenti három enzim egymást követő működése szükséges (2.14. ábra).

Az ubiquitin aktiváció folyamatábrája, melyen az enzimek színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.14. ábra Az ubiquitin aktiválásának lépései: a) adenilálás, b) AMP → Cys-E1, c) adenilálás, d) Cys-E1 → Cys-E2

A kezdő, aktiválási lépésben ATP felhasználásával tioészter kötés alakul ki az ubiquitin C-terminális glicinjének karboxil csoportja és az ubiquitin aktiváló enzim (E1) láncközi ciszteinjének szulfhidrilcsoportja között (2.14. ábra, a). Ebben a lépésben először ubiquitin-adenilát köztestermék alakul ki PPi felszabadulásával, majd az ubiquitin az E1 cisztein oldalláncára kötődik és AMP szabadul fel. Az aktivált ubiquitin ezután egy ubiquitin-konjugáló enzim (E2, ubiquitin hordozó fehérje vagy ubiquitin carrier protein) specifikus ciszteinjére kerül át (2.14. ábra, d) (Nalepa és mtsai., 2006).

A végső, konjugáló lépésben az ubiquitin az E2-ről a célfehérjére kerül; az ubiquitin C-terminálisán át amid/izopeptid kötést formál a célfehérje egy lizin oldalláncának ε-amino csoportjával (2.13. ábra). A legtöbb esetben a szubsztrátok felismeréséhez egy harmadik faktorra is szükség van. Ezek az E3 fehérjék vagy ubiquitin ligázok az E2 enzimmel és a szubsztráttal egyaránt kapcsolatba lépnek, és így segítik az ubiquitin-protein konjugációt.

Míg az E1 enzimből minden sejtben fajonként csak egyféle molekula van (bár két változat: sejtmagi és citoplazmatikus), E2 enzimből többféle létezik (fajonként 10-30), E3-ból illetve E3 multiprotein komplexből pedig több enzimcsalád (fajonként több száz E3-as enzim). A megfelelő E3 enzimek ismerik fel a lebontandó több ezerféle célfehérjét, így ezek felelősek az ubiquitin-célfehérje kapcsolódás, és ennek következtében a fehérjebontás specifikusságáért (2.15. ábra).

Az ubiquitiniláló enzimek és a szubsztrátok kapcsolatait mutató ábra, melyen az enzimek és a szubsztrátok színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.15. ábra Az ubiquitin konjugáló enzimkaszkád piramis-szerű felépítése

Az ubiquitin ligázok és a szubsztrát felismerés

N-vég szabály

Lássuk most, hogy hogyan ismeri fel egy E3-as enzim a célfehérjét! Általában a célfehérjének illetve egy részletének térszerkezete alapján jön létre a kapcsolódás. Lehetséges, hogy éppen hibás térszerkezete (pl. a felszínen megjelenő hidrofób aminosav oldalláncok) miatt lepleződik le egy fehérje és kötődik egy E3-as enzimhez. Nem biztos, hogy a teljes fehérjét meg kell vizsgálni ahhoz, hogy kiderüljön megváltozott, módosult a szintézise óta. Minden eukarióta fehérje start kodonja metionint kódol, tehát egy frissen elkészült polipeptidlánc N-terminálisán mindig metionin aminosav van. Ha a fehérje módosul, sérül, enzimatikus hasítást szenved, akkor valószínűleg más aminosav lesz az amino-terminálisán. Az E3-as enzimek egy csoportja pontosan ezt ellenőrzi. Alexander Varshavsky fedezte fel, hogy egy citoszólikus fehérje fél-életidejét nagymértékben az amino-terminális csoportja határozza meg (Varshavsky, 1996).

A fehérjék azon tulajdonságait, melyek metabolikus instabilitásukat okozzák lebontási jeleknek vagy degronoknak nevezzük. Az egyik alapvető összetevője egy fehérje lebontási jelnek a destabilizáló N-terminális aminosav. Ezt a jelet N-degronnak hívjuk. Az N-degronok egy fajban kialakuló rendszere, mely különböző destabilizáló aminosavakból áll, az N-vég szabály. Ez a szabály, mely megmutatja egy fehérje fél-életideje és az N-terminális aminosava közti összefüggést, minden eddig vizsgált szervezetben megtalálható E. coli baktériumtól, az élesztőn (S. cerevisiae) át, az emlős sejtekig.

Ha metionin áll az amino-terminálison a fehérjének jellegzetesen hosszú, több mint 20 órás a fél-életideje, míg ha arginin, akkor csak kb. 2 perces. Az erősen destabilizáló amino-terminális csoportok, mint pl. az arginin és aszparaginsav gyors ubiquitinilációt okoznak, míg a stabilizáló csoportok, mint pl. a metionin és a szerin nem. Érdekes, hogy a stabilizáló, illetve destabilizáló amino-terminális csoportok hasonlóak az élesztőben és az emberben, azaz ez a fél-életidőt meghatározó jel változatlan maradt az evolúció sok millió éve alatt.

N-vég szabály az élesztőben

Az élesztőben végzett vizsgálatok szerint egy fehérje N-terminálisán elsődlegesen destabilizáló, azaz fél-életidő csökkentő hatásúak a bázikus oldalláncú aminosavak (arginin, lizin, hisztidin – 1-es típus, N-dp1) és a hidrofób oldalláncú aminosavak (leucin, fenilalanin, tirozin, izoleucin, triptofán – 2-es típus, N-dp2) (2.16. ábra).

Az ubiquitiniláció folyamatábrája és a destabilizáló aminosavak kapcsolatai, rózsaszín és piros betűkkel az elsődlegesen, kékkel a másodlagosan, zölddel a harmadlagosan destabilizáló amnosavakat tüntettük fel, az enzimek és a szubsztrátok színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.16. ábra Az N-vég szabály az élesztőben. Sárga ellipszis jelöli a szubsztrát fehérjét. Rózsaszín és piros betűkkel az elsődlegesen, kékkel a másodlagosan, zölddel a harmadlagosan destabilizáló amnosavakat tüntettük fel.

A citoplazmában előforduló Arg-tRNS-protein transzferáz (R-transferase) enzim, melyet az ATE1 gén kódol az élesztőben, egy fehérje N-terminálisán lévő aszparaginsav illetve glutaminsav aminosavhoz képes egy arginint kötni. Az arginin, mint az előzőekben már láttuk, elsődlegesen destabilizáló aminosav, így a fehérje rövidesen lebomlik. Ezért az aszparaginsavat és glutaminsavat másodlagosan destabilizáló aminosavaknak (N-ds) hívjuk (2.16. ábra).

Az ugyancsak citoplazmatikus N-terminális amidohidroláz (Nt-amidase), melyet élesztőben az NTA1gén kódol, az N-terminálison lévő aszparagint illetve glutamint másodlagosan destabilizáló aszparaginsavvá illetve glutaminsavvá tudja átalakítani. Ezek természetesen a fent leírtak szerint tovább alakulnak és a fehérje végül lebomlik. Ezért az aszparagint és a glutamint harmadlagosan destabilizáló aminosavaknak (N-dt) nevezzük (2.16. ábra).

Élesztőben az ubiquitin aktiválását az Uba1p ubiquitin aktiváló (E1) enzim végzi. A 20 kDa tömegű Ubc2p ubiquitin konjugáló (E2) enzim katalizálja a Cys88-on tioészterkötéssel kötött, aktivált ubiquitin szubsztrát fehérjére kerülését. A folyamatot a 225 kDa tömegű Ubr1p ubiquitin ligáz (E3 vagy N-recognin) segíti azzal, hogy megköti az E2-es enzimet és az N-terminálisán szubsztrátot. Külön kötőhelye van az 1-es illetve 2-es típusú elsődlegesen destabilizáló aminosavaknak. Az 52kDa tömegű Nta1p (Nt-amidase) és az 58kDa tömegű Ate1p (R-transferase) az 1-es típus kötőhelye mellett ugyancsak az Ubr1p-hez kapcsolódik. Az Nta1p közvetlenül is kötődik az Ate1p enzimhez (2.16. ábra). Az enzimkomplex segítségével multiubiquitinilált fehérjét végül a 26S proteaszóma bontja le (Varshavsky, 1996).

A szubsztrátok aktiválása az N-vég szabály útvonalra

Az emlősökben az N-vég szabály lebontási útvonal 1-es típusú (bázikus) és 2-es típusú (hidrofób) destabilizáló aminosavait a 2.17. ábra mutatja.

A destabilizáló aminosavak kapcsolatait mutató ábra, a fehérjék lila tömbökként vannak ábrázolva.

2.17. ábra Az N-vég szabály útján lebomló peptidek keletkezésének lehetőségei emlősökben

Endopeptidázokkal történő hasítás (villám jel) eredményeképpen kerülhet destabilizáló aminosav (X) egy csonkolt fehérje N-terminálisára. Emlősökben működik a metionin-aminopeptidáz, mely metionin és cisztein között hasít. Az N-terminális cisztein későbbi oxidációja is destabilizációhoz vezethet, ha egy 1-es típusú, elsődlegesen destabilizáló arginin kapcsolódik hozzá (2.17. ábra). Emlősökben is működnek specifikus deamidázok, melyek az aszparagint aszparaginsavvá (illetve a glutamint glutaminsavvá) alakítják. Ez az átalakítás lehetőséget ad az arginintranszferáz enzimnek egy arginin az N-terminálishoz kapcsolására (2.17. ábra) (Ravid és Hochstrasser, 2008).

Az N-vég szabály útvonal kaszpázok által képzett szubsztrátjai

A kaszpázok endopeptidázok, melyek a fehérjéket adott sorrendű aminosav részlet után elhasítják. A kaszpáz hasítás helyét és a keletkező polipeptid N-terminális aminosavát néhány példa esetén a 2.18. ábra mutatja.

Kaszpáz enzim nevek kékkel és hasítási helyek felsorolása. A keletkező fragmentum destabilizáló N-terminális aminosavát piros betű mutatja.

2.18. ábra Kaszpázok által képzett N-vég szabálynak megfelelő szubsztrátok. Dm - Drosophila melanogaster, Hs - Homo sapiens és Mm - Mus musculus. A zöld betűk a kaszpázok által felismert aminosav szekvenciát mutatják, a nyíl a hasítási helyet, a piros betű a keletkező fragmentum destabilizáló N-terminális aminosavát jelzik.

Egyelőre még csak a Drosophila DIAP1 esetén bizonyították, hogy a kaszpáz hasítás eredményeként az N-terminálison megjelenő destabilizáló aminosav hatására a keletkező peptid valóban az N-vég szabály útvonalon bomlik le. Megfigyelhető azonban, hogy számos kaszpáz esetén elméletileg hasonlóan destabilizáló aminosav kerül a peptid termék N-terminálisára (2.18. ábra) (Varshavsky, 2003).

Az ubiquitin ligázok osztályai

Láttuk korábban, hogy az ubiquitin ligázoknak (E3) két típusa fordul elő. Nézzük most meg közelebbről, hogyan épülnek fel ezek az enzimek: A RING-finger domént tartalmazó ligázok állhatnak egyetlen polipeptid láncból vagy felépülhetnek több alegységből (pl. SCF komplexum). A HECT-doménnel rendelkező E3-as enzimek egy alegységgel rendelkeznek és az ubiquitiniláció során kovalens kötést létesítenek az ubiquitinnel (2.19. ábra) (Nalepa és mtsai., 2006).

Az E3 enzimek felépítését mutató ábra, melyen az enzimek alegységei és a szubsztrátok színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.19. ábra Az ubiquitin ligázok osztályai. Egy alegységes RING-finger E3-as enzim; HECT-domén E3-as ligáz; és több alegységes RING-finger E3-as ligáz (SCF komplexum). (HECT, homologous to E6-AP C-terminus; RBX, RING-box protein; SCF, SKP1–Cullin–F-box)

RING-finger domén típusú E3-as enzimek

A RING-finger domént tartalmazó ubiquitin ligázok családjának tagjai állhatnak egyetlen polipeptid láncból, működhetnek dimerként vagy felépülhetnek több alegységből. Nézzük meg közelebbről a névadó RING-finger domén szerkezetét.

RING-finger domén

  • ~60 aminosav hosszú szerkezeti egység

  • 2 vagy 3 cinkion stabilizálja

Az emlős genom több mint 600 lehetséges RING-finger E3-as enzimet kódol. A legtöbb RING-finger domén két cinkiont tartalmaz (sárga), melyeket 4 cisztein vagy 3 cisztein és 1 hisztidin oldallánc (piros) stabilizálnak. A domén általános konszenzus aminosav szekvenciája a következő: C-X2-C-X9–39-C-X1–3-H-X2–3-C-X2-C-X4–48-C-X2-C, de más variáció is létezik (2.20. ábra).

A RING-finger doménszerkezete, a cisztein és hisztidin aminosavak piros a cinkionok sárga körökként vannak ábrázolva.

2.20. ábra A RING-finger domén alapszerkezete (C3HC4-típus)

A két cinkion és az őket tartó aminosavak egy átkaroló szerkezetet formáznak. A RING-finger doménnek két változata van, a C3HC4-típus és a C3H2C3-típus, melyek nagyon hasonlóak, csak a cisztein/hisztidin mintázatukban különböznek. Az utóbbi típust szokták RING-H2-fingernek is hívni. Az U-box elnvezésű domén hasonló szerkezet, de nincs benne cinkion (Nalepa és mtsai., 2006).

Egy alegységből felépülő RING-finger domént tartalmazó ligázok

A RING-finger család egyes tagjai egyetlen polipeptidből állnak. Ilyen molekula az Mdm2 illetve egyes IAP fehérjék. Ezek a fehérjék a RING-finger domén részükkel közvetlenül kötok a megfelelő E2-es enzimet és egy másik részükkel pedig a szubsztrát fehérjét (2.21. ábra).

Az egy alegységes E3 enzim felépítését mutató ábra, melyen az enzim és a szubsztrát színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.21. ábra Egy alegységből felépülő RING-finger típusú ubiquitin ligáz (E3). A piros ellipszis a RING-finger domént jelöli.

Gyakori azonban, hogy ezek a monomer ubiquitin ligázok kettesével, a RING-finger doménjükkel vagy az akörüli régióval összekapcsolódnak, homodimereket hoznak létre. Ilyen például a cIAP (cellular inhibitor of apoptosis, másnéven BIRC2), a SIAH (seven in absentia homologue 1), és a TRAF2 (TNF receptor associated factor 2). Képződhetnek heterodimerek is, erre jó példa az Mdm2 (murine double minute 2, emberben Hdm2) és az MdmX (másnéven Mdm4, illetve emberben HdmX vagy Hdm4) összekapcsolódása, vagy a BRCA1 (breast cancer 1) és BARD1 (BRCA1-associated RING domain 1) együttese. Heterodimerek esetén az egyik RING-domén fehérjének (MdmX, BARD1) gyakran hiányzik a ligáz aktivitása és csak stabilizálja az aktív E2-kötő RING-domént.

SCF komplexum

A legismertebb több alegységes RING-finger domén ubiquitin ligáz enzimek az SCF komplexum típusba tartoznak. Az SCF rövidítés a legfontosabb alegységek kezdőbetűiből áll össze: Skp1, cullin, F-box (2.22. ábra).

Az SCF E3 enzim felépítését mutató ábra, melyen az enzim alegységei és a szubsztrát színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.22. ábra Az SCF komplexum típusútöbb RING-finger domén ubiquitin ligáz enzim alegységei

Az SCF komplexum a cullint tartalmazó ubiquitin ligázok alaptípusa. A ligáz a szubsztrátfehérjét az egyik alegységének fehérje-kötő doménjével, a 45 aminosavból álló F-box-szal köti meg. Legalább három osztálya van az F-box fehérjéknek, aszerint hogy milyen a szubsztrátkötő részük: Fbw (WD40 - egy rövid kb. 40 aminosavból álló szakasz, gyakran a Trp-Asp (W-D) dipeptidre végződik), Fbl (LRR - leucine-rich repeat), Fbx. Az F-box protein az Skp1 (S-phase kinase associated protein) fehérjéhez kapcsolódik, ami adapterként vagy zsanérként a cullinhoz köti. A cullin (cull (ang.): összeszed) állványfehérje a komplexum vázszerkezeteként szolgál és másik végén a RING-finger fehérjét (Roc1/Rbx1) tartja, az pedig egy specifikus E2 enzimhez kapcsolódik (2.22. ábra).

Láthatjuk, hogy egy SCF komplexum specificitását elsősorban a szubsztrát felismerő és megkötő F-box fehérje adja. Ezért egy adott enzim megnevezésekor az SCF rövidítés mellé felső indexként az F-box fehérje nevét írják. Például, ha az F-box az Fbl1 osztályba tartozó Skp2, akkor SCFSkp2 lesz az enzim jele (Petroski és Deshaies, 2005) (2.23. ábra).

Egy E3 enzim felépítését mutató ábra, melyen az enzim alegységei színes feltekeredett szalagok formájában vannak ábrázolva.

2.23. ábra Az SCFSKP2 térszerkezete

Egy másik példában az F-box fehérje az Fbw1 osztályba tartozó, 7-szeres WD40 szakaszt tartalmazó β-Trcp1 (β-Transducin repeat containing protein), a komplexum elnevezése: SCFβTrCP (2.24. ábra).

Egy E3 enzim felépítését mutató ábra, melyen az enzim alegységei színes rudakkal vannak ábrázolva.

2.24. ábra Az SCFβTrCP E3 enzim térszerkezete egy lebontandó peptiddel

A szubsztrát fehérje ubiquitinilálását gyakran a szubsztrát fehérje poszttranszlációs módosítása, így hiperfoszforiláció vagy hidroxiláció előzi meg. A különös foszforiláltsági mintázat az egyik jel az E3-as enzim számára a fehérje ubiquitinilálására. Ez játszódik le az SCFβTrCP E3 ligáz két természetes szubsztrátja, az IκB és a β-catenin esetén is.

RING E3 enzim közvetített katalízis mechanizmusa

Az SCFβTrCP E3-as enzim ubiquitinilálási sebessége jelentősen függ az ubiquitinilálandó lizin és az enzim által a szubsztráton felismert ún. destrukciós motívum közötti távolságtól. Ennek vizsgálatára in vitro kísérletben vad típusú és módosított β-catenin és IκBα peptideket használtak (2.25. ábra).

Különböző szubsztrát részletek aminosav sorrendjének összevetése, a destrukciós motívum sárgával jelölt.

2.25. ábra Az SCFβTrCP E3-as enzim aktivitásának méréséhez használt vad típusú és módosított β-catenin és IκBα peptidek. Az ábrán a destrukciós motívum sárgával jelölt, az ubiquitint fogadó lizinek rózsaszínnel a vad típusú peptidhez képest beillesztett aminosavak a wt+4 és wt+8 mutáns β-catenin peptidek esetén zöldek.

Mint az ábrán látható a két természetes szubsztrátban eltérő a távolság a lizin és a destrukciós motívum között, az IκBα-ban pontosan négy aminosavval rövidebb, mint a β-cateninben. A kísérletben létrehozott módosított β-catenin peptidekben a vadtípusnál 8 illetve 4 aminosavval rövidebb valamint 8 illetve 4 aminosavval hosszabb volt ez a távolság (Wu és mtsai., 2003).

Bár az SCFβTrCP E3-as enzim felismeri mindkét természetes szubsztrátját, a kísérlet kimutatta, hogy az IκBα-t nagyobb aktivitással ubiquitinilálja, mert itt éppen megfelelő az enzim számára a fogadó lizin és a felismert destrukciós motívum közötti távolság. Ha a β-cateninben mesterségesen lerövidítették ezt a távolságot, jobb ubiquitinilálási sebességet kaptak a vadtípushoz képest. Minden más változtatás csak gyengébb aktivitást eredményezett (2.26. ábra).

Hat kísérlet mérőpontjaiból rajzolt grafikon.

2.26. ábra Az SCFβTrCP ubiquitinilálási sebessége függ a szubsztrátpeptid lizinje és a destrukciós motívuma közötti távolságtól. A grafikon az ubiquitinilált peptid / összes ubiquitin arány időbeli változását mutatja. Négy párhuzamos kísérlet átlaga illetve standard deviációja szerepel az ábrán.

VBC komplexum (VHL-ElonginB-ElonginC)

  • von Hippel-Lindau tumor szupresszor protein

  • VHL disease – sporadikus vese karcinóma

  • a Hif1α-t és Hif2α-t (hypoxia indukálható transzkripciós faktor) bontja, mely a VEGF-t (vascular endothelial growth factor) szabályozza

A VBC (VHL-elongin B-elongin C) komplexumot a VHL (von Hippel-Lindau) tumor-szuppresszor fehérjével együtt fedezték fel. Az E3-as enzim szubsztrátja, a Hif1α transzkripciós faktor a SOCS box-ot (suppressor of cytokine signalling) tartalmazó VHL fehérjéhez kötődik. A SOCS box az Skp1-hez hasonló elongin C-hez és az ubiquitin homológ elongin B-hez. A komplexum tagja még a Cul2 cullin és a Roc1/Rbx1 RING-finger protein (2.27. ábra).

A VBC E3 enzim felépítését mutató ábra, melyen az enzim alegységei és a szubsztrát színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.27. ábra A VBC komplexum vázlata

Az angiogenezis (érképződés) a tumor növekedés és előretörés alapja. Ennek kulcsszabályozója a hipoxia indukálható faktor (HIF) transzkripciós faktor család, melyek a bioenergetikában, sejt növekedésben és érképződésben érintett gének átíródását indukálják. Hipoxiás körülmények között a HIF fehérjék közül a Hif1α és Hif1β aktív és heterodimert képezve a hipoxia válasz génekhez (hypoxia response elements – HREs) kötődnek a célgének elé. Normális oxigénellátottságú körülmények között a Hif1β stabil, míg a Hif1α fehérjét az ubiquitin–proteaszóma rendszer lebontja, ezzel megakadályozva a transzkripciót. A Hif1α oxigén-függő szabályozásának a kulcsa a VHL komplexum. A HIF1α konzervatív helyzetű prolin aminosavain hidroxilálódik a HIF-prolil-hidroxiláz segítségével. Ez elősegíti, hogy VHL ubiquitin ligáz felismerje és ubiquitinilálja, ami gyors degradációját okozza a proteaszómában. Mindez csak normális oxigén ellátottság mellett zajlik így. Hipoxiás körülmények között a HIF-prolil-hidroxiláz gátlódik, mert az oxigént ko-szubsztrátként használja az aktivitása során.

A 2.28. ábra az SCF típusú sok alegységes RING-finger E3-as enzimeket hasonlítja össze.

Az E3 enzimek felépítését összehasonlító ábra, melyen az enzimek alegységei és a szubsztrátok színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.28. ábra Az SCF típusú sok alegységes RING-finger E3-as enzimek összehasonlító ábrája. A specificitást adó molekula részleteket (F-box, VHL, BTB, DDB1/2, SOCS-box) különböző cullinok kötik a RING-finger fehérjéhez (RBX). Az egyes cullinok egyedi, de szerkezetileg hasonló specificitást adó fehérjéket használnak. (Az ábrán használt rövidítések: β-TRCP, β-transducin repeat-containing protein; BTB, broad complex/tracktrack/bric-a-brac; DDB, DNA-damage binding protein; FBW, F-box and WD40 domain protein; HECT, homologous to E6-AP COOH-terminus; RBX, RING-box protein; SCF, SKP1–Cullin–F-box; SKP, S-phase kinase-associated protein; VHL, von Hippel-Lindau)

Anafázis promóciós komplexum

  • mitotikus orsóban lokalizál

  • metafázis-anafázis átmenet elősegítése

  • ciklin B lebontás

Az APC (anaphase promoting complex, másnéven cyclosome) a legösszetettebb SCF típusú sok alegységes ubiquitin ligáz, mely a mitotikus orsóban található a sejtosztódás idején. Szubsztrátjait a Cdc20 és Cdh1 specifikus aktivátorokon keresztül köti meg. Az APC komplexum fehérjéi a legnagyobbtól indulva sorban a legkisebbig vannak beszámozva (Apc1-10, 2.29. ábra).

Az E3 enzim felépítését mutató ábra, melyen az enzim és a szubsztrát színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.29. ábra Az anafázis promóciós komplexum (APC vagy cyclosome) nevű E3-as enzim alegységösszetételének egyszerűsített rajza

Az Apc2 fehérje egy cullin homológ, az Apc11 egy RING-finger fehérje. Az Apc3/Cdc27, Apc6/Cdc16 és Apc8/Cdc23 fehérjék külön komplexumot formálnak a tetratricopeptide repeat (TPR) doménjük segítségével és valószínűleg a komplexum megtámasztására szolgálnak. Az Apc1 az Aspergillus BimE proteinjének homológja. Az Apc4, Apc5, Apc7 és jópár más alegység szerepe egyelőre ismeretlen.

HECT-domén típusú E3-as enzimek

Emlősökben több mint 30 HECT-domén típusú E3-as enzim fordul elő. A fehérjéknek ez az egyre bővülő családja közvetlenül kapcsolódik a megfelelő ubiquitin konjugáló enzimhez (E2) és ugyancsak közvetlenül a szubsztráthoz (2.30. ábra).

Az E3 enzim felépítését mutató ábra, melyen az enzim és a szubsztrát színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.30. ábra Az E6-AP HECT-domén típusú E3-as enzim vázlata a hozzá közvetlenül kapcsolódó Ubc7 E2-es enzimmel

Többféle feladtuk mellett, a HECT E3-as enzimeknek kiemelkedő szerepe van a fehérje forgalomban, az immunválaszban, és sokféle, a sejtnövekedést és sejtosztódást szabályozó jelátviteli útvonalban (Rotin és Kumar, 2009). A HECT-domén (HECT - Homologous to E6-AP C-terminus) egy 350 aminosav hosszú, 40kDa tömegű fehérje illetve fehérje részlet, mely tartalmaz egy konzervált ciszteint, melyhez az ubiquitin átmenetileg kötődik. Maga a HECT-domén az enzim C-terminálisa felé helyezkedik el, míg az N-terminális sokféle lehet és a szubsztrát kötésért felelős (WW domén: -Trp-(20-22)-Trp-(40)-Pro- felépítésű hidrofób zseb). A HECT-domén maga is kétlebenyű, az N-terminális felé eső N-lebeny lép kapcsolatba az E2-es enzimmel és a C-terminális irányában elhelyezkedő C-lebeny tartalmazza az aktív ciszteint, mely átmeneti tioészterkötést alakít ki az ubiquitinnnel. A domén elnevezését adó fehérje, a humán papilloma vírus E6 fehérjéjéhez asszociált protein (E6-AP) maga is egy E3-as enzim. A neki megfelelő E2-es enzimről, az Ubc7-ről kerül rá az aktivált ubiquitin innen pedig természetes szubsztrátjára, a p53 fehérjére. A DNS megkettőződését leállító, apoptózis beindító fehérje ubiquitinilálása és lebontása kedvező a vírus számára, mert igyekszik megakadályozni a megfertőzött gazdasejt túl korai pusztulását (Jackson és mtsai., 2000).

A 2.31. ábrán vessünk egy pillantást az ubiquitin ligázokra (E3-as enzimekre).

Az E3 enzimek felépítését összehasonlító ábra, melyen az enzimek alegységei és a szubsztrátok színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.31. ábra Az ubiquitin ligázok összehasonlítása. Az ismert ubiquitin ligázok, ha egy polipeptidből épülnek fel, akkor vagy HECT domént, vagy RING finger domént tartalmaznak. A több alegységes ubiquitin ligázoknak mindig van egy cullin alegységük (Cul1–Cul5 vagy Apc2) és egy külön RING finger alegységük. A színkód magyarázta: a szubsztrát fehérje rózsaszín, a szubsztrátkötő fehérje kék, összekötő, zsanér zöld, cullin magenta, RING-finger fehérje vagy domén üres piros kör, E2-es enzim lila.

A deubiquitiniláló enzimek

Mióta a deubiquitiniláló enzimek (DUB), másnéven az ubiquitin C-terminális hidrolázok (UCH) családját felfedezték, nyilvánvalóvá vált, hogy az ubiquitin konjugáció részben megfordítható. A folyamat hasonló a kinázok és foszfatázok által katalizált megfordítható fehérje foszforilációhoz. A deubiquitiniláció megmenthet egyes multiubiquitinilált fehérjéket a proteaszómális lebontástól. Más esetekben, nem degradatív jeleket (pl. monoubiquitin vagy K63-as kapcsolódású multiubiquitin lánc) is eltávolíthat a fehérjékről (2.32. ábra).

A DUB enzimek feladatait bemutató ábra, melyen az enzimek piros, az ubiquitin kék és a szubsztrátok türkizkék tömbökként vannak ábrázolva.

2.32. ábra A deubiquitiniláló enzimek (DUB) enzimek általános feladatai

A DUB enzimek felelnek az ubiquitin homeosztázisért a sejtben és megakadályozzák, hogy az ubiquitin a 26S proteaszóma vagy a lizoszomális útvonal szubsztrátjaival együtt megemésztődjön (ubiquitin reciklizálás). A szubsztrátokról egyben eltávolított multiubiquitin láncokat is a DUB enzimek szerelik szét, biztosítva ezzel, hogy a visszaforgatott ubiquitin megjelenjen a szabad ubiquitin raktárban. Egyes DUB enzimek újra szerkeszthetik a már a szubsztrát fehérjéken lévő ubiquitin láncokat, átalakítva az egyik típusú jelet egy másikká. Mint korábban láttuk az ubiquitint kódoló génekről először lineáris fúziós fehérjék készülnek. A deubiquitiniláló enzimek egyik kulcsfeladata, hogy ezekből a prekurzorokból szabad ubiquitint készítsenek (2.32. ábra) (Komander és mtsai., 2009).

Az ubiquitin rokonai

Az ubiquitin-szerű fehérjék

Az ubiquitin-szerű fehérjék (UBLs - ubiquitin-like proteins) aminosav szekvenciái közötti hasonlóság még a legközelebbieket (Rub1/NEDD8) tekintve is igen alacsony (2.33. ábra).

Különböző ubiquitin-szerű fehérjék aminosav sorrendje fekete, egybetűs aminosav jelölésekkel egymás alatt felsorolva. Az azonos részek fekete, a hasonló részek szürke háttérel kiemelve.

2.33. ábra Az ubiquitin-szerű fehérjék aminosav szekvenciái közötti hasonlóság. Az azonosság feketével, a hasonlóság szürkével jelölt.

Nemcsak az aminosav sorrendjük, az összhosszuk is jelentősen eltérő. A szekvenciák egyetlen közös vonása a C-terminális kettős glicin motívum. Miért tekintjük őket mégis az ubiquitin rokonainak? Az ubiquitin és rokonai elsősorban az ubiquitin superfold térszerkezetben hasonlítanak egymásra. Superfoldnak nevezzük azokat a fehérje hajtogatódási típusokat, melyek semmilyen szekvenciális vagy funkcionális rokonságot nem mutató fehérjék esetén mégis hasonló térszerkezetet kölcsönöznek a polipeptideknek (Welchman és mtsai., 2005). Az ubiquitin superfold β-rétegre épül (2.34. ábra).

Az ubiquitin (kék), a SUMO-1(zöld) és a Nedd8 (piros) egymásra vetített térszerkezete.

2.34. ábra Az ubiquiton – az ubiquitin (kék), a SUMO-1(zöld) és a Nedd8 (piros) egymásra vetített térszerkezete (Ubiquitin - Protein Data Bank (PDB) accession code P62988; SUMO-1 - PDB P63165; NEDD8 - PDB Q15843)

Tehát az ubiquitinnek csak a térszerkezete hasonlít az ubiquitin-szerű fehérjékre, ezeket együtt ubiquiton-oknak nevezzük. Az evolúció során az ubiquitonok hozták létre a szerteágazó funkcióval rendelkező kis fehérjék tárházát. Az ubiquitonok nemcsak kovalensen kötődhetnek, hanem genetikailag be is ágyazódhatnak más, sokkalnagyobb fehérjékbe, mint például a Raf (Rapidly Accelerated Fibrosarcoma) kinázba.

Az ubiquitin-szerű fehérjék legtöbbje inaktív prekurzorokból proteolitikus hasítással válik éretté, aktívvá (2.35. ábra).

Az ubiquitin-szerű fehérjéket összehasonlító ábra, melyen az enzimek alegységei és a szubsztrátok színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.35. ábra Az ubiquitin és két ubiquitin-szerű fehérje (SUMO és Rub) szubsztrátra kerülésének sémája (a nyilhegyek a hasítási helyeket mutatják; a - aminosav)

Az ubiquitin vagy poliubiquitinként, vagy riboszómális fehérjékkel fuzionálva fejeződik ki. Az ubiquitin-szerű fehérjék szubsztrátra kötődéséhez aktiváló (E1) és konjugáló (E2) enzimekre van szükség, melyek tioésztert (S) formálnak a fehérjékkel (2.35. ábra). A cullinok Rub-bal történő módosításához az ubiquitinilálást is végző SCF/CBC-szerű E3-as enzimekre van szükség. Csak a SUMO képes többszörös láncot képezni az ubiquitinhez hasonlóan a szubsztráton, más ubiquitin-szerű fehérjékre ez nem jellemző (Jentsch és Pyrowolakis, 2000).

A SUMO
  • SUMO: small ubiquitin-related modifier

  • gerinctelenekben 1 gén kódolja: SMT3

  • gerincesekben 4 génje van: SUMO-1, 2, 3, 4

  • 101 aminosav, 18%-os hasonlóság az ubiquitinnel

  • 50%-os hasonlóság egymással

  • rövid meghosszabbítás az N-terminálison

A SUMO (small ubiquitin-related modifier) kovalensen módosít fehérjéket és ez szerteágazó biológiai következményekkel jár. Korábban is ismerték, de többféle néven: sentrin, PIC-1, GMP1, UBL1, DAP1. Gerinctelenekben 1 gén kódolja: SMT3 (suppressor of mif two). Gerincesekben 4 génje van: SUMO-1, 2, 3, 4. A kész fehérje 101 aminosavból áll, és csak 18%-os hasonlóságot mutat az ubiquitinnel (2.36. ábra).

Különböző SUMO fehérjék aminosav sorrendje fekete, egybetűs aminosav jelölésekkel egymás alatt felsorolva. Az azonosságok kék, a hasonlóságok sárga háttérel kiemelve.

2.36. ábra Hasonlóság az ubiquitin és egyes SUMO fehérjék között. A humán SUMO-1, -2, és -3 aminosav sorrendjének összehasonlítása az élesztő (Saccharomyces cerevisiae) SMT3-mal és a humán ubiquitinnel. Az azonosságok kékkel, a hasonlóságok sárgával vannak jelölve. A prekurzor hasítás helyét a kettős glicin motívum előtt, a C-terminális közelében, az olló jelzi.

Maguk a SUMO fehérjék is csak 50%-ban hasonlóak egymással. A konjugálás előtt szükség van a fehérje C-terminális végéből egy rövid peptid lehasítására, hogy a kettős glicin motívum előtűnjön. Ezzel kapcsolódik a szubsztrát fehérje egyik lizin oldalláncához. Az Smt3, SUMO-2 és SUMO-3 polipeptidekben konzervatív lizineket is találhatunk, ezek alkalmasak a jelölés láncszerű meghosszabbítására. A SUMO-4 molekula 90. prolin aminosava (Pro90) megakadályozza, hogy a Ulp/SENP enzim (lásd később) lehasítsa az általa megjelölt fehérjéről (Mukhopadhyay és Dasso, 2007; Müller és mtsai., 2001).

A sumoilálásnak a módosított fehérje számára háromféle molekuláris következménye lehet (2.37. ábra).

A SUMO szubsztrátokra konjugálását mutató ábra, melyen az enzimek, és a szubsztrát színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.37. ábra A sumoilálás molekuláris következményei

  1. A sumoilálás akadályozhatja a szubsztrátfehérje és partnere kapcsolódását, így az interakció csak a SUMO hiányában tud létrejönni.

  2. Más esetben éppen a sumoilálás szolgáltathat kötőhelyet a kapcsolódó partner számára, például az úgynevezett nem kovalens SUMO interaktív motívumon (SIM vagy SBM) keresztül. A SIM hidrofób magból áll, amit savas aminosavak vesznek körül, egyes esetekben szerin oldalláncok.

  3. Végül a sumoilálás eredményezheti a módosított szubsztrátfehérje térszerkezetének megváltozását. Ha a módosított szubsztrát szintén tartalmaz egy SIM területet, akkor a SUMO és a SIM közötti intramolekuláris kölcsönhatás térszerkezeti válozáshoz vezethet (2.37. ábra). A sumoilálás okozta konformációváltozásra jó példa a timin DNS glikoziláz (Geiss-Friedlander és Melchior, 2007).

Lássuk most, milyen fehérjéket módosít a SUMO a sejtben! A legtöbb ismert SUMO célpont magi fehérje, pl. transzkripciós faktorok (TF), koregulátorok vagy a kromatin szerveződésében, megkketőzésében és javításában résztvevő fehérjék. Ezek mellett találhatunk SUMO célfehérjéket a plazmamembránban, az endoplazmatikus retikulumban (ER) és a citoplazmában (2.38. ábra).

Egy sejt egyszerűsített barna árnyalatú rajza, benne a piros SUMO fehérje különböző feladatai helyén.

2.38. ábra Sumoilált fehérjék előfodulása a sejtben

RanGAP1 sumoilálása megváltoztatja a sejten belüli lokalizációját: az eredeti fehérje a citoplazmában helyezkedik el oldott állapotban, de a SUMO-1 konjugáció után a magpórus komplexumba kerül. A plazmamembránba lokalizált K+-ioncsatornák, a K2p1 és a Kv1.5 kevésbé aktívak a modifikációt követően. Az ionotróp glutaminsav receptor (GluR6) sumoilálása (ismeretlen mechanizmus szerint) elősegíti felvételét a sejtbe. A metabotróp glutaminsav receptor (mGluR8) is sumoilálódhat, de ennek nem ismerjük még a következményeit. Az ER-ben elhelyezkedő tirozin foszfatáz 1B-t (PTP1B) inaktiválja a SUMO kötődése. A SUMO a mitochondriumok dinamikájára is hat: a SUMO overexpressziója vagy a SUMO-specifikus izopeptidáz SENP5 aktivitásának csökkenése a mitochondriumok hasadásának növekedését eredményezi. Bár a dinamin-szerű DRP1 fehérje is sumoilálási célpont, egyelőre nem ismert, hogy ennek a módosítása is részt vesz-e a fenti folyamatban (Geiss-Friedlander és Melchior, 2007) (2.38. ábra).

Külön kiemeljük, hogy a p53 –Mdm2 rendszerben a SUMO-1 szabályozza az Mdm2 működését. A sumoiláció megakadályozza az Mdm2-t abban, hogy saját magát ubiquitinilálja, ezzel elősegíti a p53 ubiquitinilációját.

A Rub1/NEDD8
  • Rub1: related to ubiquitin

  • NEDD8: neuronal precursor cell-expressed developmentally downregulated protein 8 (egér)

  • 50%-os hasonlóság az ubiquitinnel

  • cullinhoz köt (SCF ubiquitin ligázban)

A Rub1/NEDD8 egy ubiquitin-szerű fehérje, melynek aminosav sorrendje 50%-ban hasonló az ubiquitinéhez. Egyetlen ismert funkciója, hogy az SCFSkp2 ubiquitin ligázt aktiválja azzal, hogy a ligáz cullin alegységéhez köt (2.39. ábra).

Egy többalegységes enzim szines térszerkezeti képlete.

2.39. ábra A Rub1/NEDD8-cal aktivált SCFSkp2 ubiquitin ligáz térszerkezete az alegységek kristályszerkezeteiből összeállítva (Schwartz és Hochstrasser, 2003). A NEDD8 fehérjét kötő lizin oldallánc világoskék.

A NEDD8 aktiváló enzimnek (E1NEDD8) két alegysége van: az UBA3 és a APPBP1. ATP jelenlétében a NEDD8 tioészter kialakításán keresztül aktiválódik és az UBC12-re kerül. Az UBC12 a NEDD8-at a cullin fehérje egyik lizin oldalláncára juttatja, mellyel izopeptid kötést alakít ki (2.40. ábra).

A NEDD8 az SCF ligáz cullin alegységére konjugálását mutató ábra, melyen az enzimek, alegységeik és a szubsztrát színes tömbökként vannak ábrázolva.

2.40. ábra A Rub1/NEDD8 konjugálása az SCF ligáz cullin alegységére

Feltéve, hogy lehetséges egy E1 enzimhez specifikus inhibitort kifejleszteni, felmerül a kérdés, hogy mi lehet a sejtbiológiai következménye egy ilyen gátlásnak. Emlős sejtvonalakon végzett korábbi kutatások kimutatták, hogy az ubiquitin aktiváló enzim (E1Ub) hőérzékeny mutációi késői S fázisban és G2-ben megállítják a sejtciklust. Ez azt mutatja, hogy az E1Ub szükséges a sejtosztódáshoz. Ehhez hasonlóan az E1NEDD8 mutációi hatékonyan blokkolják a sejtosztódást Caenorhabditis elegans-ban, továbbá mind az UBC12, mind az UBC9 szükséges a fejlődéshez emlősökben. Ezért elviekben az ilyen E1 inhibitorok sejtciklus leállást idéznének elő és használhatók lennének hiperproliferációs rendellenességek, mint például a rák gyógyításában.

Mindemellett valószínű, hogy sokféle útvonalat érintene az E1 enzimek gátlása és ezek közül több elengedhetetlen a normális sejtműködéshez. Egy lehetséges előnye az E1NEDD8 gátlásának az E1Ub helyett, az hogy ennek csak a cullint tartalmazó ubiquitin ligázok aktiválása az egyetlen ismert funkciója. Így az E1NEDD8 gátlása remélhetőleg nem érint sok száz más ubiquitinilációs reakciót, melyek nem cullin függőek (Nalepa és mtsai., 2006).

Ellenőrző kérdések

  1. Mik az ubiquitin fehérje legfontosabb jellemzői?

  2. Hányféle gén és hogyan kódolja az ubiquitin fehérjét?

  3. Mi a mono- és multiubiquitiniláció és mit jelent a sejtben?

  4. Mik a multiubiquitiniláció egy ciklusának elemi lépései?

  5. Mi az N-vég szabály?

  6. Milyen E3-as enzimtípusokat ismer? Keressen példákat rájuk!

  7. Milyen alegységei lehetnek egy RING-finger típusú E3-as enzimnek és mi a feladata ezeknek?

  8. Milyen feladatai vannak a deubiquitiniláló enzimeknek?

  9. Miben hasonlítanak az ubiquitinre az ubiquitin-szerű fehérjék és miben nem?

  10. Mik a SUMO feladatai egy sejtben?

  11. Hogyan aktiválódik és mi a feladata a Rub1/Nedd8 fehérjének?

Irodalom

Ciechanover, A., Heller, H., Elias, S., Haas, A. L. és Hershko, A. (1980) ATP-dependent conjugation of reticulocyte proteins with the polypeptide required for protein degradation. Proc Natl Acad Sci U S A77, 1365-8.

Ciechanover, A., Hod, Y. és Hershko, A. (1978) A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochem Biophys Res Commun81, 1100-5.

Clague, M. J. és Urbe, S. (2006) Endocytosis: the DUB version. Trends Cell Biol16, 551-9.

Clague, M. J. és Urbe, S. (2010) Ubiquitin: same molecule, different degradation pathways. Cell 143, 682-5.

Etlinger, J. D. és Goldberg, A. L. (1977) A soluble ATP-dependent proteolytic system responsible for the degradation of abnormal proteins in reticulocytes. Proc Natl Acad Sci U S A74, 54-8.

Finley, D. (2009) Recognition and processing of ubiquitin-protein conjugates by the proteasome. Annu Rev Biochem78, 477-513.

Geiss-Friedlander, R. és Melchior, F. (2007) Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol8, 947-56.

Hershko, A., Ciechanover, A., Heller, H., Haas, A. L. és Rose, I. A. (1980) Proposed role of ATP in protein breakdown: conjugation of protein with multiple chains of the polypeptide of ATP-dependent proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A77, 1783-6.

Jackson, P. K., Eldridge, A. G., Freed, E., Furstenthal, L., Hsu, J. Y., Kaiser, B. K. és Reimann, J. D. (2000) The lore of the RINGs: substrate recognition and catalysis by ubiquitin ligases. Trends Cell Biol 10, 429-39.

Jentsch, S. és Pyrowolakis, G. (2000) Ubiquitin and its kin: how close are the family ties? Trends Cell Biol.10, 335-342.

Kirkin, V., McEwan, D. G., Novak, I. és Dikic, I. (2009) A role for ubiquitin in selective autophagy. Mol Cell34, 259-69.

Kirkpatrick, D. S., Denison, C. és Gygi, S. P. (2005) Weighing in on ubiquitin: the expanding role of mass-spectrometry-based proteomics. Nat Cell Biol 7, 750-7.

Komander, D., Clague, M. J. és Urbe, S. (2009) Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol10, 550-63.

Mukhopadhyay, D. és Dasso, M. (2007) Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends Biochem Sci32, 286-95.

Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G. és Jentsch, S. (2001) SUMO, ubiquitin's mysterious cousin. Nat Rev Mol Cell Biol2, 202-10.

Nalepa, G., Rolfe, M. és Harper, J. W. (2006) Drug discovery in the ubiquitin-proteasome system. Nat Rev Drug Discov5, 596-613.

Pankiv, S., Clausen, T. H., Lamark, T., Brech, A., Bruun, J. A., Outzen, H., Overvatn, A., Bjorkoy, G. és Johansen, T. (2007) p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy. J Biol Chem282, 24131-45.

Petroski, M. D. és Deshaies, R. J. (2005) Function and regulation of cullin-RING ubiquitin ligases. Nat Rev Mol Cell Biol6, 9-20.

Ravid, T. és Hochstrasser, M. (2008) Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 679-90.

Rotin, D. és Kumar, S. (2009) Physiological functions of the HECT family of ubiquitin ligases. Nat Rev Mol Cell Biol 10, 398-409.

Schwartz, D. C. és Hochstrasser, M. (2003) A superfamily of protein tags: ubiquitin, SUMO and related modifiers. Trends Biochem Sci 28, 321-8.

Simpson, M. V. (1953) The release of labeled amino acids from the proteins of rat liver slices. J. Biol. Chem. 201, 143-154.

Varshavsky, A. (1996) The N-end rule: functions, mysteries, uses. Proc Natl Acad Sci U S A93, 12142-9.

Varshavsky, A. (2003) The N-end rule and regulation of apoptosis. Nat Cell Biol5, 373-6.

Welchman, R. L., Gordon, C. és Mayer, R. J. (2005) Ubiquitin and ubiquitin-like proteins as multifunctional signals. Nat Rev Mol Cell Biol6, 599-609.

Wilkinson, K. D., Urban, M. K. és Haas, A. L. (1980) Ubiquitin is the ATP-dependent proteolysis factor I of rabbit reticulocytes. J Biol Chem255, 7529-32.

Wu, G., Xu, G., Schulman, B. A., Jeffrey, P. D., Harper, J. W. és Pavletich, N. P. (2003) Structure of a β-TrCP1-Skp1-β-catenin complex: destruction motif binding and lysine specificity of the SCF(β-TrCP1) ubiquitin ligase. Mol Cell 11, 1445-56.